养阴清肺的中药组合物的检测方法与流程

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种养阴清肺的中药组合物的检测方法。

背景技术：

养阴清肺组合物由地黄、玄参、白芍、牡丹皮、麦冬、川贝母、薄荷、甘草组成，具有养阴清肺利咽的作用，包括养阴清肺膏及养阴清肺合剂。

养阴清肺膏具有养阴润燥，清肺利咽之功效,主治阴虚肺燥，咽喉干痛，干咳少痰或痰中带血。由地黄、玄参、白芍、牡丹皮、麦冬、川贝母、薄荷、甘草八味药组成。目前养阴清肺膏生产厂家有20家，该品种收载于2015年版《中国药典》一部，只有性状、鉴别、检查项目以及微生物限度检验项目，但尚未有含量测定指标，质量标准可控性过低，难以监控产品内在质量，质量控制方法有待提高。

已有的文献对养阴清肺膏含量测定方法记载较少，而且均是对该品种进行单一成分的测定，如沈艺等《hplc法测定养阴清肺膏中芍药苷的含量》，陈华国等《hplc测定养阴清肺膏中梓醇的含量》，王晓敏等《薄层扫描法测定养阴清肺膏中丹皮酚的含量》。然而中药药效的产生是多种有效成分共同作用的结果，因此质量控制也应选择多个有效成分作为检测指标，养阴清肺膏有效成分较为复杂，单一成分作为指标测定并不能表达制剂的整体质量水平，因此对处方中多个成分的含量测定显得尤为重要。

养阴清肺合剂具有养阴润肺，清热利咽的作用，用于咽喉干燥疼痛，干咳、少痰或无痰。标准收载于《中华人民共和国卫生部颁标准》中药成方制剂第二十册ws3-b-3896-98，只有性状、鉴别、检查项目以及微生物限度检验项目，未有含量测定指标，产品质量监控方法较低，现有的文献含量测定方法仅有方文清《tlc法和hplc法对养阴清肺合剂的质量控制》，而且文中仅对单一成分梓醇进行含量测定，而文献《theeffectsofrehmanniaglutinosapolysaccharideonimmunefunctionofmice》指出梓醇为环烯醚萜苷类化合物，其化学性质活泼，易被水解和氧化，导致梓醇大幅降低，稳定性差，故对方中其它多个有效成分的测定显得更为科学、合理。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的是提供一种养阴清肺的中药组合物中多种成分含量测定方法，其专属性强，分离效果好，能够有效保证产品质量的稳定性和可控性。

具体技术方案如下：

一种养阴清肺的中药组合物的检测方法，所述养阴清肺的中药组合物的活性成分由地黄、玄参、白芍、牡丹皮、麦冬、川贝母、薄荷和甘草制备而成，所述检测方法包括以下步骤：

对照品溶液的制备：取芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚作为对照品，用溶剂溶解；

供试品溶液的制备：取待测样品，用提取溶剂提取，将提取液滤过，取续滤液作为供试品溶液；

将所述对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪进行测定；

所述液相色谱仪的流动相a为水、0.005mol/l～0.04mol/l磷酸二氢钠水溶液或0.005mol/l～0.04mol/l磷酸二氢钾水溶液，流动相b为乙腈。

在其中一些实施例中，所述流动相a为水、0.008mol/l～0.015mol/l磷酸二氢钠水溶液或0.008mol/l～0.015mol/l磷酸二氢钾水溶液。其中，控制流动相a为浓度为0.008mol/l～0.015mol/l的磷酸二氢钠水溶液，相比水和磷酸二氢钾水溶液或其他浓度磷酸二氢钠水溶液，其在相同流速的情况下，利于对杂质干扰大的样品进行分析，针对含杂质较多的养阴清肺的中药组合物可以得到更好的图谱，对于目标峰的出峰时间更合适，不会太晚或太早导致跟杂质峰重叠。

在其中一些实施例中，所述提取溶剂为甲醇、乙醇或乙醇水溶液。

在其中一些优选的实施例中，所述提取溶剂为乙醇，其色谱峰杂质更少，杂质的干扰少，并且丹皮酚的提取含量更高。

在其中一些实施例中，所述溶剂为乙醇。

在其中一些实施例中，所述液相色谱仪为梯度洗脱，梯度洗脱程序为：

0～59min，流动相a(96±3)％→(60±3)％，流动相b(4±3)％→(40±3)％；

59～65min，流动相a(60±3)％→(96±3)％，流动相b(40±3)％→(4±3)％。针对本发明的养阴清肺的中药组合物，采用该洗脱程序，并配合合适的流动相，分离效果好，所消耗的洗脱时间短，效率高，节省了试剂成本和时间成本。

在其中一些实施例中，所述梯度洗脱程序为：

0～64min，流动相a(93±3)％→(55±3)％，流动相b(7±3)％→(45±3)％；

64～68min，流动相a(55±3)％→(93±3)％，流动相b(45±3)％→(7±3)％。

在其中一些实施例中，所述梯度洗脱程序为：

0～68min，流动相a(93±3)％→(57±3)％，流动相b(7±3)％→(43±3)％；

68～75min，流动相a(57±3)％→(93±3)％，流动相b(43±3)％→(7±3)％。

在其中一些实施例中，采用双波长检测，双波长为：232±5nm和275±5nm。采用双波长检测更能精准地体现目标成分在制剂中的含量。

在其中一些实施例中，所述液相色谱仪的色谱条件包括：

色谱柱：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的尺寸为：直径4.6±0.2mm×长度250±5mm，粒径5±0.2μm；

柱温：25～40℃；

流速：0.6～1.0ml/min；

进样量：10～20μl；

理论塔板数按芍药苷峰计算，应不低于3000。

在其中一些实施例中，所述提取的方式为超声提取或加热回流提取，优选为超声提取，芍药苷、哈巴俄苷及丹皮酚提取量高，提取效率高。

在其中一些实施例中，所述超声提取的功率为250±50w，频率为33±3khz。

在其中一些实施例中，所述高效液相色谱仪是waterse2695型高效液相色谱仪。

在其中一些实施例中，所述色谱柱为pntulipsrszg-c18。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明建立了养阴清肺中药组合物中多种成分同时测定的方法，通过控制流动相a为水、0.005mol/l～0.04mol/l磷酸二氢钠水溶液或0.005mol/l～0.04mol/l磷酸二氢钾水溶液，流动相b为乙腈，并配合特定的供试品溶液制备方法等其他检测条件，最终实现了专属性强、分离效果好的检测效果，并且准确性、重现性和稳定性均能达到科研和生产的要求，能够有效保证产品质量的稳定性和可控性。

附图说明

图1为混合对照品溶液hplc图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图2为养阴清肺膏样品溶液hplc图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图3为缺玄参阴样品溶液hplc图谱(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图4缺白芍、牡丹皮阴性样品溶液hplc图谱(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图5为混合对照品溶液hplc图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图6为50％乙醇提取的hplc图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图7为70％乙醇提取的hplc图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图8为甲醇提取的hplc图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图9为乙醇提取的hplc图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图10为梯度5(流动相a为0.01mol/l磷酸二氢钾水溶液)的对照品色谱图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷、3为丹皮酚)；

图11为梯度5(流动相a为0.01mol/l磷酸二氢钾水溶液)的样品色谱图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷3为丹皮酚)；

图12为梯度6(流动相a为0.04mol/l磷酸二氢钠水溶液)的对照品色谱图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷3为丹皮酚)；

图13为梯度6(流动相a为0.04mol/l磷酸二氢钠水溶液)的样品色谱图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷3为丹皮酚)；

图14为梯度7(流动相a为0.005mol/l磷酸二氢钠水溶液)的对照品色谱图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷3为丹皮酚)；

图15为梯度7(流动相a为0.005mol/l磷酸二氢钠水溶液)的样品色谱图(其中1为芍药苷、2为哈巴俄苷3为丹皮酚)。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1养阴清肺膏的色谱条件选择及方法学验证

一、仪器与试药

1.仪器：

e2695型高效液相色谱仪及2489型紫外检测器(美国waters公司)，ae200型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，kq-300da型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2.试药：

哈巴俄苷(批号：111730-201709，纯度为95.9％)、芍药苷(批号：110736-201842，纯度为97.4％)、丹皮酚(批号：110708-201407，纯度为99.9％)均来源自中国食品药品检定研究院；养阴清肺膏阴性样品；养阴清肺膏批号分别为u05001、u05002、u05003(来源自广州白云山潘高寿药业股份有限公司)；水为纯化水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

二、供试品制备方法考察

1.供试品制备不同提取方式的考察

对比实验研究中，考察了超声提取和回流提取方式，以所制得供试品溶液中芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚的含量作为评价指标。具体做法为：

(1)超声提取：取养阴清肺膏1g，精密称定，置20ml容量瓶中，精密加入乙醇15ml，超声提取30min，加入乙醇定容至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

(2)回流提取：取养阴清肺膏1g，精密称定，加入乙醇20ml，称定重量，回流提取30min，放冷，补重，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

结果见表1。结果表明，超声提取样1的芍药苷、哈巴俄苷及丹皮酚含量比加热回流效果含量高，故选择超声进行提取。

表1不同提取方式考察结果

2.供试品制备不同提取溶剂的考察

对比实验研究中，考察了甲醇、50v/v％乙醇水溶液、70v/v％乙醇水溶液、乙醇作为提取溶剂进行提取，以所制得供试品溶液中芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚的含量作为评价指标。具体做法为：

取养阴清肺膏1g，四份，精密称定，分别置20ml容量瓶中，第一份精密加入甲醇15ml，第二份精密加入50％乙醇水溶液15ml，第三份精密加入70％乙醇水溶液15ml，第四份精密加入乙醇15ml，四份同时超声处理30分钟，分别加相应不同的溶剂定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定，结果见表2。结果表明，甲醇提取成份含量较其它三种溶剂低，且较多杂质峰。此外，50％乙醇及70％乙醇提取芍药苷和哈巴俄苷的效果比乙醇提取的效果稍差，但乙醇提取的丹皮酚效果要优于50％乙醇及70％乙醇提取，而且色谱图显示提取杂质较小。例如从图6～9可知；图6的50％乙醇提取图谱中有34个峰；图7的70％乙醇提取图谱中有29个峰；图8的甲醇提取图谱中有33个峰；图9的乙醇提取图谱中只有26个峰，且三种有效成分能很好地提取出来，故选择乙醇进行提取。

表2不同提取溶剂的考察结果

三、色谱条件的考察

1、柱温的考察

对比实验筛选最佳柱温，采用不同的柱温进行实验研究，结果见表3：

由表3可知：柱温为20℃时，分离度稍差；柱温为45℃时，分离度也较差；而柱温为25℃～35℃时，分离度良好，因此柱温选择25℃～35℃。

表3不同柱温考察结果

2.流速的考察

采用不同的流速进行对比实验，结果见表4。

表4不同流速考察结果

由表4可知：流动相流速为0.6～1.0ml/min，效果最好。

3.流动相的考察

为寻找最佳流动相，采用不同流动相不同梯度比例进行检测，不同流动相梯度表如下：

流动相梯度表1

流动相梯度表2

流动相梯度表3

流动相梯度表4

流动相梯度表5

流动相梯度表6

流动相梯度表7

结果显示流动相梯度表1至表7均能对各成分进行分离，但相比之下，发明人发现表1、4、5对各成分分离效果较好，且时间较短，可有效测定芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚的含量，尤其是发明人在研究中发现流动相梯度表4，对于含有杂质较多的养阴清肺的中药组合物的分离效果更好，对于目标峰的出峰时间更合适，不会太晚或太早出峰导致跟杂质峰重叠。而流动相梯度表6和图12～13中，当流动相a为0.04mol/l磷酸二氢钠水溶液时，出峰时间较晚。流动相梯度表7和图14～15中，当流动相a为0.005mol/l磷酸二氢钠水溶液时，出峰时间较快，对于杂质干扰大的样品不能很好地测定。

四、方法学验证

1.色谱条件

色谱柱pntulipsrszg-c18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.01mol/l磷酸二氢钠水溶液(a)-乙腈(b)梯度洗脱(0～59min，96％～60％a；59～65min，60％～96％a)；流速0.7ml·min^-1；检测波长0～35min为232nm，35～65min为275nm；柱温35℃，进样量10μl。理论塔板数按芍药苷峰计算，应不低于3000。

2.对照品溶液的制备

取芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加乙醇分别制成芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚浓度为15.000，2.980，2.852mg·l^-1的混合对照品溶液。

3.供试品溶液的制备

取样品约1g，精密称定，置20ml容量瓶中，精密加入乙醇15ml，超声处理(250w，33khz)30分钟后，加乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.阴性样品溶液的制备

分别取缺白芍、牡丹皮阴性样品和缺玄参阴性样品约1g，精密称定，按供试品制备方法制备缺白芍、牡丹皮阴性样品溶液及缺玄参阴性样品溶液。

5.专属性考察

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μl进样分析，记录色谱峰，结果见图1～4。结果样品峰与杂质峰分离良好，阴性对照无干扰。

6.线性关系的考察

精密吸取含芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚的浓度分别为15.000，2.980，2.852mg·l^-1的混合对照品溶液。分别吸取8，10，15，20，30，40μl分别注入液相色谱仪，按“1”项下色谱条件测定，以峰面积(y)为纵坐标，进样量为(x，μg)为横坐标，绘制标准曲线，芍药苷回归方程为y＝132.3977x-1102.6122，r＝0.9999；哈巴俄苷回归方程为y＝1403.1981x-321.7043，r＝1.0000；丹皮酚回归方程为y＝1962.2090x-2448.1807，r＝1.0000。结果表明，芍药苷在0.1200～0.7500μg线性关系良好，哈巴俄苷在0.02384～0.1490μg线性关系良好，丹皮酚在0.02282～0.14260μg线性关系良好。

7.精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μl，连续重复进样测定6次，测定峰面积，结果rsd分别为1.7％、0.84％、1.1％。结果表明，仪器精密度良好。

8.稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后的0h，4h，8h，12h，24h，36h进样，分别记录色谱，计算芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚的峰面积，其rsd分别为2.1％、1.6％、1.8％。表明样品溶液配制后36h内稳定。

9.重复性试验

取同一批号样品平行制备6份供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定，芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚的平均含量分别为0.34143，0.05128，0.0646mg·g^-1，rsd分别为1.4％，1.8％，1.3％。表明该方法重复性良好。

10.加样回收率试验

精密吸取已知含量同一批次样品约0.5g各6份，精密称定，分别置容量瓶中，分别精密加入芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚对照品溶液适量，按供试品制备方法处理，按照上述色谱条件进行测定，计算加样回收率。结果平均回收率分别为99.9％，103.2％，103.1％，rsd分别为1.6％，0.91％，1.3％。表明该方法准确性良好。结果见表5～7。

表5芍药苷加样回收试验结果

表6哈巴俄苷加样回收试验结果

表7丹皮酚加样回收试验结果

五、养阴清肺膏样品含量测定养阴清肺膏的有效成分含量测定结果如表8所示：

表8养阴清肺膏含量测定结果

实施实例2养阴清肺合剂含量方法条件及样品测定一、仪器与试药

1.仪器：

e2695型高效液相色谱仪及2489型紫外检测器(美国waters公司)，kq-300da型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2.试药：

哈巴俄苷(批号：111730-201709，纯度为95.9％)、芍药苷(批号：110736-201842，纯度为97.4％)、丹皮酚(批号：110708-201407，纯度为99.9％)均来源自中国食品药品检定研究院；养阴清肺合剂批号分别为u01002a、u01007a、u02001a、u02003a、u02004a、u02009a、u02010a、u04001a、u04005a、u04006a(来源自广州白云山潘高寿药业股份有限公司)；水为纯化水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

3.色谱条件

色谱柱pntulipsrszg-c18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相0.01mol/l磷酸二氢钠水溶液(a)-乙腈(b)梯度洗脱(0～59min，96％～60％a；59～65min，60％～96％a)；流速0.7ml·min^-1；检测波长0～35min为232nm，35～65min为275nm；柱温35℃，进样量10μl。理论塔板数按芍药苷峰计算，应不低于3000。

4.对照品溶液的制备

取芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加乙醇分别制成芍药苷、哈巴俄苷、丹皮酚的浓度分别为12.000，3.011，4.102mg·l^-1的混合对照品溶液。

5.供试品溶液的制备

取样品1ml，精密称定，置20ml容量瓶中，精密加入乙醇15ml，超声处理(250w，33khz)30分钟后，加乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

6.样品的测定：在色谱条件下，分别进对照品溶液、供试品溶液各10μl，以峰面积计算样品含量。结果见表9。

表9养阴清肺合剂含量测定结果

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。