测定蚯蚓体内CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8及CYP2D6酶活力的方法与流程

本发明属于酶活力检测技术领域，具体涉及测定蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的方法。

背景技术：

细胞色素p450(cyp)酶是一种含金属的氧化酶，是广泛存在于植物、微生物、哺乳动物的完整膜保守蛋白的超家族酶，参与异源物质代谢、药物合成等重要反应。cyp以血红素卟啉铁为中心，通过非共价键结合的血红素中的铁离子传递电子氧化异源物质，增强异源物质的水溶性，使他们更容易排出体外，从而起到解毒作用。人类cyp2亚族如cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8、cyp2d6，负责市场上40-90％的药物代谢，是重要的cyp亚族。但不同生物体内cyp亚酶的种类及含量可能迥异，同个生物的不同亚酶的含量也可能差异巨大。

蚯蚓是土壤中生物量最大的无脊椎动物，利用蚯蚓分子生理生化反应可评价污染物的生态风险。当前，有学者分析蚯蚓cyp1a2、cyp2c9及cyp3a4酶活力后，发现蚯蚓这些cyp亚酶对土壤污染物的响应模式及敏感程度不同，依赖于污染物的化学性质，因此推断它们可作为生物标记物诊断土壤污染状况。那么蚯蚓体内是否存在cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6，它们的酶活力水平及能否作为生物标记物，用于实际评估土壤生态风险，值得进一步实验分析与探索。而可靠稳定的蚯蚓cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力检测方法是基本条件与前提。

目前涉及蚯蚓体内cyp亚酶活力的研究报道，采用的测定方法多为探针底物法，该方法中以某药物作为底物，该底物可被专一的某cyp亚酶催化，利用荧光光度计、紫外分光光度计或高效液相色谱仪-紫外检测器检测相应代谢产物的生成量，通过代谢产物的生成量来反映cyp亚酶的活力。但紫外检测器灵敏度低，荧光光度计与紫外分光光度计无法有效分离探针底物和代谢产物，且单次进样仅能测定单个cyp亚酶活力，不能一次同时测定多个cyp亚酶活力。另外，cyp酶本身是一类血红素酶，血红素的存在能严重干扰荧光光度计或紫外检测器的测定。此外，相比于哺乳动物如人类、大鼠，蚯蚓的生物量小，没有肝脏，其体内的cyp含量非常低，已发表文献中常见报道蚯蚓cyp亚酶检测失败这一结果。

且目前尚无文献报道通量测定蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的方法。因此，急需一种可在较短时间内从复杂生物基质中以更高的特异性进行更低水平的通量检测蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供测定蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、测定蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液；

(2)将步骤(1)中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液加入含有香豆素、安非他酮、阿莫地喹和右美沙芬四种特异探针底物的孵育体系中至所述微粒体蛋白终浓度为32-96μg/ml，香豆素终浓度为50μm，安非他酮终浓度为25μm，阿莫地喹终浓度为50μm，右美沙芬终浓度为5μm，升温启动酶促反应，待酶促反应终止后，利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后产生的7-羟基香豆素、羟基-安非他酮、n-脱乙基阿莫地喹和右啡烷四种特异代谢产物，并分别计算cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力。

优选的，步骤(2)中，高效液相色谱条件为：

a)色谱柱：acquityuplchsst3柱，2.1mm×50mm，1.8μm，并配备相应的c18保护柱；

b)流动相由a相和b相组成，所述a相为甲酸乙酸铵水溶液，所述甲酸乙酸铵水溶液中甲酸的体积分数为0.05％，乙酸铵的浓度为1mm，所述b相为甲醇；

c)梯度洗脱条件：0-0.6min，流动相b的比例为0％；0.6-6min，流动相b的比例由0％上升至95％；6-9min，流动相b的比例保持为95％；9-10min，流动相b的比例为由95％降至0％；

d)柱温：40℃；

e)流速：0.3ml/min；

f)自动进样室温度：4℃，进样体积为5μl。

优选的，步骤(2)中，质谱条件为：

a)离子源：电喷雾电离；

b)检测方式：正离子；

c)锥孔电压：3kv；

d)去溶温度：500℃；

e)去溶气体及流速：氩气，646l/h；

f)扫描模式：多反应离子监测；

g)母离子/子离子对：162.9/106.9、256/238、328/255、258/199；

h)孔电压：24v、14v、20v、35v；

i)碰撞电压：21ev、13ev、36ev、28ev；

j)保留时间：3.67±0.01min、3.76±0.01min、2.83±0.01min、3.48±0.01min。

优选的，步骤(2)中，所述孵育体系包括以下成分：缓冲液和nadph产生系统。

优选的，所述缓冲液为ph＝7.5，浓度为0.1m的tris缓冲液。

优选的，所述nadph产生系统由a液和b液按体积比为5:1组成，所述a液包含如下组分：葡萄糖-6-磷酸20mg/ml、nadp20mg/ml、氯化镁13.3mg/ml；所述b液按如下方法配制：将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶于5mm柠檬酸钠溶液中至所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的终浓度为40u/ml。

优选的，步骤(2)中，所述升温为将温度升至37±0.1℃；所述酶促反应的时间为15-25min；所述酶促反应终止通过加入100-250μl甲醇实现。

优选的，步骤(2)中，所述利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后所产生的四种特异代谢产物前，还包括将酶促反应终止后的孵育混合物在冰浴中静置10min，之后过孔径为0.22μm的滤膜，再以lc-ms/ms检测。

优选的，步骤(2)中，所述酶活力的计算公式如下：

ucyp亚酶＝c产物/(m产物×c蛋白)

ucyp亚酶–cyp亚酶活力，单位nmol/mg蛋白；

c产物–反应体系中特异代谢产物的浓度，单位ng/ml；

m产物–特异代谢产物的摩尔质量，单位g/mol；

c蛋白–反应体系中微粒体蛋白终浓度，单位mg/ml。

本发明的有益效果在于：本发明成功地建立了lc-ms/ms检测蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的方法，该检测方法通量高，准确度、精确度及灵敏度高，稳定性强，可用于一次同时检测蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力，进而为探索蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力、上述酶活力对土壤中污染物的响应模式及能否作为生物标记物指示土壤污染物，提供了稳定可靠快速检测方法。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为香豆素经(cou)cyp2a6催化后生成7-羟基香豆素(7-oh-cou)；

图2为安非他酮(bup)经cyp2b6催化后生成羟基-安非他酮(oh-bup)；

图3为阿莫地喹(amo)经cyp2c8催化后生成n-脱乙基阿莫地喹(deet-amo)；

图4为右美沙芬(dex)经cyp2d6催化后生成右啡烷(o-dem-dex)；

图5为四种特异代谢产物的混合工作液2.5倍稀释液的lc-ms/ms多反应监测图；

图6为四种特异代谢产物的混合工作液2.5倍稀释液、四种特异探针底物的混合工作液、热失活蚯蚓微粒体蛋白溶液和及孵育体系形成的混合液的lc-ms/ms多反应监测图；

图7为7-羟基香豆素(7-oh-cou)、羟基-安非他酮(oh-bup)、n-脱乙基阿莫地喹(deet-amo)、右啡烷(o-dem-dex)的生成量与反应体系中微粒体蛋白终浓度的相关性图；

图8为lc-ms/ms同时检测蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力图；

图9为暴露于多壁碳纳米管染毒土壤21天后，蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的响应。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

材料及试剂：色谱纯甲醇购自merck公司，香豆素(cou)、7-羟基香豆素(7-oh-cou)、安非他酮(bup，1mg/ml，溶剂为甲醇)、羟基-安非他酮(oh-bup，1mg/ml，溶剂为乙腈)、阿莫地喹(amo)、n-脱乙基阿莫地喹(deet-amo，1mg/ml，溶剂为甲醇)、右美沙芬(dex，1mg/ml，溶剂为甲醇)、右啡烷(o-dem-dex，1mg/ml，溶剂为甲醇)、甲酸及tris均购自中国上海sigma-aldrich公司，孵育反应中nadph反应系统购自bdgenetest公司，实验室超纯水由德国sartoriusarium611di超纯水系统过滤，质谱色谱柱来自美国waters公司，赤子爱胜蚓购买后在进行污染暴露实验前在(20±2)℃黑暗条件下保存于清洁土壤中。

方法原理：香豆素(cou)作为探针底物，在蚯蚓cyp2a6酶存在条件下发生羟基化反应，特异转化为对7-羟基香豆素(7-oh-cou)(如图1所示)；安非他酮(bup)作为探针底物，在蚯蚓cyp2b6酶存在条件下发生羟基化反应，特异转化为羟基-安非他酮(oh-bup)(如图2所示)；阿莫地喹(amo)作为探针底物，在蚯蚓cyp2c8酶存在条件下可被催化，特异转化为n-脱乙基阿莫地喹(deet-amo)(如图3所示)；右美沙芬(dex)作为探针底物，在蚯蚓cyp2d6酶存在条件下可被催化，特异转化为右啡烷(o-dem-dex)(如图4所示)。将蚯蚓微粒体蛋白悬浮液加入含有香豆素、安非他酮、阿莫地喹和右美沙芬四种特异探针底物的孵育体系后，进行酶促反应。待酶促反应终止后，采用lc-ms/ms同时测定7-oh-cou、oh-bup、deet-amo和o-dem-dex的生成量，分别对应计算cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8与cyp2d6酶活力。

实施例1

lc-ms/ms条件设置

lc-ms/ms为waters公司xevotq三重四级杆串联质谱-高效液相色谱系统。

高效液相色谱条件为：

a)色谱柱：acquityuplchsst3柱，2.1mm×50mm，1.8μm，并配备相应的c18保护柱；b)流动相由a相和b相组成，a相为甲酸乙酸铵水溶液，其中甲酸的体积分数为0.05％，乙酸铵的浓度为1mm，b相为甲醇；c)梯度洗脱条件：0-0.6min，流动相b的比例为0％，0.6-6min，流动相b的比例由0％上升至95％；6-9min，流动相b的比例保持为95％；9-10min，流动相b的比例为由95％降至0％；d)柱温：40℃；e)流速：0.3ml/min；f)自动进样室温度：4℃，进样体积为5μl。

质谱条件为：

a)离子源：电喷雾电离；b)检测方式：正离子；c)锥孔电压：3kv；d)去溶温度：500℃；e)去溶气体及流速：氩气，646l/h；f)扫描模式：多反应离子监测；定性及定量7-oh-cou、oh-bup、deet-amo和o-dem-dex的ms/ms参数见表1。

表1定性及定量四种特异代谢产物的ms/ms参数

实施例2

基质效应测试

(1)配制储备液

取10mg7-oh-bou粉末，溶于10ml甲醇至7-羟基香豆素浓度为1.0mg/ml，取0.1ml上述溶液以甲醇稀释至10ml，使得7-羟基香豆素浓度为10μg/ml，制得7-oh-bou储备液。

取oh-bup(该溶液中oh-bup的浓度为1mg/ml)0.1ml，采用甲醇稀释至10ml，使得oh-bup的浓度为10μg/ml，制得oh-bup储备液。

取deet-amo(该溶液中deet-amo的浓度为1mg/ml)0.1ml，采用甲醇稀释至10ml，使得deet-amo的浓度为10μg/ml，制得deet-amo储备液。

取o-dem-dex(该溶液中o-dem-dex的浓度为1mg/ml)0.1ml，采用甲醇稀释至10ml，使得o-dem-dex的浓度为10μg/ml，制得o-dem-dex储备液。

取14.61mgcou溶于1ml丙酮后，添加超纯水至10ml，使得cou浓度为10mm，制得cou储备液。

取bup(该溶液中bup的浓度为1mg/ml)1ml，以水稀释到10ml，使得bup的浓度为0.1mg/ml，制得bup储备液。

取46.5mgamo溶于10ml水中，使得amo浓度为10mm，制得amo储备液。

取dex(该溶液中dex的浓度为1mg/ml)1ml，以水稀释到10ml，使得dex的浓度为0.1mg/ml，制得dex储备液。

(2)配制工作液

分别取50μl步骤(1)中7-oh-cou储备液、oh-bup储备液、deet-amo储备液、o-dem-dex储备液，以甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为1:1)稀释至10ml，制得7-oh-cou、oh-bup、deet-amo、o-dem-dex浓度均为50ng/ml的混合工作液。

将0.5ml步骤(1)中cou储备液、6.9ml步骤(1)中bup储备液、0.5ml步骤(1)中amo储备液、1.4ml步骤(1)中dex储备液，混合后以超纯水稀释至25ml，制得四种特异探针底物的混合工作液，该四种特异探针底物的混合工作液中cou、bup、amo、dex的浓度分别为0.2mm、0.1mm、0.2mm、0.02mm。

(3)取4ml四种特异代谢产物浓度均为50ng/ml的混合工作液，以甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为1:1)稀释至10ml，制得四种特异代谢产物的混合工作液的2.5倍稀释液，该四种特异代谢产物的混合工作液中7-oh-cou、oh-bup、deet-amo、o-dem-dex的浓度均为20ng/ml。取1ml该四种特异代谢产物的混合工作液2.5倍稀释液按照实施例1中设定的条件进行lc-ms/ms测定，四种特异代谢产物色质谱图如图5所示。

(4)取1ml步骤(3)中配制的四种特异代谢产物的混合工作液2.5倍稀释液于2ml试管中，在氮吹仪下吹干，添加250μl步骤(2)中配制的四种特异探针底物的混合工作液，550μl孵育体，孵育体系包括：490μl缓冲液(ph＝7.5，浓度为0.1m的tris缓冲液)，60μlnadph产生系统(nadph产生系统由a(50μl)液和b(10μl)液按体积比为5:1组成，其中，a液包含如下组分：葡萄糖-6-磷酸20mg/ml、nadp20mg/ml、氯化镁13.3mg/ml；b液按如下方法配制：将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶于5mm柠檬酸钠溶液中至所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的终浓度为40u/ml)，添加200μl失活酶液(将实施例5中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液进行失活处理)后，升温至37℃孵育20min后，添加200μl甲醇。之后，将孵育混合物在冰浴中静置10min，过孔径为0.22μm的滤膜，按照实施例1中设定的条件进行lc-ms/ms检测，其色质谱图如图6所示。

图5、6中均包含4个子图，7-oh-cou：母离子/子离子对为162.9/106.9，保留时间为(3.67±0.01)min；oh-bup：母离子/子离子对为256/238，保留时间为(3.76±0.01)min；deet-amo：母离子/子离子对为328/255，保留时间为(2.83±0.01)min；o-dem-dex：母离子/子离子对为258/199，保留时间为(3.48±0.01)min。

实施例3

基质标准曲线的建立：

(1)取6ml实施例2步骤(2)中配制的四种特异代谢产物的混合工作液，平均分为6份，以甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为1:1)将6份该混合工作液依次进行以下操作：稀释20倍、10倍、5倍、2.5倍、1.25倍、不稀释，制得6个混合工作液，6个混合工作液中7-oh-cou、oh-bup、deet-amo、o-dem-dex的浓度如表2所示。

表2混合工作液中每个代谢产物的浓度表(单位：ng/ml)

(2)分别取1.0ml步骤(1)中获得的6个混合工作液，置于6个2ml的离心管中，在氮吹仪下吹干，然后分别加入250μl实施例2步骤(2)中配制的四种特异探针底物的混合工作液，再分别加入550μl孵育体系及200μl已经失活的酶溶液(将实施例5中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液进行热失活处理)后升温至37℃，其中，孵育体系包括：490μl缓冲液(ph＝7.5，浓度为0.1m的tris缓冲液)，60μlnadph产生系统(nadph产生系统由a液和b液按体积比为5:1组成，其中，a液包含如下组分：葡萄糖-6-磷酸20mg/ml、nadp20mg/ml、氯化镁13.3mg/ml；b液按如下方法配制：将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶于5mm柠檬酸钠溶液中至所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的终浓度为40u/ml)，然后分别添加200μl甲醇，最后将孵育混合物在冰浴中静置10min，过孔径为0.22μm的滤膜，按照实施例1中设定的条件进行lc-ms/ms检测，制得标准曲线，所得数据见表3。

表3标准曲线数据表

由表3可知，目标分析物在所测浓度范围内，线性关系良好，回归系数r²均大于0.99。

实施例4

lc-ms/ms方法学验证

1、质量控制样品(qcs)制备

(1)取3ml实施例2步骤(2)中配制的四种特异代谢产物的混合工作液，平均分为3份，以甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为1:1)将3份该混合工作液依次进行以下操作：稀释10倍、5倍、1.25倍，制得3个混合工作液，3个混合工作液中7-oh-cou、oh-bup、deet-amo与o-dem-dex的浓度如表4所示。

表4混合工作液中每个代谢产物的浓度表

(2)按照实施例3中步骤(2)所述方法，制得3个水平的qcs样品。

2、准确度与精密度

按照实施例1中设定的条件用lc-ms/ms分别对3个水平的qcs样品进行检测，其中，对于每个质量控制水平，设置5个平行样品，每个样品重复测定4次，连续4天重复此过程，测试结果见表5。

表5qcs样品的准确度与精密度

由表5可知，每个代谢产物的日内相对偏差、日间相对偏差及准确度，均符合美国食品与药品管理局(fda)关于方法验证中对精密度与准确度的要求。

3、提取回收率

按照实施例1中设定的条件用lc-ms/ms分别对纯样品和3个水平的qcs进行检测，通过比较纯样品与3个水平的qcs在lc-ms/ms上的响应，确定回收率，结果见表6。

表6代谢产物的回收率(％,±sd,n＝4)

由表6可知，3个水平的qcs样品，7-oh-cou的回收率为70.3-78.4％，oh-bup的回收率为77.8-97.9％；deet-amo的回收率为81.2-108.7％；o-dem-dex的回收率为82.1-99.0％。因此，采用基质标准曲线定量计算蚯蚓体内cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8与cyp2d6酶活力更为准确。

实施例5

孵育体系中微粒体蛋白终浓度的优化

(1)制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液

将保存于4℃下20％(v/v)甘油溶液中的蚯蚓取出后，迅速解剖内脏，用0.15mol/lkcl溶液清洗内脏，随后转移到装有4ml匀浆缓冲液(蔗糖250mmol/l，tris50mmol/l，dtt1mmol/l，edta1mmol/l，ph＝7.5)的玻璃组织研磨器中使其均匀破碎，并将最终匀浆体积定为6ml。

采用差速离心法提取微粒体：利用低温超速离心机，将匀浆液在4℃，相对离心力为15000×g条件下离心15min后，保留上清液，再将上清液在4℃，相对离心力为150000×g条件下离心90min，将所得沉淀用3ml保存缓冲液(蔗糖50mmol/l，tris50mmol/l，dtt1mmol/l，edta1mmol/l，ph＝7.5，20％(v/v)甘油)重新悬浮，制得蚯蚓微粒体悬蛋白浮液，于-80℃下储存备用。微粒体蛋白的浓度采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清作为标准物质。

(2)孵育体系中微粒体蛋白终浓度的优化

cyp酶是巨大的同工家族酶，同个生物体内的不同亚酶的含量可能差异巨大。因此，基于探针底物法测定蚯蚓cyp亚酶活力，必须保证代谢产物的生成量与反应体系中微粒体蛋白终浓度呈线性关系，对反应体系中的蚯蚓微粒体蛋白终浓度进行优化，显得尤为重要。

孵育反应：取2ml的离心管，加入250μl实施例2步骤(2)中配制的四种特异探针底物的混合工作液，tris缓冲液(ph＝7.5，浓度为0.1m)，其添加体积为(1000-310-v蚯蚓微粒体蛋白悬浮液)μl，60μlnadph产生系统(nadph产生系统由a液和b液按体积比为5:1组成，其中，a液包含如下组分：葡萄糖-6-磷酸20mg/ml、nadp20mg/ml、氯化镁13.3mg/ml；b液按如下方法配制：将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶于5mm柠檬酸钠溶液中至所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的终浓度为40u/ml)。然后，添加不同体积的步骤(1)中制备的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液到离心管中，使其在反应体系中的最终浓度分别为16μg/ml、32μg/ml、48μg/ml、64μg/ml、80μg/ml、96μg/ml。此时，各孵育体系中cou、bup、amo、dex在混合溶液中的最终浓度均分别为50μm、25μm、50μμ、5μm。之后，升温至37℃，启动酶促反应，反应20min后，向离心管中加入200μl甲醇终止反应，然后将终止反应的孵育混合物在冰浴中静置10min，过孔径为0.22μm的滤膜后，按照实施例1中设定的条件进行lc-ms/ms检测，每个代谢产物生成量与孵育体系中微粒体蛋白终浓度的相关性如图7所示。由图7可知，孵育体系中微粒体蛋白的终浓度在16-96μg/ml范围内，7-oh-cou、deet-amo的生成量与微粒体蛋白浓度均呈现较好的线性关系，其中，7-oh-cou的生成量(y)与微粒体蛋白浓度(x)的回归方程分别为y＝0.007x+4.4.93，回归系数r²＝0.98；deet-amo的生成量(y)与微粒体蛋白浓度(x)的回归方程为y＝0.016x+5.26，回归系数r²＝0.94。微粒体蛋白的最终浓度为16μg/ml，未检测到oh-bup、o-dem-dex，但在32-96μg/ml范围内，它们的生成量与蛋白浓度呈现较好的线性关系，其中，oh-bup的生成量(y)与微粒体蛋白浓度(x)的回归方程为y＝0.008x+1.9，回归系数r²＝0.97；o-dem-dex的生成量(y)与微粒体蛋白浓度(x)的回归方程为y＝0.008x+2.0，回归系数r²＝0.97。因此，利用lc-ms/ms通量测定cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力时，须保证孵育体系中微粒体蛋白终浓度为32-96μg/ml。

孵育体系中微粒体蛋白终浓度为80μg/ml时，四种特异代谢产物色质谱图如图8所示。cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的计算公式如下：

ucyp亚酶＝c产物/(m产物×c蛋白)

ucyp亚酶–cyp亚酶活力，单位nmol/mg蛋白；

c产物–反应体系中特异代谢产物的浓度，单位ng/ml；

m产物–特异代谢产物的摩尔质量，单位g/mol；

c蛋白–反应体系中微粒体蛋白终浓度，单位mg/ml。

实施例6

暴露于多壁碳纳米管(mwcnts)染毒土壤中21天后，蚯蚓cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力的测定

将蚯蚓培养于对照组(ck，即未添加多壁碳纳米管)及多壁碳纳米管染毒(染毒浓度梯度为：10、50、100mg/kg，每个浓度设置4个平行)的土壤中21天后，取出蚯蚓，蒸馏水冲洗滤纸擦干后，置于湿润滤纸上空肠24h，制备蚯蚓微粒体悬浮液，进行孵育反应后，用lc-ms/ms分析蚯蚓微粒体孵育反应后代谢产物的生成量。蚯蚓cyp2a6、cyp2b6、cyp2c8及cyp2d6酶活力对多壁碳纳米管的响应，结果如图9所示。采用统计软件spss16.0分析多壁碳纳米管暴露剂量对蚯蚓cyp亚酶含量的影响，p＜0.05视为存在显著性差异。

由图9可知，测定的4种亚酶活力，cyp2c8活力明显高于另外3种cyp亚酶活力，cyp2d6活力最低，仅有cyp2c8活力的1/20到1/40。结果表明，暴露21天后，mwcnts的添加导致蚯蚓体内cyp2c8活力显著高于对照水平；但10、50、100mg/kgmwcnts暴露下，cyp2c8活力未见显著变化；类似地，mwcnts暴露下，蚯蚓体内cyp2a6活力显著高于对照水平。而对于cyp2b6、2d6活力，mwcnts处理并未导致它们发生显著变化。因此，推断cyp2b6、cyp2d6不能作为生物标记物，而cyp2a6、cyp2c8可作为一套生物标记物，诊断土壤mwcnts污染，进而弥补单个cyp亚酶诊断土壤污染不灵的缺陷。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。