一种血浆中烟碱及其主要代谢物的手性分析方法与流程

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种血浆中烟碱及其主要代谢物的手性分析方法。

背景技术：

烟碱是烟草及烟草制品具有潜在致瘾性的决定性因素和主要药理活性物质，其在动物及人体内可以很快地代谢成各种产物，主要代谢产物有可替宁、降可替宁、可替宁氮氧化物等。烟碱、可替宁、降可替宁和可替宁氮氧化物都有两个对映异构体：s-烟碱、r-烟碱，s-可替宁、r-可替宁，s-降可替宁、r-降替宁和s-可替宁氮氧化物、r-可替宁氮氧化物。对映异构体虽然分子式相同，但结构不同，因此其代谢机理和生物活性一般具有较大的差异。生物样本中对映异构体的手性分析是研究目标物药理学及毒性等生理作用的关键，因此，建立血浆样本中烟碱及其代谢物的高通量、高灵敏度、高选择性的手性分离方法对烟碱的代谢、积累及吸烟与健康研究具有重要意义。

目前，烟碱及其代谢物的手性分离的方法主要有液相色谱(lc)法、液相色谱-质谱联用法(lc-ms/ms)、超临界流体色谱(sfc)法、气相色谱-质谱联用法(gc-ms)法、毛细管电泳(ce)法等，而液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)具有快速、灵敏、重现性好、通量高等优点，在生物碱手性分离方面有广阔的应用前景。但是，相关研究主要为烟草及烟草制品，极少涉及生物样品，且没有同时实现血浆样本中烟碱及其主要代谢物可替宁、降可替宁、可替宁氮氧化物等的手性分离(drugtest.anal.2017,9(6),944-948.talanta2018,181,132-141.heliyon.2019,5(5),e01719.)

技术实现要素：

本发明的目的正是基于上述技术不足，建立了一种血浆中烟碱及其主要代谢物的手性分析方法，该方法使用hplc-ms/ms技术，首次实现了血浆样本中烟碱、可替宁、降可替宁、可替宁氮氧化物的同时手性分离，具有通量高、分离度好、操作简便、灵敏度高、回收率及重复性好等优点，适合血浆样品中烟碱及其主要代谢物的手性分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种血浆中烟碱及其主要代谢物的手性分析方法，该方法包括如下步骤：

(1)取血浆，加入内标萃取溶液以沉淀蛋白，振荡，离心，得上清液；

(2)取步骤(1)得到的上清液进行高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)分析；

(3)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量。

优选地，在步骤(1)中，所述内标萃取溶液为各内标的甲醇溶液。

优选地，在步骤(1)中，所述内标萃取溶液浓度为20～50ng/ml。

优选地，在步骤(1)中，所述离心的温度为2～5℃。

优选地，在步骤(1)中，所述离心的速度为10000～15000rpm。

优选地，在步骤(2)中，所述高效液相色谱-串联质谱分析的色谱条件包括：色谱柱为chiralpakig-3色谱柱(250×4.6mm×3μm)联合保护柱(10mm×4.0mm×3μm)。

优选地，在步骤(2)中，所述高效液相色谱-串联质谱分析的色谱条件还包括：柱温为25℃；流动相为质量分数为0.2％的甲酸铵/甲醇溶液；流速为0.5ml/min；运行总时间为40min；进样体积为10μl。

优选地，在步骤(2)中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：esi(+)；检测模式：mrm模式；离子源温度(tem)：500℃；电喷雾电压(is)：5500v；碰撞气(cad)：4.8×10⁴pa；气帘气(cur)：2.4×10⁵pa；离子源气流(gs1)：3.4×10⁵pa；离子源气流(gs2)：4.1×10⁵pa；入口电压(ep)：10v；射出电压(cxp)：10v。

优选地，在步骤(2)中，目标化合物和内标的mrm质谱检测参数如下：

注：“*”表示定量离子。

优选地，在步骤(3)中，所述内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入同位素内标(烟碱-d3、可替宁-d3、可替宁氮氧化物-d3、降可替宁-d4)，以各标准工作溶液中目标物与内标的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(2)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量。

优选地，所述系列标准工作溶液中各目标物的浓度范围为0.5～250ng/ml，定量下限均为0.5ng/ml。

优选地，所述血浆为人体或动物(如大鼠、小鼠等)血浆。

优选地，所述主要烟碱代谢物为可替宁、可替宁氮氧化物和降可替宁。

优选地，在一个具体实施方案中，本发明提供一种血浆中烟碱及其主要代谢物的手性分析方法，该方法包括以下步骤：

(1)精密吸取50～200μl待测血浆样本于1.5ml离心管中，加入4～10倍体积内标萃取溶液以沉淀蛋白，涡旋振荡1～3min后，于2～5℃条件下以10000～15000rpm的速度离心5～10min，取上清液备用；

(2)取步骤(1)的上清液进行高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)分析，分析条件如下：

色谱条件：色谱柱为chiralpakig-3色谱柱(250×4.6mm×3μm)并加保护柱(10mm×4.0mm×3μm)，柱温为25℃；流动相为质量分数为0.2％的甲酸铵/甲醇溶液，流速为0.5ml/min，运行总时长为40min；进样体积10μl；

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：esi(+)；检测模式：mrm模式；离子源温度(tem)：500℃；电喷雾电压(is)：5500v；气帘气(cur)：2.4×10⁵pa；碰撞气(cad)：4.1×10⁴pa；离子源气流(gs1)：3.4×10⁵pa；离子源气流(gs2)：4.1×10⁵pa；入口电压(ep)：10v；射出电压(cxp)：10v；目标化合物和内标的mrm质谱检测参数如下：

注：“*”表示定量离子。

(3)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量，其中所述内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入内标(烟碱-d3、可替宁-d3、可替宁氮氧化物-d3、降可替宁-d4)，以各标准工作溶液中目标物与内标的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(2)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量。

与现有技术相比较，本发明至少具有以下有益的技术效果：

本发明基于hplc-ms/ms技术对色谱柱的选择、流动相组成和流动相流速进行了考察，建立了一种血样样品中烟碱及其主要代谢物的手性分析方法，该方法实现了烟碱及其主要代谢物的同时手性分析，具有通量高、分离度好、操作简便、灵敏度高、回收率及重复性好等优点，适合血浆样本中烟碱及其主要代谢物的手性分析。

附图说明

图1为选用不同色谱柱分离效果对比图(以烟碱和可替宁为例)，其中图1a和1b分别为nicoshell色谱柱分离烟碱和可替宁对映异构体的色谱图；图1c和1d分别为teicoshell色谱柱分离烟碱和可替宁对映异构体的色谱图；图1e和1f分别为chiralpakig-3手性色谱柱分离烟碱和可替宁对映异构体的色谱图；

图2为不同流动相组成分离效果色谱图，其中图2a为流动相水，图2b为含0.1％体积分数的甲酸/甲醇溶液；

图3为选用不同流速分离效果色谱图，图3a为0.8ml/min，图3b为0.3ml/min；

图4为标准工作溶液中目标物及其内标多反应监测(mrm)色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施的方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：一种血浆中烟碱及其主要代谢物的手性分析方法

(1)仪器与试剂

仪器：液相色谱-串联质谱仪(hplc-ms/ms)系统由美国agilent1200高效液相色谱仪(包括g1367d自动进样器、g1312b二元溶剂泵、g1316b柱温箱)及absciex5500三重四极杆质谱仪(配esi离子源)组成，数据采集与处理软件为analyst1.5.1software；小动物麻醉机(mss-100型)；3-18ks型台式高速冷冻离心机(德国sigma公司)；涡旋振荡器(vortexgenie2，美国scientificindustries公司)；电子天平(ae163，瑞士mettler公司，感量：0.0001g)。

试剂耗材：(r,s)-烟碱、s-烟碱、r-烟碱、(r,s)-可替宁、s-可替宁、r-可替宁、(r,s)-降可替宁、s-降可替宁、r-降可替宁、(r,s)-可替宁氮氧化物、s-可替宁氮氧化物、r-可替宁氮氧化物、烟碱-d3、可替宁-d3、可替宁氮氧化物-d3、降可替宁-d4均由trc购得，甲醇(duksan，色谱纯)，甲酸铵(acros，纯度大于99％)，所用超纯水由milli-q系统(milford，ma，usa)制得。

(2)仪器工作条件

色谱条件：色谱柱为chiralpakig-3色谱柱(250×4.6mm×3μm)并加保护柱(10mm×4.0mm×3μm)，柱温为25℃；流动相为质量分数为0.2％的甲酸铵/甲醇溶液，流速为0.5ml/min，运行总时长为40min；进样体积10μl；

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：esi(+)；检测模式：mrm模式；离子源温度(tem)：500℃；电喷雾电压(is)：5500v；气帘气(cur)：2.4×10⁵pa；碰撞气(cad)：4.1×10⁴pa；离子源气流(gs1)：3.4×10⁵pa；离子源气流(gs2)：4.1×10⁵pa；入口电压(ep)：10v；射出电压(cxp)：10v；目标化合物和内标的mrm质谱检测参数如下：

注：“*”表示定量离子。

(3)样品前处理

①、血浆样品的制备：取雄性sd大鼠，给药前禁食12h，自由饮水。以1.0mg/kg的剂量皮下注射给药(烟碱溶于生理盐水中，浓度为1.0mg/ml)，使用麻醉机以异氟烷麻醉后，于给药后60min从大鼠眼眶后静脉丛取血0.4ml，置于含有5μl肝素钠溶液(10g/l)的1.5mlep离心管中，充分摇匀，以4000r/min离心10min后，分离血浆，于-40℃保存。

②、血浆样品前处理：待测血浆样品于室温下自然解冻后，精密吸取100μl待测血浆样本于1.5ml离心管中，加入1ml含有内标的甲醇萃取溶液以沉淀蛋白，涡旋振荡2min后，于4℃条件下以12000rpm的速度离心5min，取上清液备用；

(4)标准工作溶液配制

①、内标储备液的配制：以甲醇溶解氘代内标并定容，制备浓度约为1.0mg/ml的一级内标储备液，再将一级内标储备液以甲醇稀释1000倍，得到浓度约为1000ng/ml的二级内标储备液。

②、内标萃取溶液的配制：将二级内标储备液以甲醇逐级稀释为浓度约为25ng/ml的内标萃取溶液。

③、标准储备液的配制：以甲醇溶解标准品并定容，制备浓度约为1.0mg/ml的一级标准储备液，再将一级标准储备液以甲醇稀释1000倍，得到浓度约为1000ng/ml的二级标准储备液。

④、标准工作溶液的配制：采用甲醇配制系列标准工作溶液，得到目标物浓度分别为0.50、1.00、2.50、5.00、20.0、50.0、100、250ng/ml的工作溶液，内标浓度均为20ng/ml，其中，(r,s)-烟碱-d3中的s-烟碱-d3作为s-烟碱、r-烟碱的内标，(r,s)-可替宁-d3中的r-可替宁-d3作为s-可替宁、r-可替宁的内标，(r,s)-降可替宁-d4中的s-降可替宁-d4作为s-降可替宁、r-降可替宁的内标，(r,s)-可替宁氮氧化物-d3中的s-可替宁氮氧化物-d3作为s-可替宁氮氧化物、r-可替宁氮氧化物的内标。

(5)样品测定

将步骤(4)所得标准工作溶液和步骤(3)所得样品溶液分别进行hplc-ms/ms分析，标准工作溶液中目标物及其内标多反应监测(mrm)色谱图如图4所示。以各标准工作溶液中目标物与内标的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(3)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量。

(6)方法验证

根据最低级标准工作溶液，按照3倍信噪比计算该方法的检出限，按照2.50(低)、10.00(中)、40.00ng/ml(高)3种浓度水平计算基质效应及准确度，每个水平添加5个平行样品，根据平行测试结果计算测试精密度。该方法的线性范围、线性系数、定量下限、基质效应、平均准确度、平均精密度如表1所示。

表1各目标物线性范围、线性系数、定量下限、准确度及平均精密度^①

(7)实际样品分析

根据上述测定方法，典型大鼠血浆样本中烟碱及其代谢物手性分析结果如表2所示(单位：ng/ml)：

表2典型大鼠血浆样本中烟碱及其代谢物手性分析结果

注：1号样品为以1.0mg/kg的剂量皮下注射给药“s-烟碱”的大鼠血浆，2号样品为以1.0mg/kg的剂量皮下注射给药“(r,s)-烟碱”的大鼠血浆。

实施例2：不同沉淀剂的实验

hplc-ms/ms测定生物样品中烟碱及其代谢物的样品前处理方法主要有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法等，其中，液液萃取法对目标物的回收率往往偏低，而固相萃取法较为耗时耗力，不适用于大批量样品分析，所以，本研究采用蛋白沉淀法对大鼠血浆样本进行前处理，其优点是省时省力，适合大批量样品分析。

本实施例分别采用乙腈、甲醇作为沉淀剂，具体实验过程如实施例1所示，结果发现，二者沉淀蛋白的效果差别不大，目标物都不存在基质干扰现象。但乙腈会影响目标物的手性分离效果，而甲醇对目标物的手性分离效果较为理想。

故选用甲醇作为蛋白沉淀剂。

实施例3色谱柱的选择实验

选择了azyp公司的nicoshell(100mm×4.6mm×2.7μm)和teicoshell(150mm×4.6mm×2.7μm)，以及大赛璐公司的chiralpakig-3手性色谱柱(250mm×4.6mm×3μm)为研究对象。具体实验过程如实施例1所示。

研究发现：

①、nicoshell能实现烟碱对映异构体基线分离(分离度r＝2.22，示于图1a)，但是对可替宁对映异构体的分离效果较差(分离度r＝0.88，示于图1b)。

②、烟碱对映异构体在teicoshell色谱柱上无保留，示于图1c，且可替宁对映异构体的分离效果不理想(分离度r＝0.56，示于图1d)，通过优化色谱条件也并没有明显改善分离效果。

③、chiralpakig-3手性色谱柱取得了较理想的效果，烟碱对映异构体基本能够实现完全分离(示于图1e)，可替宁(示于图1f)、降可替宁、可替宁氮氧化物对映异构体也能够实现完全分离。

故最终确定的手性分析柱为chiralpakig-3手性色谱柱。

实施例4：流动相的选择实验

选择以下几种流动相进行研究：水、乙腈、含0.1％体积分数的甲酸/甲醇溶液、含0.2％质量分数的乙酸铵/甲醇溶液、含0.2％质量分数的甲酸铵/甲醇溶液。除流动相外，其余方法参照实施例1。

结果发现：

①、流动相中使用水(以烟碱为例，示于图2a)或乙腈等溶剂，目标物的峰型较差且不能实现烟碱和可替宁氮氧化物的手性分离。

②、流动相甲醇中添加甲酸(含0.1％体积分数的甲酸/甲醇溶液，以烟碱为例，示于图2b)或乙酸铵(含0.2％质量分数的乙酸铵/甲醇溶液)，会影响目标物的手性分离效果，不能实现对烟碱和可替宁氮氧化物的手性基线分离。

③、含0.2％质量分数的甲酸铵/甲醇溶液，取得了较为理想的效果。

故最终确定的流动相组成为含0.2％质量分数的甲酸铵/甲醇溶液。

实施例5：流动相流速的选择实验

为了考察流动相流速对检测结果的影响，对流动相流速进行了考察。流动相的流速设置为0.3ml/min；0.5ml/min；0.8ml/min。除流动相的流速外，其余方法参照实施例1。

研究发现：

①、0.8ml/min高流速实验条件下，不能实现烟碱、可替宁氮氧化物的手性基线分离(以烟碱为例，示于图3)。

②、0.3ml/min低流速实验条件下，可以实现目标化合物的手性基线分离，但目标物峰型较宽且系统分析时间较长。

③、0.5ml/min的流速下，兼顾了分离度、峰型及分析时间。

故最终确定了流动相流速为0.5ml/min。