一种纳米金修饰电极的制备方法及其在血红蛋白生物分子测定中的应用与流程

本发明属于生物分子检测传感器领域，涉及一种纳米金修饰电极的制备方法及其在血红蛋白生物分子测定中的应用。

背景技术：

纳米粒子具有量子尺寸效应和高比表面积的功能化，且具有异常的光学、电学、磁学和结构特性。将其结合到生物分子表面上时，产生的生物共轭物种由于尺寸依赖性和维度与生物大分子类似，很适合作为活性磁共振成像、药物释放/输运的大循环载体和组织工程的结构构架。同时又能用在分子识别和标记、dna传感器和生物芯片中。由于金纳米粒子良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、光学效应以及特殊的生物亲和效应，使它成为研究的热点。在生物分析中，金纳米粒子已被用于dna检测以及免疫检测等。同时，采用自组装技术，将不同尺寸的金纳米粒子以特定的方式组装到固体基质表面而制成的生物传感器应用潜力巨大。

血红蛋白(hb)是脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白，是血液中运输氧气的主要物质，在生物体内起到传输氧气、分解h2o2、传递电子等与氧和能量代谢有关的重要活动，在一切生命活动中起着关键作用。对血红蛋白的研究多集中在其结构、输氧功能及其与电极之间的电子转移过程和机理。人血清中血红蛋白含量的测定是临床检测的一个重要内容，正常人血清中血红蛋白的含量在100～200g/l范围之内。若血红蛋白的含量降低则有可能是各种原因造成的贫血，而其含量相对增多则主要是由于大量体液和血浆丢失所致，因此对血红蛋白含量的准确测定具有非常实际的意义。

有关血红蛋白的电化学工作多借助于媒介体或促进剂的作用实现其在电极上的催化反应。媒介体是修饰在电极上的某些电活性物质，多以染料分子为主，主要起到在电极与血红蛋白分子之间传递电子的作用。促进剂是一类非电活性有机物质，它本身在电极上并无反应，但可以吸附，它的存在起到加速hb在电极上交换电子的速度。

近年来，由于对生物体系的研究不断深人，蛋白质电化学得到了迅速的发展。蛋白质电化学的研究也引起了科学工作者的关注。对于分子量相对较小、分子结构较为简单的蛋白质，如细胞色素c、血红蛋白、肌红蛋白等，在电极上得到其电流响应变得简单。因此，电化学方法分析检测蛋白质已成为可能。但由于大多数蛋白质的分子结构庞大，电活性中心被包埋，且在常规电极上强烈吸附和变性，使其在普通电极上难以得到好的电化学响应。因此人们不断寻找电子媒介体及促进剂来获得氧化还原蛋白质的有效电化学响应。具有特殊结构的化学修饰电极能够加速蛋白质活性中心和电极表面间的电子传递反应，可以得到较好的电化学响应，以提高分析的选择性和灵敏度。

综上所述，本发明提供了一种新型纳米金修饰电极的制备方法，并将其应用于血红蛋白生物分子的测定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种纳米金修饰电极的制备方法。

具体包括以下步骤：

s1、对金电极进行预处理；

s2、将haucl4溶液加热至沸，在剧烈搅拌下迅速加入柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态下搅拌反应15min后关闭热源，继续搅拌至室温，得到亮红色纳米金溶液；

s3、将经过预处理的金电极用氮气吹干，滴上1％氨基乙硫醇溶液，使之均匀覆盖，置于35-50℃烘箱中10h，再用二次水冲洗，再将其置入所述纳米金溶液中浸泡，使其自然晾干，得到纳米金修饰电极。

进一步，所述步骤s1中，所述预处理方法具体为：将所述金电极先用金相砂纸抛光，再依次用1.0、0.3μm的al2o3浆抛光至镜面，移入超声水浴中清洗，最后依次用1∶1乙醇、1∶1hno3和蒸馏水超声清洗，之后置入0.5mol/lh2so4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0～-1.0v，反复扫描至得到稳定的循环伏安图为止。

进一步，所述步骤s2中，所述haucl4和所述柠檬酸钠的质量比为2∶7。

测试表明，随着电极修饰时间的增加，血红蛋白的峰电流逐渐增大，峰形也变得良好，但修饰时间达到12h的时候，峰电流达到一个稳定值，几乎不再升高。因为超过12h以后，裸金电极表面可形成稳定的单分子膜。若修饰时间太短，电极表面吸附的纳米金的量未达到饱和，电极不稳定；但若修饰时间太长，则可能因膜的致密性增加，反而使峰电流下降。因此，本发明优选12h为电极修饰时间。

进一步，所述步骤s3中，所述浸泡时间为11-12h，优选为12h。

本发明的另一目的是提供一种纳米金修饰电极在生物分子测定中的应用，具体为血红蛋白生物分子。

具体以0.2mol/l的naac-hac为缓冲溶液，调节溶液ph值为4.6，设定扫描速度为100mv/s，扫描范围1.0～-1.0v，进行循环伏安检测。

图1为血红蛋白在(a)金电极、(b)硫醇修饰电极以及(c)纳米金电极上的循环伏安曲线图。具体是将金电极、硫醇修饰电极及纳米金修饰电极置于1×10^-5mol/l的血红蛋白溶液(ph4.6)中进行循环伏安扫描。从图中可看出，血红蛋白在金电极上有一个很小的还原峰，氧化峰则不明显。在硫醇修饰电极上，电化学反应几乎被完全抑制，电荷不能通过金电极表面的硫醇层进行传输。而在纳米金修饰电极上，同样浓度的血红蛋白则有一对明显的氧化还原峰，对应于血红蛋白中血红素辅基fe³⁺/fe²⁺的氧化还原反应。相对裸电极，其峰电流明显增大，说明纳米金可以促进血红蛋白与电极间的电子传递过程，说明本发明制备的纳米金修饰电极测定血红蛋白的响应能力更强。

图2为血红蛋白在纳米金修饰电极上的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。从图中可看出，在血红蛋白浓度为5.0×10^-5～5.0×10^-3mol/l范围内，血红蛋白的氧化峰电流与浓度具有良好的线性关系。

综合上述，纳米金粒子具有良好的生物共容性，血红蛋白在纳米金上有很强的吸附作用，纳米金修饰电极对血红蛋白具有良好的催化作用和富集作用。血红蛋白在纳米金修饰电极表面能进行有效和稳定的直接电子转移，其循环伏安曲线表现出一对氧化还原峰，且电极稳定性好，因此纳米金粒子对血红蛋白具有较好的检测效果。

同时，纳米金粒子具有良好的生物共容性，不会破坏生物体内酶及蛋白质的活性，为神经递质的活体检测提供了新的途径。金纳米粒子通过硫醇修饰自组装后，将显著影响粒子的吸附速度和表面状态，使修饰电极具有更好的检测效果。

本发明利用溶胶法制备了金纳米粒子，并修饰在金电极表面制备成纳米金修饰电极，该电极可用于测定牛血红蛋白。纳米金修饰电极具有良好的生物共容性，且纳米金较大的比表面积增强了血红蛋白在电极表面的吸附，提高了血红蛋白的电化学响应，大幅提高其灵敏度，可用于特定生物传感器的制备。

本发明的有益效果是：

(1)本发明利用溶胶法制备了金纳米粒子，并将其制备成纳米金修饰电极，极大的提高了灵敏度和响应速度。

(2)本发明制备的纳米金修饰电极可应用于血红蛋白生物分子的检测，可用于生物医疗传感领域。

(3)本发明制备工艺简单，检测方法易于操作，实现了可控制地、可重复地、方便地加工纳米材料电极，有利于产业化。

附图说明

利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它附图。

图1是血红蛋白在(a)金电极、(b)硫醇修饰电极以及(c)纳米金电极上的循环伏安曲线图；

图2为血红蛋白在纳米金修饰电极上的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，结合以下具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1

一种纳米金修饰电极的制备：

s1、将金电极先用金相砂纸抛光，再依次用1.0、0.3μm的al2o3浆抛光至镜面，移入超声水浴中清洗，最后依次用1∶1乙醇、1∶1hno3和蒸馏水超声清洗，之后置入0.5mol/lh2so4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0～-1.0v，反复扫描至得到稳定的循环伏安图为止；

s2、将150ml0.01％(m/v)的haucl4溶液加热至沸，在剧烈搅拌下迅速加入5.25ml1％(m/v)的柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态下搅拌反应15min后关闭热源，继续搅拌至室温，得到亮红色纳米金溶液；

s3、将经过预处理的金电极用氮气吹干，滴上1％氨基乙硫醇溶液，使之均匀覆盖，置于35-50℃烘箱中10h，再用二次水冲洗，再将其置入所述纳米金溶液中浸泡12h，使其自然晾干，得到纳米金修饰电极。

实施例2

一种纳米金修饰电极的制备：

s1、将金电极先用金相砂纸抛光，再依次用1.0、0.3μm的al2o3浆抛光至镜面，移入超声水浴中清洗，最后依次用1∶1乙醇、1∶1hno3和蒸馏水超声清洗，之后置入0.5mol/lh2so4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0～-1.0v，反复扫描至得到稳定的循环伏安图为止；

s2、将150ml0.01％(m/v)的haucl4溶液加热至沸，在剧烈搅拌下迅速加入5.25ml1％(m/v)的柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态下搅拌反应15min后关闭热源，继续搅拌至室温，得到亮红色纳米金溶液；

s3、将经过预处理的金电极用氮气吹干，滴上1％氨基乙硫醇溶液，使之均匀覆盖，置于35-50℃烘箱中10h，再用二次水冲洗，再将其置入所述纳米金溶液中浸泡11h，使其自然晾干，得到纳米金修饰电极。

实施例3

一种纳米金修饰电极的制备：

s1、将金电极先用金相砂纸抛光，再依次用1.0、0.3μm的al2o3浆抛光至镜面，移入超声水浴中清洗，最后依次用1∶1乙醇、1∶1hno3和蒸馏水超声清洗，之后置入0.5mol/lh2so4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0～-1.0v，反复扫描至得到稳定的循环伏安图为止；

s2、将100ml0.01％(m/v)的haucl4溶液加热至沸，在剧烈搅拌下迅速加入3.50ml1％(m/v)的柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态下搅拌反应15min后关闭热源，继续搅拌至室温，得到亮红色纳米金溶液；

s3、将经过预处理的金电极用氮气吹干，滴上1％氨基乙硫醇溶液，使之均匀覆盖，置于35-50℃烘箱中10h，再用二次水冲洗，再将其置入所述纳米金溶液中浸泡12h，使其自然晾干，得到纳米金修饰电极。

实施例4

纳米金修饰电极的再生、重现性测试：

以0.2mol/l的naac-hac为缓冲液，调整其ph值为4.6，加入1×10^-5mol/l的血红蛋白并置入实施例1制备的纳米金修饰电极，在-0.2v～0.6v的电位范围内以100mv/s的扫描速度作循环伏安扫描。取实施例1制备的纳米金修饰电极，平行测定浓度为1×10^-5mol/l的血红蛋白平行测定8次，测得峰电流值的相对标准偏差(rsd)为3.7％，表明该修饰电极有很好的重现性。

将使用后的电极用水清洗后，置于ph为4.6的hac-naac缓冲溶液中，一周后其对血红蛋白响应的电流为开始的98.7％，表明该电极的稳定性较好。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经过适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。本发明中所未详细描述的技术细节，均可通过本领域中的任一现有技术实现。特别的，本发明中所有未详细描述的技术特点均可通过任一现有技术实现。