检测代谢物标志物在制备多发性骨髓瘤诊断工具中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及生物技术、疾病诊断、新药或新疗法在多发性骨髓瘤患者中的安全性有效性评价。更具体地说，本发明涉及一种检测代谢物标志物在制备多发性骨髓瘤诊断工具中的应用。
背景技术：
：多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是由骨髓中浆细胞异常增殖引起的血液系统恶性肿瘤，是临床第二大常见的血液系统恶性肿瘤，发病原因不明，临床表现主要有贫血、高钙血症、肾功能不全、反复感染、以及溶骨性损伤等。多发性骨髓瘤约占血液系统肿瘤的10％，占所有恶性肿瘤的0.8％，发病年龄约为60岁，中位生存期3～5年，男女比例为1.6:1，我国发病率约为1/10万，低于西方国家的4/10万，既往化疗有效率为40～60％，完全缓解率<5％。随着研究的深入，多发性骨髓瘤药物治疗的总体有效率、缓解率及无病生存率有较大幅度提高，中位生存期延长为5～7年，不少患者可生存10年以上。近年来多发性骨髓瘤的发病率呈上升趋势，发病年龄也日益下降。多发性骨髓瘤起病徐缓，早期无明显症状，其临床表现多样，常会造成误诊和漏诊，最终导致病情延误。多发性骨髓瘤的诊断一般需要进行骨髓活检、影像学检查和血液检查等，并结合临床表现来进行鉴别诊断。针对多发性骨髓瘤修订的国际分期系统(r-iss)纳入了血浆生物标志物(乳酸脱氢酶、β2-微球蛋白和白蛋白)和已知预后意义的细胞遗传学异常来预测疾病行为，但不同患者异质性比较大。造血干细胞移植是治疗多发性骨髓瘤最有效的方法，由于受骨髓来源、hla配型以及高医疗费用等因素的影响，限制了其在临床上的应用，化疗仍然是主要的治疗策略，但随着药物治疗的进程患者容易产生耐药和不耐受等现象。这些诊断方面存在的问题，急需我们寻找一种简便无创、灵敏快速、特异性强的检测方法。血液检查因其操作简单、相对无创的特点成为较为理想的检测方法，而灵敏快速筛选特异的血液生物标记物则成为多发性骨髓瘤临床诊断、分期和疗效评价的关键。随着分子生物学和生物信息学技术的发展，精准医学模式的倡导为多发性骨髓瘤的诊断和治疗打开了崭新的思路。精准医学是基于分子生物信息学的医学模式，其关键是利用有效的生物标志物，进行特异性个体化治疗。代谢组学(metabolomics)是一门研究生物体内源性代谢物质的种类、数量及其在内外因素作用下变化规律的学科，是生物信息学的重要组成部分。代谢组学从机体的动态代谢途径寻找肿瘤等疾病特异性代谢产物，识别人体疾病代谢状态的差异，从而进行疾病诊断和分类。代谢产物是基因表达的终产物，分析生物代谢图谱型特征更能够揭示基因和表现型之间的关系，以达到监测和推断基因功能的目的，为进一步深入分析肿瘤生物机制提供可能。代谢组学分析技术以核磁共振波谱和色谱-质谱串联技术为主，色谱-质谱串联技术具有灵敏度高、选择性好、动态范围宽、信息丰富等优点，且可以对体液如血液和尿液进行快速、无侵入性的分析，已成为代谢组学研究的主要技术平台。现有专利201911178499.4公开了利用gc-ms技术筛选多发性骨髓瘤患者血液代谢标志物并应用于临床诊断，为多发性骨髓瘤的精准治疗提供了一定的基础。但因其检测技术及应用的局限性，在寻找更多的多发性骨髓瘤生物标志物并应用于临床诊断方面，有待进一步研究。最后，寻找多发性骨髓瘤新的有效的分子生物标志物和信号通路，进一步阐明多发性骨髓瘤的发生发展机制，对当今多发性骨髓瘤的个体化精准治疗具有重要的意义。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种检测代谢物标志物在制备多发性骨髓瘤诊断工具中的应用，其采用非入侵式且相对无创的检测方式，填补现有多发性骨髓瘤临床检测技术应用的空白，为多发性骨髓瘤患者个体化精准治疗奠定基础。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种检测血浆代谢物标志物在制备多发性骨髓瘤诊断工具中的应用，所述血浆代谢物标志物包括l-精氨酸、n-乙酰神经氨酸、dl-焦谷氨酸、l-苹果酸、l-乳酸、亚油基肉碱中的一种或多种。优选的是，与健康受试者相比，多发性骨髓瘤患者血浆代谢物标志物的一个或多个的水平存在显著差异。优选的是，多发性骨髓瘤患者的l-精氨酸、n-乙酰神经氨酸水平显著高于健康受试者，多发性骨髓瘤患者的dl-焦谷氨酸、l-苹果酸、l-乳酸、亚油基肉碱水平显著低于健康受试者。优选的是，所述诊断工具包括仪器平台、诊断试剂、试剂盒、芯片、试纸。优选的是，所述试剂盒包括能够与所述血浆代谢物标志物发生特异性结合的化合物，以及能够用于检测所述血浆代谢物标志物与所述化合物形成的复合物的试剂。优选的是，所述仪器平台包括：测量模块，用于测量待测血浆样品中血浆代谢物标志物的含量以及健康血浆样品中血浆代谢物标志物的含量；分析模块，比较待测血浆样品中血浆代谢物标志物的含量与健康血浆样品中血浆代谢物标志物的含量，根据比较结果判断待测血浆样本的来源受试者是否患有多发性骨髓瘤，若l-精氨酸或n-乙酰神经氨酸水平显著偏高，或dl-焦谷氨酸、l-苹果酸、l-乳酸、亚油基肉碱水平显著偏低，则待测血浆样本的来源受试者患有多发性骨髓瘤。优选的是，所述血浆样本的受试者为人。优选的是，所述测量模块基于超高效液相串联三重四级杆二级质谱技术实现，包括：色谱条件：色谱柱：hsst3(150×2.1mm,3.5μm)；流速：0.5ml/min；柱温：20℃；进样量：5μl；流动相：a为甲酸/水(1:1000,v/v)溶液，b为异丙醇/乙腈(2:7,v/v)溶液；洗脱梯度：0-4min，1-10％b；4-8min，10-50％b；8-15min，50-80％b；15-25min，80-100％b；25-27min，100％b；洗脱条件在2min后恢复到初始状态；质谱条件：正、负两种离子扫描，多反应监测数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500v；离子源温度：600℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：40psi。优选的是，所述的正、负两种离子扫描，一次进样分析所有代谢物和同位素。优选的是，所述血浆样品经过预处理：取50μl血浆样品于1.5ml离心管中，加入10μl浓度为400ng/ml的同位素混合溶液，涡旋10秒混匀；然后加入140μl冷甲醇，涡旋30s混匀，将样品置于-20℃孵育10min后，13800g4℃离心10min；收集含提取物和iss的上清液，用于代谢组学分析；同位素混合溶液包括：胸腺嘧啶-d4，缬氨酸-d8，苯丙氨酸-d8、17-羟基孕酮-d8，二十二碳六烯酸-d5，胆酸-d4，鹅去氧胆酸-d4和肝胆酸-d4。本发明至少包括以下有益效果：第一、本发明提供了多发性骨髓瘤特异性诊断标志物，该标志物来自于患者血液代谢物中的一种或多种的组合，包括l-精氨酸(l-arginine，hmdb0000517)、n-乙酰神经氨酸(n-acetylneuraminate，hmdb0000230)、dl-焦谷氨酸(dl-pyroglutamicacid，hmdb0000267)、l-苹果酸(l-malicacid，hmdb0000156)、l-乳酸(l-lacticacid，hmdb0000190)、亚油基肉碱(linoleylcarnitine，hmdb0006469)；可应用于多发性骨髓瘤疾病的临床诊断；本发明提供了多发性骨髓瘤特异性诊断的检测方法，包括uhplc-ms/ms技术和多元统计分析；第二、本发明(1)操作步骤简单；(2)样品前处理简单；(3)样品分析时间短；(4)所需要血浆用量少(<200μl)；(5)检测方法特异性强、灵敏度高；(6)新型生物标志物可用于多发性骨髓瘤的诊断，并为临床决策提供依据，同时为后续基础研究和临床研究提供一定基础；第三、本发明为全新的诊断多发性骨髓瘤的方法，与gc-ms相比，该方法操作简便，物质检测范围更广，灵敏度及重复性更好，且样本无需气化及衍生化，可在常温下进行检测，避免部分样品在气化过程可能出现的分解。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明多发性骨髓瘤代谢组学研究基本流程图。图2为本发明血浆样本pca模型得分图，显示hc(健康对照)和mm患者之间可以较好地区分；图3为本发明血浆样本opls-da模型得分图，显示hc(健康对照)和mm患者之间可以较好地区分；图4为本发明置换检验方法评估opls-da模型可靠性；图5为本发明roc曲线法评估l-精氨酸、n-乙酰神经氨酸、dl-焦谷氨酸、l-苹果酸、l-乳酸、亚油基肉碱作为一个代谢集对多发性骨髓瘤的诊断效果。图6为本发明hc(健康对照)与mm患者血浆生物标志物韦恩图；图7为本发明hc(健康对照)与mm患者血浆生物标志物roc曲线图及其浓度箱式图。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：多发性骨髓瘤患者和健康人之间差异代谢物的筛选一、对象和方法1、样本来源与参与者签订知情同意，并经首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会批准后，收集30例hc(健康对照)和100例mm患者的外周血样本。所有参与者均来自于首都医科大学附属北京朝阳医院，所有mm患者的诊断均采用imwg标准，所有mm患者均为化疗4个疗程以内的患者，并经过考察患者并未因疗程的不同而引起显著的代谢变化。hc的年龄、性别与mm患者相匹配，以排除性别、年龄导致的代谢差异。采血时间均为清晨空腹状态。所有样本均保存在-80℃待用。2、主要试剂标准品购自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)，caymanchemical(美国密歇根州安阿伯市)，bidepharm(中国上海)或steraloids(美国罗得岛州纽波特)；稳定同位素标记的内标(iss)购自cambridgeisotopelaboratories(美国马萨诸塞州剑桥市)，caymanchemical或steraloids；ms级乙腈和hplc级异丙醇购自fisherscientific(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)；hplc级甲酸购自tediaco.,ltd.(美国俄亥俄州费尔菲尔德)；去离子水由millipore公司的milli-q超纯水系统(美国马萨诸塞州贝德福德)制备。3、uhplc-ms/ms筛选血浆差异代谢物3.1样品制备样品预处理：取50μl血浆于1.5ml离心管中，加入10μliss混合溶液(400ng/ml)，涡旋10s混匀；然后加入140μl冷甲醇，涡旋30秒混匀，将样品置于-20℃孵育10min后，13800g离心10min(4℃)；收集含提取物和iss的上清液，用于代谢组学分析。3.2色谱/质谱条件使用sparkholland液相色谱系统(spark,荷兰)和api5500质谱仪(absciex,加拿大)结合电喷雾电离(esi)源进行靶向代谢组学分析。为了优化uhplc-ms/ms方法，对不同的色谱柱和洗脱梯度进行了优化，以获得更好的分离效率和灵敏度。液相色谱条件为：色谱柱：hsst3(150×2.1mm,3.5μm)；流速：0.5ml/min；柱温：20℃；进样量：5μl；流动相：a为甲酸/水(1:1000,v/v)溶液，b为异丙醇/乙腈(2:7,v/v)溶液；洗脱梯度：0-4min，1-10％b；4-8min，10-50％b；8-15min，50-80％b；15-25min，80-100％b；25-27min，100％b；洗脱条件在2min后恢复到初始状态。质谱条件为：使用正、负两种离子扫描，多反应监测数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500v；离子源温度：600℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：40psi。4、数据处理和统计分析使用multiquant3.2软件(absciex，美国)处理来自uhplc-ms/ms分析的原始数据文件。将标准品的所有峰面积除以其相应的is峰面积，然后将比率相对于实际浓度作图，以最小二乘法用1/x2加权因子构建校正曲线。根据分析物与相应is的峰面积比计算每种代谢物的相对浓度。根据校准曲线计算每种代谢物的绝对浓度。然后将数据导入simca14.1软件(umetricsab，于默奥，瑞典)进行正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonalprojectionstolatentstructures-discriminationanalysis，opls-da)，过滤与模型分类不相关的信号，获得opls-da模型，对模型的质量用交叉验证法进行检验，并结合交叉验证后获得的r2y和q2(y的可解释变量和模型的可预测变量)对模型有效性进行评估，r2y和q2越接近1模型质量越好，q2>0.5表明模型较好。对opls-da模型进行置换检验获得r2和q2进一步评估模型，q2<0表明模型较好。结合opls-da模型第一主成分的变量投影重要性指标(variableimportanceintheprojection，vip)和样本opls-da得分与代谢物丰度之间pearson相关性分析的p值，寻找代谢谱贡献较大(vip>1且p<0.05)的差异代谢物。然后利用在线分析工具metaboanalyst4.0(https://www.metaboanalyst.ca/)对代谢数据进行接受者操作特性(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线分析并计算auc值，auc>0.94表明模型具有很好的预测性能；进行studentt检验获得错误发现率(falsediscoveryrate，fdr)，筛选auc>0.94且fdr<0.05的代谢物。结合多变量和单变量分析结果筛选vip>1、p<0.05且auc>0.94、fdr<0.05的代谢物，并将其定义为候选生物标志物。二、结果uhplc-ms/ms在血浆样本中共检测到205个可注释的代谢物。采用simca软件进行pca分析获得pca模型，交叉验证法检验模型的质量获得r2x＝0.691,q2＝0.449(图2)，opls-da分析获得opls-da模型，交叉验证法检验模型的质量获得r2x＝0.484，r2y＝0.942，q2＝0.862(图3)，置换检验法检验模型的可靠性获得r2＝(0.0，0.496)，q2＝(0.0，-0.626)(图4)。roc曲线检验模型预测性能获得auc＝1(图5)。结合多变量和单变量分析结果，血浆样本中共筛选到6个生物标志物(vip>1、p<0.05且auc>0.94、fdr<0.05)(图6)，分别为(表1)。表1标志物vippaucfdrl-精氨酸2.45166.20e-370.98771.27e-34n-乙酰神经氨酸2.03371.96e-160.94225.75e-15dl-焦谷氨酸2.36317.07e-240.95127.25e-22l-苹果酸2.27741.22e-190.95524.98e-18l-乳酸2.50714.79e-200.94752.54e-18亚油基肉碱2.28314.96e-200.95082.54e-18外周血差异代谢物浓度检测结果显示mm患者外周血中l-精氨酸、n-乙酰神经氨酸的浓度显著高于hc，而dl-焦谷氨酸、l-苹果酸、l-乳酸、亚油基肉碱的浓度显著低于hc；roc曲线分析结果显示6个代谢物的auc值均大于0.94，能达到很好的诊断效果(图7)，因此，mm患者与hc的6个代谢物水平存在显著性差异。<实施例2>具体病例临床分析：(一)样本收集：收集6例hc(健康对照)和24例疑似mm患者的外周血样本。所有参与者均来自于首都医科大学附属北京朝阳医院。hc的年龄、性别与疑似mm患者相匹配，以排除性别、年龄导致的代谢差异。采血时间均为清晨空腹状态。收集被检者空腹血浆样本，-80℃冰箱贮藏，备用。所有疑似mm患者的诊断均采用下述临床诊断依据确诊。1.症状和体征mm患者最常见的症状和体征是与贫血、肾功能不全、感染或骨破坏相关的。如表2所示，常见有：(1)骨骼症状：骨痛，局部肿块，病理性骨折，可合并截瘫。(2)免疫力下降：反复细菌性肺炎和/或尿路感染，败血症；病毒感染以带状疱疹多见。(3)贫血：正细胞正色素性贫血；少数合并白细胞减少和/或血小板减少。(4)高钙血症：有呕吐、乏力、意识模糊、多尿或便秘等症状。(5)肾功能损害：轻链管型肾病是导致肾功能衰竭的最常见原因。(6)高粘滞综合征：可有头昏、眩晕、眼花、耳鸣，可突然发生意识障碍、手指麻木、冠状动脉供血不足、慢性心力衰竭等症状。此外，部分患者的m成分为冷球蛋白，引起微循环障碍，出现雷诺现象。(7)其他：有淀粉样变性病变者可表现为舌肥大，腮腺肿大，心脏扩大，腹泻或便秘，肝、脾肿大及外周神经病等；晚期患者还可有出血倾向。表22.辅助检查(1)血象：病期不同，贫血程度各异，血涂片中红细胞有缗钱现象；分类应注意有无浆细胞。血沉显著增快。(2)骨髓检查：骨髓中浆细胞>10％并有原浆或幼浆细胞,可见双核或多核浆细胞。(3)血浆蛋白电泳和免疫球蛋白测定：本病可见高球蛋白血症、电泳示球蛋白区呈窄底高峰的单株ig(即m蛋白)。免疫电泳可确定异常ig的种类和含量，如igg、iga、igm、igd、ige及轻链k或λ型。本病示某种ig呈单克隆性增高而其他ig合成受抑，水平低于正常。(4)x线检查：可见溶骨性改变，骨质缺损，如头颅骨可见典型圆型穿凿样溶骨改变；弥漫性骨质疏松；病理性骨折，多见于肋骨、腰椎等。3.诊断诊断标准(1)主要标准：①组织活检证明有浆细胞瘤或骨髓涂片检查：浆细胞>30％，常伴有形态改变。②单克隆免疫球蛋白(m蛋白)：igg>35g/l，iga>20g/l，igm>15g/l，igd>2g/l，ige>2g/l，尿中单克隆k或λ轻链>1g/24小时，并排除淀粉样变。(2)次要标准：①骨髓检查：浆细胞10％～30％。②单克隆免疫球蛋白或其片段的存在，但低于上述标准。③x线检查有溶骨性损害和(或)广泛骨质疏松。④正常免疫球蛋白量降低：igm<0.5g/l,iga<1.0g/l,igg<6.0g/l。(3)凡满足下列任一条件者可诊断为mm：主要标准第1项+第2项；或第1项主要标准+次要标准②③④中之一；或第2项主要标准+次要标准①③④中之一；或次要标准①②+次要标准③④中之一。最低诊断标准(符合下列二项)(1)骨髓恶性浆细胞≥10％或虽<10％但证实为克隆性和/或活检为浆细胞瘤且血清和/或尿出现单克隆m蛋白；如未检测出m蛋白，则需骨髓恶性浆细胞≥30％和/或活检为浆细胞瘤(2)骨髓瘤相关的器官功能损害(至少一项，详见表1)[其他类型的终末器官损害也偶可发生，并需要进行治疗。如证实这些脏器的损害与骨髓瘤相关则其也可用于骨髓瘤的诊断]3.有症状mm诊断标准：(1)符合mm的诊断标准。(2)出现任何roti。4.无症状mm诊断标准：(1)符合mm的诊断标准。(2)没有任何roti的症状与体征。(二)样本检测：1、仪器信息：sparkholland液相色谱系统(spark,荷兰)；api5500质谱仪(absciex,加拿大)。2、样本前处理：取50μl血浆于1.5ml离心管中，加入10μliss混合溶液(400ng/ml)，涡旋10s混匀；然后加入140μl冷甲醇，涡旋30秒混匀，将样品置于-20℃孵育10min后，13800g离心10min(4℃)；收集含提取物和iss的上清液，待检。3、仪器参数液相色谱条件：色谱柱：hsst3(150×2.1mm,3.5μm)；流速：0.5ml/min；柱温：20℃；进样量：5μl；流动相：a为甲酸/水(1:1000,v/v)溶液，b为异丙醇/乙腈(2:7,v/v)溶液；洗脱梯度：0-4min，1-10％b；4-8min，10-50％b；8-15min，50-80％b；15-25min，80-100％b；25-27min，100％b；洗脱条件在2min后恢复到初始状态。质谱条件：使用正、负两种离子扫描，多反应监测数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500v；离子源温度：600℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：40psi。(三)结果分析6例hc(健康对照)外周血样本，6个标志物标准浓度的平均值为l-精氨酸373.97ng/ml，n-乙酰神经氨酸26.99ng/ml，dl-焦谷氨酸14028.33ng/ml，l-苹果酸1823.50ng/ml，l-乳酸399000.00ng/ml，亚油基肉碱5.15ng/ml。采用本方法得到的24例疑似mm患者血浆检测结果以及临床诊断结果如表3所示，可以看出，本方法的准确率达到100％。表3这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。当前第1页12