一种同时检测五种内分泌干扰物的方法、试剂盒及应用与流程

本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种同时检测五种内分泌干扰物的方法、试剂盒及应用。
背景技术：
：内分泌干扰物(endocrinedisruptingchemicals，即edcs)广泛存在于生物圈，在食物和饮水中都能检测到。内分泌干扰物也称为环境激素，能够干扰人类或动物内分泌系统并导致异常效应的物质。痕量物质的积累也会导致动物体和人体生殖器障碍、行为异常、生殖能力下降、幼体死亡甚至灭绝。因此，对食品和水体中内分泌干扰物的灵敏度检测十分重要。edcs多为有机污染物及重金属物质。农药大部分属于edcs，edcs大多是人工合成，例如工业中使用的多氯联苯是持久性有机污染物之一，属于一个被称为氯化氢化合物的人造有机化学品大家族。工业中使用的大部分稳定剂和增塑剂也属于内分泌干扰物，而这些不能分解的化合物很可能作为污染物流入河流、饮用水，最终通过食物进入人们的口中。随着生活水平的提高和全世界范围内食品的流通，人们越来越重视食品安全。内分泌干扰物的研究就显得日益重要。至今为止，研究人员对食品安全的研究主要集中在抗生素、真菌毒素和农兽药残留方面的检测。国内外对内分泌干扰物的研究较少，并且国内外常用的酶联免疫吸附方法(elisa)操作复杂，耗时长，且灵敏度较低，不能实现高通量检测。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的首要发明目的在于提供一种同时检测五种内分泌干扰物的方法。本发明的第二发明目的在于提供一种同时检测五种内分泌干扰物的试剂盒。本发明的第三发明目的在于提供该方法的应用。为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：本发明提出一种同时检测五种内分泌干扰物的方法，所述五种内分泌干扰物包括雌二醇、雌三醇、双酚a、己烯雌酚和壬基酚；所述方法至少包括以下步骤：s1、将所述五种内分泌干扰物的完全抗原分别与羧基化磁性微球进行偶联；s2、绘制所述五种内分泌干扰物的多通道标准曲线；s3、对待测标本进行检测，通过所述多通道标准曲线，获得所述待测标本中所述五种内分泌干扰物的浓度。可选的，所述偶联至少包括以下步骤：s11、活化所述羧基化磁性微球；s12、将活化后的羧基化磁性微球与所述五种内分泌干扰物的完全抗原偶联。可选的，所述活化至少包括以下步骤：s111、将所述羧基化磁性微球恢复至室温，分离，清洗；s112、加入edc溶液和nhs溶液进行活化，分离，清洗即得活化后的羧基化磁性微球；优选的，每1.25×106个羧基化磁性微球中添加浓度为40～60mg/ml的edc溶液10μl、浓度为40～60mg/ml的nhs溶液10μl。可选的，所述偶联至少包括以下步骤：s121、向所述活化后的羧基化磁性微球加入所述五种内分泌干扰物的完全抗原进行交联，得到交联微球；s122、分离、清洗；s123、用封闭液进行封闭；s124、分离，清洗。可选的，所述五种内分泌干扰物的完全抗原的浓度分别为：雌二醇完全抗原4～8μg/ml、雌三醇完全抗原8～12μg/ml、双酚a完全抗原12～16μg/ml、己烯雌酚完全抗原8～12μg/ml、壬基酚完全抗原12～16μg/ml；优选为：雌二醇完全抗原6μg/ml、雌三醇完全抗原10μg/ml、双酚a完全抗原14μg/ml、己烯雌酚完全抗原10μg/ml、壬基酚完全抗原14μg/ml。可选的，所述绘制所述五种内分泌干扰物的多通道标准曲线时，抗雌二醇单克隆抗体的浓度为10～20ng/ml，优选为12ng/ml；抗雌三醇单克隆抗体的浓度为5～15ng/ml，优选为10ng/ml；抗双酚a单克隆抗体的浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；抗己烯雌酚单克隆抗体的浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；抗壬基酚单克隆抗体的浓度为10～20ng/ml，优选为14ng/ml。本发明还涉及一种同时检测五种内分泌干扰物的试剂盒，所述试剂盒包括：分别偶联有雌二醇完全抗原、雌三醇完全抗原、双酚a完全抗原、己烯雌酚完全抗原、壬基酚完全抗原的磁性微球；所述分别偶联有雌二醇完全抗原、雌三醇完全抗原、双酚a完全抗原、己烯雌酚完全抗原、壬基酚完全抗原的磁性微球上述方法中的s1步骤制备得到；抗雌二醇单克隆抗体、抗雌三醇单克隆抗体、抗双酚a单克隆抗体、抗己烯雌酚单克隆抗体、抗壬基酚单克隆抗体；链霉亲和素藻红蛋白；优选的，所述试剂盒中还包括清洗液。可选的，所述磁性微球的浓度为0.625～2.5×106beads/ml，优选为1.25×106beads/ml。可选的，所述抗雌二醇单克隆抗体为生物素化抗雌二醇单克隆抗体，浓度为10～20ng/ml，优选为12ng/ml；所述抗雌三醇单克隆抗体为生物素化抗雌三醇单克隆抗体，浓度为5～15ng/ml，优选为10ng/ml；所述抗双酚a单克隆抗体为生物素化抗双酚a单克隆抗体，浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；所述抗己烯雌酚单克隆抗体为生物素化抗己烯雌酚单克隆抗体，浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；所述抗壬基酚单克隆抗体为生物素化抗壬基酚单克隆抗体，浓度为10～20ng/ml，优选为14ng/ml。本发明还涉及上述的方法在检测自来水或牛奶中的应用。本发明至少具有以下有益的效果：本发明提出一种同步检测自来水和牛奶中五种内分泌干扰物的悬浮芯片技术，具有高通量、重复性好、灵敏度高和准确性好的优点，在食品与环境的检测领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为五种完全抗原与微球的偶联分布图；图2为五种完全抗原与微球偶联的优化结果图3为五种生物素化单抗优化结果；图4为五种内分泌干扰物抗原抗体特异性检测结果；图5为悬浮芯片法同时检测五种内分泌干扰物标准曲线；图6为以自来水为基底绘制的标准曲线；图7为以牛奶为基底绘制的标准曲线。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例提出一种同时检测五种内分泌干扰物的方法，五种内分泌干扰物包括雌二醇、雌三醇、双酚a、己烯雌酚、壬基酚；本发明实施例选取水和食品中常见的五种内分泌干扰物，即雌二醇(estradiol，e2)、雌三醇(estriol，e3)、双酚a(bisphenola，bpa)、己烯雌酚(diethylstilbestrol，des)、壬基酚(nonylphenol，np)作为靶标物进行高通量研究。本发明实施例的检测方法至少包括以下步骤：s1、将五种内分泌干扰物的完全抗原分别与磁性微球进行偶联；s2、绘制五种内分泌干扰物的多通道标准曲线；s3、对待测标本进行检测，通过多通道标准曲线，获得待测标本中五种内分泌干扰物的浓度。本发明实施例采用了悬浮芯片技术(suspensionarraytechnology，sat)，利用液相中的具有独特编码的微球为固定探针的载体去替换平面芯片载体，通过流式细胞技术进行流动,配合相应的解码器及强大的数据处理平台进行分析，这不仅保持了通量高的优点，更提高了检测的灵活性、重现性和灵敏度。sat完全液相的反应体系使得检测接近生物系统内部环境，因此特别适用于食品中内分泌干扰物的检测。可选的，偶联至少包括以下步骤：s11、活化羧基化磁性微球；s12、将活化后的羧基化磁性微球与五种内分泌干扰物偶联。可选的，活化至少包括以下步骤：s111、将羧基化磁性微球恢复至室温，分离，清洗；s112、加入edc溶液和nhs溶液进行活化，分离，清洗即得活化后的羧基化磁性微球；优选的，每1.25×106个羧基化磁性微球中添加浓度为40～60mg/ml的edc溶液10μl、浓度为40～60mg/ml的nhs溶液10μl；具体的，分离采用磁分离；清洗采用0.1mpbs缓冲液，漩涡震荡10～20s，超声5～15s，磁分离弃上清。可选的，偶联至少包括以下步骤：s121、向活化后的羧基化磁性微球加入五种内分泌干扰物的完全抗原进行交联，得到交联微球；s122、分离、清洗；s123、用封闭液进行封闭；s124、分离，清洗。可选的，五种内分泌干扰物的完全抗原的偶联浓度分别为：雌二醇完全抗原4～8μg/ml、雌三醇完全抗原8～12μg/ml、双酚a完全抗原12～16μg/ml、己烯雌酚完全抗原8～12μg/ml、壬基酚完全抗原12～16μg/ml；优选为：雌二醇完全抗原6μg/ml、雌三醇完全抗原10μg/ml、双酚a完全抗原14μg/ml、己烯雌酚完全抗原10μg/ml、壬基酚完全抗原14μg/ml。具体的，分离采用磁分离；清洗采用0.1mpbs缓冲液。可选的，绘制五种内分泌干扰物的多通道标准曲线时，抗雌二醇单克隆抗体的浓度为10～20ng/ml，优选为12ng/ml；抗雌三醇单克隆抗体的浓度为5～15ng/ml，优选为10ng/ml；抗双酚a单克隆抗体的浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；抗己烯雌酚单克隆抗体的浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；抗壬基酚单克隆抗体的浓度为10～20ng/ml，优选为14ng/ml。本发明还涉及一种同时检测五种内分泌干扰物的试剂盒，本发明的方法可同步检测自来水和牛奶中五种内分泌干扰物，具有高通量、重复性好、灵敏度高和准确性好的优点。具体包括：分别偶联有雌二醇完全抗原、雌三醇完全抗原、双酚a完全抗原、己烯雌酚完全抗原、壬基酚完全抗原的磁性微球；分别偶联有雌二醇完全抗原、雌三醇完全抗原、双酚a完全抗原、己烯雌酚完全抗原、壬基酚完全抗原的磁性微球采用上述方法中的s1步骤制备得到；抗雌二醇单克隆抗体、抗雌三醇单克隆抗体、抗双酚a单克隆抗体、抗己烯雌酚单克隆抗体、抗壬基酚单克隆抗体；链霉亲和素藻红蛋白。优选的，所述试剂盒中还包括清洗液，进一步优选的，0.1mpbs缓冲液作为清洗液。可选的，磁性微球的浓度为0.625～2.5×106beads/ml，优选为1.25×106beads/ml。可选的，抗雌二醇单克隆抗体为生物素化抗雌二醇单克隆抗体，浓度为10～20ng/ml，优选为12ng/ml；抗雌三醇单克隆抗体为生物素化抗雌三醇单克隆抗体，浓度为5～15ng/ml，优选为10ng/ml；抗双酚a单克隆抗体为生物素化抗双酚a单克隆抗体，浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；抗己烯雌酚单克隆抗体为生物素化抗己烯雌酚单克隆抗体，浓度为15～25ng/ml，优选为12ng/ml；抗壬基酚单克隆抗体为生物素化抗壬基酚单克隆抗体，浓度为10～20ng/ml，优选为14ng/ml。可选的，链霉亲和素藻红蛋白的浓度为1mg/ml。本发明实施例还涉及上述的方法在检测自来水或牛奶中的应用。本发明的方法可同步检测自来水和牛奶中五种内分泌干扰物，具有高通量、重复性好、灵敏度高和准确性好的优点。本发明实施例所需的实验材料如下：雌二醇(estradiol,e2)、雌三醇(estriol,e3)、双酚a(bisphenola,bpa)、己烯雌酚(diethylstilbestrol,des)、壬基酚(nonylphenol,np)：坛墨质检；雌二醇完全抗原(e2-bsa)、雌三醇完全抗原(e3-bsa)、双酚a完全抗原(bpa-bsa)、己烯雌酚完全抗原(des-bsa)、壬基酚完全抗原(np-bsa)：山东绿都；抗雌二醇单克隆抗体(e2-ab)、抗雌三醇单克隆抗体(e3-ab)、抗双酚a单克隆抗体(bpa-ab)、抗己烯雌酚单克隆抗体(des-ab)、抗壬基酚单克隆抗体(np-ab)：武汉优博；羧基化的荧光微球(编号为34#、42#、35#、45#、54#)：美国luminex公司；生物素标记试剂盒，eblk0002：elabscience公司；氨基偶联试剂盒，171-304000：bio-rad公司；1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、磺化的n-羟基琥珀酰亚胺(s-nhs)：美国pierce公司；链霉亲和素化的藻红蛋白(sa-pe)：美国invitrogen公司；tween-20、牛血清白蛋白(bsa)：美国sigma公司。其它化学试剂均为国产分析纯，所用纯水均为milli-q超纯水。所需要的主要仪器如下：luminex200悬浮芯片体系为美国luminex公司；ms3数显型振荡器为德国ika公司；全自动洗板机为bio-rad公司；速台式离心机为上海安亭科学仪器厂；37℃电热恒温培养箱为上海新苗医疗器械制造有限公司。实施例1五种内分泌干扰物完全抗原分别与不同编码微球的偶联本发明采用luminex公司编码的34#、42#、35#、45#和54#号羧基化微球分别与e2-bsa、e3-bsa、bpa-bsa、des-bsa、np-bsa五种完全抗原偶联。1.1羧基化微球的活化1.2采用氨基偶联试剂盒(货号171-304000：bio-rad公司)进行试验，实验方法参考说明书。在偶联前将装有羧基化微球的棕色小瓶置于室温下放置20min。保证室内光线昏暗，尽可能防止微球长时间暴露于光线下。活化前，将edc和s-nhs从-20℃冰箱取出，小量分装，每次用是各取出一管放入干燥器中干燥1h。1.11从单分散带有羧基的微球悬浮液中吸出100μl(1.25×106beads/ml)到交联管中，磁分离5min，弃上清。1.12加入100μl微球清洗缓冲液，漩涡震荡15s，超声10s，磁分离弃上清。1.13加入80μl微球激活缓冲液漩涡震荡15s，超声10s。1.14加入新配制的edc和s-nhs(浓度各为50mg/ml)各10μl，漩涡震荡15s，中速震荡微球20min。1.15再加入150μlpbs，漩涡振荡活化的微球15s，磁分离弃上清，重复此步骤2次。1.3羧基化微球与蛋白质样品的偶联采用氨基偶联试剂盒(货号171-304000，bio-rad公司)进行实验，实验方法参考说明书。(1)向活化的微球加入雌二醇完全抗原6μg/ml、雌三醇完全抗原10μg/ml、双酚a完全抗原14μg/ml、己烯雌酚完全抗原10μg/ml、壬基酚完全抗原14μg/ml，用pbs调整终浓度至500μl；室温下用搅拌器搅拌微球4h。(2)磁分离弃上清。(3)用500μlpbs清洗微球，磁分离弃上清。(4)250μl封闭液重悬交联微球，中等速度涡旋15s，搅拌器搅拌微球20min。(5)磁分离弃上清。(6)用500μl储备缓冲液清洗交联微球，磁分离弃上清。(7)用100μl储备缓冲液重悬交联微球，4℃备用。1.4包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数器来确定微球的数量，保证每个反应孔所含的每种微球数均大于2000个。五种完全抗原与微球的偶联分布图见图1。图1为悬浮芯片检测中悬浮芯片检测中e2-bsa与34#号羧基化微球、e3-bsa与42#号羧基化微球、bpa-bsa与35#号羧基化微球、des-bsa与45#号羧基化微球、np-bsa与54#号羧基化微球偶联后，加入五种小分子和五种单克隆抗体进行竞争反应，最后加入链霉亲和素化的藻红蛋白(sa-pe)用于上机检测的示意图。实施例2五种内分泌干扰物完全抗原与微球偶联最佳浓度的确定1、偶联优化实验在进行偶联实验时，每种磁性微球和完全抗原偶联的优化梯度分别为2μg/ml、6μg/ml、10μg/ml、14μg/ml、18μg/ml。2、加入过量的生物素化抗体在96孔板中加入偶联好的微球50μl，2000个/孔。加入过量的生物素化抗体，37℃振荡温育15min，洗板机清洗3次。3、加入100倍稀释的sa-pe溶液(稀释后浓度10μg/ml)50μl，37℃振荡温育30min。洗板机洗3次。4、按照正常程序打开悬浮芯片仪，预热30min，并根据需要选择是否校正。将96孔板放进luminex200体系的检测平台，通过配套软件获取检测的中位荧光值(medianfluorescentintensitity，mfi)。结果如图2所示。5、通过对提取后的mfi值进行处理和分析，得出五种完全抗原和微球偶联的最佳浓度：雌二醇完全抗原6μg/ml、雌三醇完全抗原10μg/ml、双酚a完全抗原14μg/ml、己烯雌酚完全抗原10μg/ml、壬基酚完全抗原14μg/ml。实施例3五种内分泌干扰物生物素化单抗最佳工作浓度的确定利用偶联有完全抗原的微球确定待检测的五种内分泌干扰物单克隆抗体最佳工作浓度确定，具体步骤如下：1、五种内分泌干扰物单抗生物素化，根据试剂盒(货号eblk0002：elabscience公司)说明书进行：1.1、取1mg待标记抗体于超滤管中，加入相应体积的标记缓冲液至总体积为0.5ml，12000g离心10min；1.2、加入13.3μlnh2-reactivebiotin和适量labelingbuffer至上述超滤管中，使抗体终浓度为2mg/ml，并轻轻吹打混匀，放入37℃恒温箱中避光孵育30min；1.3、12000g离心10min；1.4、加入适量labelingbuffer至上述超滤管中，使终体积为0.5ml，轻轻吹打混匀，12000g离心10min；1.5、加0.2mllabelingbuffer至超滤管中，轻轻吹打。将滤芯倒置放入另一个离心管中，6000g离心10min；1.6、集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体。2、配制五种生物素化的单抗：每种单抗的浓度分别为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/ml8个梯度加入，5种偶联过内分泌干扰物完全抗原的微球每种分别取出2000个，每个梯度做3个平行样，以进入平台期拐点的抗体加入量为最适加入量。3、按照正常程序打开悬浮芯片仪，预热30min，并根据需要选择是否校正。将96孔板放进luminex200体系的检测平台，通过配套软件获取检测的中位荧光值(medianfluorescentintensitity，mfi)。结果如图3所示。4、通过对提取后的mfi值进行处理和分析，得出五种生物素化单抗的最佳工作浓度。由此阶段的实验得出：五种内分泌干扰物生物素化单抗的最佳工作浓度为antibio-e2-ab12ng/ml，antibio-e3-ab10ng/ml，antibio-bpa-ab12ng/ml，antibio-des-ab12ng/ml，antibio-np-ab14ng/ml。实施例4对五种内分泌干扰物偶联微球和不同抗体的特异性进行分析选取96孔板，每孔加入5种预混好的探针微球(各2000个/孔)，在a、b、c、d、e列中任选一列的任一个孔任意加入一种特异性抗体，a、b、c、d、e五列所加入的特异性抗体各不相同；在f列中全部加入5种抗体，上机检测。在并在孔板上重复加5次。相关结果见图4。结果显示偶联微球和抗体之间特异性良好，未发生交叉反应，并且重复性良好。实施例5同时检测五种内分泌干扰物多通道标准曲线的建立利用偶联有完全抗原的微球，以及确定后的待检测的特异性高的五种内分泌干扰物单克隆抗体的最佳工作浓度，进行此阶段的实验。具体步骤如下：(1)先配制五种内分泌干扰物生物素化单抗的最佳工作浓度溶液，即antibio-e2-ab12ng/ml，antibio-e3-ab10ng/ml，antibio-bpa-ab12ng/ml，antibio-des-ab12ng/ml，antibio-np-ab14ng/ml，并将其混合于pcr管中，保证混合后的总体积为50μl(保证每个反应孔中包含每种微球2000个)，并设有空白对照、阴性对照和阳性对照。37℃振荡温育15min。(2)加入一系列含有五种靶标物的混合液，浓度范围为0.001～100ng/ml，保证混合液总体积为50μl，37℃振荡温育15min，进行竞争反应。(3)洗板机洗3次后，加入100倍稀释的sa-pe溶液(稀释后浓度10μg/ml)50μl，37℃振荡温育30min。洗板机洗3次。(4)按照正常程序打开悬浮芯片仪，预热30min，并根据选择是否校正。(5)反应孔中加入100μl鞘液放入检测平台，通过配套软件获取检测后的mfi。(6)通过提取后的mfi值进行处理和分析，绘制出同时检测五种内分泌干扰物的多通道标准曲线，如图5所示，标准曲线的方程如表1所示。表1edcs方程r2检出限(ng/ml)e2y＝22.89+3093.11/1+(x/0.01431)-0.38970.99790.0010e3y＝114.1+3746.9/1+(x/0.006031)-0.43340.99860.0038bpay＝160.2+8009.8/1+(x/0.009975)-0.35810.99920.0070desy＝66.49+6648.51/1+(x/0.02823)-0.44620.99940.0068npy＝258.0+6803/1+(x/0.04607)-0.27530.99720.0235实施例6同时检测实际样品牛奶和自来水中五种内分泌干扰物悬浮芯片方法的建立利用已偶联完全抗原的微球，确定的五种内分泌干扰物单克隆抗体最佳浓度以及绘制出的同时检测五种内分泌干扰物的多通道标准曲线进行实验。具体步骤如下：(1)选取自来水和牛奶，牛奶离心取上清。所有样品在试验前均经0.22μm微滤膜过滤。(2)自来水和牛奶用稀释液(0.1mpbs)进行一定比例的稀释，作为阴性处理液，并分别用两种阴性样液作为稀释液绘制多通道的标准曲线的绘制。通过对mfi0(阳性对照)和ic50(半抑制率)的比对，判断是否可用悬浮芯片对自来水和牛奶中的五种内分泌干扰物进行检测。(3)从结果判断自来水和牛奶中各自的阴性样液对mfi0和ic50的影响(表2)后可知：实际样品处理后作为阴性样液对不同内分泌干扰物的mfi0值有一定的影响，但对ic50值影响不明显，所以自来水和牛奶中阴性样液可替代缓冲液(0.1mpbs)作为各自的稀释液，从而用悬浮芯片法绘制的多通道竞争标准曲线，见图6和图7，可知，这些曲线的竞争趋势与以抗体稀释液为基质绘出的竞争曲线趋势差别不大，相关参数见表2。表2由此可见，悬浮芯片法检测五种内分泌干扰物的灵敏度可达到pg～ng级水平。实施例7悬浮芯片法检测自来水和牛奶的准确性和重复性研究主要从对实际样品的加标回收实验判定方法的准确性和重复性，具体步骤如下：(1)吸取一定量的自来水和牛奶，按一定浓度同时添加五种内分泌干扰物标准品，混匀后，经0.22μm微滤膜过滤。(2)用稀释液(0.1mpbs)对其进行一定比例的稀释，作为加标溶液。按照实施例6进行加标检测，通过自来水和牛奶中阴性样液绘制的多通道标准曲线进行计算，评价在自来水和牛奶中悬浮芯片法的重复性和准确性。实际样品的加标检测结果见表3。表3由表3可知，可知实际样品的加标回收率均在85％～110％范围内，且变异系数均小于17％。表明所建立的悬浮芯片法准确性高，重复性好。由此得出，本发明实施例的方法可以快速、准确有效的检测水中五种内分泌干扰物的含量。实施例8试剂盒试剂盒的组成如表4所示。表4试剂盒的使用方法为：1、从微球管取适量液体，稀释至微球浓度为2×105beads/ml，保证微球浓度为2000个/10μl。2、从sa-pe管取适量液体稀释至10μg/ml；3、用0.1mpbs润洗96孔板；4、在96孔板上的每孔加入稀释后的微球10μl、抗体管中溶液10μl，37℃振荡温育15min；5、加入待测样品10μl进行竞争性反应，37℃振荡温育15min；洗板机清洗3次；6、加入稀释后的sa-pe50μl，振荡温育30min；洗板机洗3次；7、按照正常程序打开悬浮芯片仪，预热30min，并根据选择是否校正；8、反应孔中加入100μl鞘液放入检测平台，通过配套软件获取检测后的mfi；9、通过提取后的mfi值进行处理和分析，根据表1中的方程计算出检测浓度。本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。当前第1页12