一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法与流程

本发明涉及农业种植
技术领域：
，尤其涉及一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法。
背景技术：
：高活力种子在广泛条件下，种子发芽出苗迅速、整齐，且幼苗生长健壮，抵抗不良环境条件的能力强；低活力种子虽然能发芽，但发芽、出苗速度慢，在不良条件下则表现为出苗不整齐，幼苗细弱，甚至不出苗等情况；种子活力是播种质量的重要指标，也是种用价值的重要组成部分，与种植生产关系密切。目前种子活力的检测方法达数十种，但主要分为直接法和间接法两大类。直接法是在实验室条件下，模拟田间不良条件测定种子批田间出苗率的方法，例如低温发芽试验、砖砾试验等。间接法是测定某些与种子活力有关的生理生化指标，如电导率测定、四唑测定等。传统的种子活力测定方法可以准确且直观的预测种子活力，但存在着工作量大、重复性差、周期长、受环境影响大、易造成种子损伤等缺点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法，以解决上述技术问题。本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法，包括水稻种子，所述水稻种子分为：陈年水稻种子、新采摘的水稻种子和人工加速老化后的水稻种子，所述水稻种子进行核磁共振波谱分析试验，所述水稻种子进行核磁共振波谱分析试验，结束后进行标准发芽试验，所述老化水稻种子是通过新采摘的水稻种子经过人工加速老化试验处理得到，所述人工加速老化试验的实验步骤：s1.将4个大小为12cm*12cm*6cm的带盖的塑料盒子底部注入约2cm高的去离子水；s2.在距离水面约4cm处放置支架，在支架上方放置带有若干半径为1.5mm圆形网孔的塑料板；s3.将类型为老化种子的4组水稻种子试验样本均匀的平铺于4个塑料板的表面，盖好盖子对试验样本进行密闭处理；s4.将这4组试验样本同时至于温度为45℃，相对湿度为100％的种子老化箱中持续老化72h；s5.完成老化，得到经过人工加速老化试验处理后的水稻种子。优选的，所述水稻种子样本共12组，所述12组实验样本每种类型均为4组，所述12组实验样本每组为100粒，所述每组100粒的样本细分为20粒每组，这样一共产生60个实验小组，所述60个实验小组用感量为0.0001g的电子天平称取每个平行样本的质量并记录相关数据。优选的，所述核磁共振波谱分析试验是利用标准油样及核磁共振分析应用软件中的fid脉冲序列确定核磁共振仪的主频及硬脉冲脉宽，以及利用核磁共振分析应用软件中的cmpg脉冲序列采集60个试验样本小组的自由衰减信号曲线，所述此实验每个样本重复4次，所述将4次重复采集生成的自旋回波信号导入核磁共振反演拟合软件各自反演，所述将反演结果取平均值作为样本的横向弛豫时间和信号幅值。优选的，所述cpmg脉冲序列的参数设置如下：sf1＝21mhz，o1每次试验自动校正，p1＝17.52μs，p2＝35.52μs，td＝74990，tw＝2000ms，prg＝3，nech＝3000，te＝0.25ms，sw＝100khz，rfd＝0.08ms，rg1＝20db，drg1＝1，dr＝1，ns＝64。优选的，根据权利要求1所述标准发芽实验步骤：s1.先用3％的次氯酸溶液对水稻种子进行消毒，再用蒸馏水冲洗3次后，将其均匀的放置于铺有发芽纸的发芽盒内，并注入适量蒸馏水对种子进行萌发处理；s2.将各组样本置于温度为27℃的智能人工气候培养箱中进行恒温培养，设置12h光照及12h无光照的分段模式，共计6d；s3.每天观察滤纸水分情况并及时补充水分，同时记录每天发芽的种子数与苗高数值；s4.6d后观察种子幼苗的高度，凡苗高达到4cm即确定为高活力种子；s5.计算发芽指数与活力指数及高活力种子比率，具体计算公式如下：①式中，dt为发芽天数，gt为相对应的每天发芽种子数；②vi＝gi*s，式中，s为一定时期内的正常幼苗长度；③hvr＝n1/n2，式中，n1为6d后苗高达到4cm的水稻种子数，n2为种子试样粒数；s6.将低场核磁共振波谱试验与标准发芽试验中采集的全部数据交由spss20.0软件进行处理，所有数据以均值±标准差表示。本发明的有益效果是：针对当前种子活力检测存在的问题，本发明以新采摘的和陈年水稻种子为研究对象，首先，采用人工加速老化试验对新采摘的水稻种子进行人工老化处理，其次，利用低场核磁共振技术对新采摘的水稻种子、自然老化水稻种子及人工老化处理后的水稻种子分别进行波谱检测，寻求可以表现种子活力的特征参数，最后利用标准发芽试验对测定结果进行判断，可以快速、准确、无损地检测种子活力，寻求室内活力测定和田间生产能力性能的相关性，可以比较水稻种子人工老化和自然老化的本质差异。附图说明图1为不同活力水平水稻种子横向弛豫时间t2反演图；图2为新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部结合水部分横向弛豫时间差异图；图3为新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部自由水部分横向弛豫时间差异图；图4为新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子的活力差异在核磁共振反演谱信号幅值图。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1如图1所示，一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法，包括新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部水分相态的划分，图1为使用迭代寻优的方法，将cpmg脉冲序列采集到的t2衰减曲线带入弛豫模型中拟合并反演得到的样品的t2弛豫谱，包括弛豫时间及其对应的弛豫信号分量，横坐标范围是从10-2ms到104ms对数分布的100个横向弛豫时间分量t2，纵坐标为各弛豫时间对应的信号分量a2i(为了便于定量分析，所有信号分量均经过质量归一化处理)，根据核磁共振原理得知，该信号分量与其组分含量成正比关系，积分面积a为各个分量之和，即为样品的信号量，图1为不同活力水平水稻种子横向弛豫时间t2反演谱，图1横坐标表示横向弛豫时间，图1纵坐标表示信号振幅。t2弛豫时间反映了样品内部氢质子所处的化学环境，与氢质子所受的束缚力及其自由度相关，而氢质子的束缚程度又与样品的内部结构有着密不可分的关系。氢质子所受束缚越大，即氢质子的自由度越小，t2弛豫时间越短，在t2反演谱位置越靠左；反之，t2弛豫时间越长，在t2反演谱位置越靠右。从图1的水稻种子样品t2分布曲线中可以看出，无论是新种子、陈种子还是人工加速老化试验后种子，各t2反演谱曲线均出现2个峰，按照水稻种子样本分析该弛豫谱的水分相态模型，峰与水分相态的对应关系为：第1个峰t21，弛豫时间低于10ms，对应为结合水，其信号幅值为a21,这部分水靠分子之间的引力被种子中的淀粉、蛋白质等亲水胶体吸附，较难从种子中蒸发，不易流动；第2个峰t22，弛豫时间高于10ms，对应为自由水，其信号幅值为a22，这部分水靠毛细管引力比较松弛的保持在种子中，能自由移动，具有普通水的性质存在于细胞间隙，容易蒸发。这里样品的信号量a＝a21+a22，分析图1发现，结合水对整体信号贡献较大。种子水分的存在状态与种子的生命活动密切相关。当种子中只有结合水，种子中的水解酶呈钝化状态，种子新陈代谢极其微弱；当种子中自由水比重增加，水解酶由钝化状态向活化状态转变，种子呼吸强度升高，种子活力会很快降低，所以种子内部水分状态及其分布对种子活力有着重要的影响。试验对新种子、陈种子及人工加速老化试验后种子共60个试验样本，分别测试了t2衰减曲线，并利用反演算法迭代10000次得到t2分布曲线，t2分布弛豫时间及其对应的峰面积的基本统计信息如表1所示。下表为用于水分相位划分的横向松弛时间和信号振幅数据表1实施例2如图1-2所示，一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法，包括新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子结合水部分横向弛豫时间上的差异，图2为新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部结合水部分(横向弛豫时间t21，信号幅值a21)横向弛豫时间上的差异情况，其中图a为3种水稻种子内部结合水的峰起始时间频数差异情况，图b为3种水稻种子内部结合水的峰顶点时间频数差异情况，图c为3种水稻种子内部结合水的峰结束时间频数差异情况。3个图的坐标轴的横轴均为3种不同的水稻种子样本，坐标轴的纵轴为不同峰值点出现的频数统计，此处用堆积柱形图显示了各峰值点出现频数的占比情况。从图2a中可以看出新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部结合水的峰起始时间均为0.01，表明不同活力的水稻种子内部结合水的峰起始时间毫无差别，说明利用该特征参数无法区分水稻种子样本活力水平。从图2b中可以看出新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部结合水的峰顶点时间频数占比不同，新种子t21峰顶点时间0.498与0.572的占比分别为73.75％，26.25％；陈种子t21峰顶点时间0.498与0.572的占比分别57.5％，42.5％；人工老化后种子t21峰顶点时间0.498与0.572的占比分别46.25％，53.75％，峰顶点时间均值位置呈现右移趋势。从图2c中可以看出新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部结合水的峰结束时间频数占比差异更加显著，新种子t21峰结束时间2.31、2.656与3.054的占比分别为100％，0％及0％；陈种子t21峰结束时间2.31、2.656与3.054的占比分别91.25％，8.75％及0％；人工老化后种子t21峰结束时间2.31、2.656与3.054的占比分别5％，58.75％及36.25％；峰结束时间均值位置右移趋势更加明显。横向弛豫时间可以反映样品内部水分与样品内部其他物质结合能力的强弱，从图2b与图2c可以看出，水稻种子老化后样品内部水分与样品内部其他物质结合能力减弱。由此，可以将t21峰顶点时间与t21峰结束时间作为判断种子活力的一个依据，即活力水平差的种子t21峰顶点时间与t21峰结束时间较大。实施例3如图1-3所示，一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法，包括新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子自由水部分横向弛豫时间上的差异，图3为新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部自由水部分(横向弛豫时间t22，信号幅值a22)横向弛豫时间上的差异情况，其中图3a为3种水稻种子内部自由水的峰起始时间分布差异情况，图3b为3种水稻种子内部自由水峰顶点时间分布差异情况，图3c为3种水稻种子内部自由水峰结束时间分布差异情况，图中以3种颜色对不同活力的种子作以区分。这里坐标轴为3种不同的水稻种子样本，坐标轴的纵轴代表峰时间点，单位ms，气泡大小表示各峰时间点出现的频数情况。图3a与图3b中新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部自由水的峰起始时间与峰结束时间分布差异不显著，说明不能够将t22峰起始时间与峰顶点时间作为区分种子活力的依据，但图3c中t22峰结束时间分布差异在3种不同活力的种子中表现极其显著。观察图3c发现新种子的t22峰结束时间最长，人工老化后种子的t22峰结束时间最短，陈种子的t22峰结束时间居中，说明新种子内部自由水的自由度最高，人工老化后种子内部自由水的自由度最低，陈种子内部自由水的自由度介于二者之间。由此，可以将t22峰结束时间作为判断种子活力的又一个依据。实施例4如图1-4所示，一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法，包括新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子的活力差异在核磁共振反演谱信号幅值上的反映,图4为新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子的活力差异在核磁共振反演谱信号幅值上的反映，坐标轴的横轴为自由水信号幅值，坐标轴的纵轴为结合水信号幅值，气泡大小表示样品总体水分信号幅值；图例以3种不同的颜色区分新采摘的水稻种子、陈年水稻种子及人工老化试验后的水稻种子，气泡图很好的展示了3个系列3个变量之间相互的关系。观察图4发现，种子老化后a峰总面积增大，说明其含水量增高。这里，人工老化后种子与陈种子的总体水分含量均高于新种子，这与我们已知的种子内部水分含量过高将导致种子活力下降这一结论相吻合，说明低场核磁共振技术可以作为一种有效检测水稻种子活力的手段。种子内部水分含量过高，种子的呼吸代谢作用增强，这大大加速了种子内部物质的消耗，从而降低了种子的活力。高水分的种子由于呼吸旺盛，氧气消耗多，种子因为缺氧呼吸而产生大量乙醇等有机物，使种胚细胞受毒害而丧失活力，也会降低种子的活力。图4还很好的区分了种子人工老化与自然老化的差异，2种老化方式样本的总水分含量虽然都高于新种子，但人工老化种子的自由水含量低于新种子，而陈种子的自由水含量高于新种子。人工加速老化试验是将水稻种子置于温度为45℃，相对湿度为100％的环境中持续老化72h，高温高湿增强了种子的新陈代谢作用，这促使了细胞代谢更加旺盛，果糖、葡萄糖等有机碳水化合物的浓度不断增高，水分向结合状态不断迁移，结合水含量大幅度增高，自由水含量降低。种子是具有多孔性毛细管结构的胶体物质，种子的表面和内壁可以吸附水蒸气或者其他挥发性物质的气体分子，种子表面和内壁的水蒸气或其他挥发性物质也可以释放到环境中去，经过一定时间种子的这种吸附和解析的过程会达到一个动态平衡。陈种子由于长时间置于空气中，吸收了空气中的水分故在种子内部形成以游离形式存在的自由水，自由水作为反应水溶性、代谢活性及细胞膜透水性水分在水稻种子内部容易移动及散失。当自由水含量所占比例足够大时，物质的原生粘度变小，代谢增强，此时参与的葡萄糖、果糖等碳水化合物的浓度将升高，自由水又向结合水状态迁移，自由水的浓度又将减小。所以陈种子自由水与结合水的分布不断的发生迁移，这里发现二者都有小幅度的上升。实施例5如图1-4所示，一种基于低场核磁共振技术对水稻种子活力检测方法，包括新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子的活力差异在标准发芽试验中的结果检验，试验观察并记录了萌发过程中每天种子萌发的数目，测量了每棵幼苗的高度，根据上述文中的公式，计算了发芽指数gi、活力指数vi及高活力种子比率hvr，具体信息如表2所示：下表为标准发芽试验下水稻种子发芽指数数据类型givihvr新种子6.47918.185％老种子6.22916.7375％老化种子5.93315.2467.5％表2通过表2的数据可以清晰的观测到新种子的活力水平高于自然老化与人工老化2个试验样本。水稻的生长是从种子的萌发开始的，当稻种吸水膨胀，胚根突破种壳露出白点时，称为“露白”或“破胸”，此时在试验过程中我们将其认作萌发开始，记作发芽。但大量试验样本及不同的观测角度，造成试验结果受主观因素的影响很大。当种子胚芽开始生长后每天测量并记录种子幼苗的长度，由于种子生长方向的任意性及幼苗自身弯曲生长的特点又决定了这部分的结果人为误差将更加难以避免。当4次重复的最高和最低数值均在试验规定流程的最大容许差距范围内被认定该组试验结果有效，取其平均值作为该批种子的试验样本的活力水平数据。通过上述5个实施例中可得以下结论(1)新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部结合水部分(横向弛豫时间t21，信号幅值a21)峰顶点时间与峰结束时间频率存在显著差异，水稻种子老化后样品内部水分与样品内部其他物质结合能力减弱，横向弛豫时间增大，t21峰顶点时间与t21峰结束时间可以作为判断种子活力的一个依据。(2)新种子、陈种子与人工加速老化试验后种子内部自由水部分(横向弛豫时间t22，信号幅值a22)峰结束时间分布存在显著差异，新种子的t22峰结束时间最长，人工老化后种子的t22峰结束时间最短，陈种子的t22峰结束时间居中。即新种子内部自由水的自由度最高，人工老化后种子内部自由水的自由度最低，陈种子内部自由水的自由度介于二者之间。t22峰结束时间可以作为判断种子活力的又一个依据。(3)人工老化种子与陈种子的总体水分含量均高于新种子，与我们已知的种子内部水分含量过高将导致种子活力下降这一结论相吻合，说明低场核磁共振技术可以作为一种有效检测水稻种子活力的手段。低场核磁共振技术同时很好的区分了人工老化与自然老化的差异，2种老化方式的水稻种子的总水分含量虽然都高于新种子，但人工老化种子的自由水含量低于新种子，而陈种子的自由水含量高于新种子，说明低场核磁共振技术从种子内部水分分布对两种老化方式作以简单辨别。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12