一种用于流式荧光分析系统的分析方法及设备与流程

本发明涉及医疗中的流式荧光分析领域，尤其涉及的是一种用于流式荧光分析系统的分析方法及设备。

背景技术：

传统的流式细胞仪(包括血细胞分析仪)是一种能快速定量分析细胞群的物理或化学性质，并可依据这些特征信号差异精确分选细胞的仪器。流式细胞仪检测每个细胞受激光照射后的散射光信号和荧光激发信号，以反映细胞的物理特性和生化特征，如细胞的大小、活性、颗粒度、核酸的数量以及抗原分子的表达情况等。

流式荧光检测技术是一种基于流式细胞仪的检测原理，以微球代替细胞，利用抗原抗体特异性结合后产生的荧光作为信号，来检测样本中特定物质的免疫检测技术。这种技术和化学发光相似，通过在微球上包被捕获抗体，用于捕获样本中的目标蛋白(或多肽)，再利用荧光标记的检测抗体产生的荧光强度计算出目标蛋白的浓度。近年来，流式荧光检测技术在临床上被广泛应用。例如，利用双抗体夹心法测定大分子的肿瘤标志物、细胞因子和病原体抗体，以及利用竞争法检测小分子的激素和药物浓度，相关项目的检测可以为临床疾病的诊断、治疗和预后提供有力依据。

流式荧光检测技术涉及荧光编码微球和流式荧光检测两个核心技术。荧光编码微球技术通过在微球中掺入一种或几种不同浓度的荧光素或量子点，使微球带有不同强度和颜色的荧光，形成一系列编码微球阵列。在同一个试管，加入多种不同的荧光编码微球和样本反应，每种微球仅与特定的待测物结合，相互之间很少发生干扰。分离后的检测物在流式细胞仪上进行检测，由于每种微球均可独立用于一种指标的测定，因此可在一个试管内实现几个甚至几十个项目的高通量联检。

基于流式荧光检测系统主要分为硬件和数据分析两个子系统，分析子系统往往包含三个部分：数据采集、标准曲线的建立以及浓度点的计算。而传统的流式细胞仪一般只提供关于粒子的百分比、个数以及发光强度等传统统计量等，无法进行标准曲线的计算，同时也无法提供检测项目的浓度统计量。例如，现有的流式细胞仪用流式荧光法来进行免疫类的检测除了需要一套传统的采集数据的软件外，还需要一套专门用于分析流式荧光免疫类检测的数据的软件(如fcap等)，而且所有的流式荧光分析软件都无法实现自动分析。

因此现有的方法为在流式细胞仪配套采集软件上采集数据，然后导出特定格式的数据，再将导出的数据导入到流式荧光免疫类检测的分析软件中，进行手动画门分析等操作，最后出结果，从数据采集到完成数据分析是两个独立的系统。这其中的缺陷有：1、需要两个独立的软件，导出导入操作繁琐；2、流式数据格式有多种版本，数据的兼容性上有问题，可能某些仪器的数据无法导入到流式荧光免疫检测的专用分析软件中；3、流式荧光免疫检测试剂种类众多，流式荧光免疫检测分析软件无法覆盖所有种类，往往只能针对特定公司的相关试剂；4、需要手动画门、建立标准曲线等分析操作，对操作人员的技术要求较高。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简单、兼容性强、适用范围广的用于流式荧光分析系统的分析方法。

本发明的技术方案如下：一种用于流式荧光分析系统的分析方法，包括如下步骤：

s1、免疫检测标准浓度曲线建立；

其中，步骤s1还包括步骤：

s11、标准样本数据采集：根据流式荧光数据采集，提供相对应检测项目的标准曲线模板，完成标准样本数据采集；

s12、标准曲线生成：在相对应检测项目的标准曲线模板中，所有相对应检测项目采集的样本都显示在模板中，当选中若干个样本中的某一个样本，将自动分析生成标准曲线；

s2、测试样本浓度自动计算：根据测试样本浓度的荧光值以及步骤s1中的标准曲线，得到测试样本浓度值。

采用上述技术方案，所述的用于流式荧光分析系统的分析方法中，步骤s11中，还包括如下步骤：

s111、读取数据：读取选中的标准样本在样本数据采集模块中采集的数据；

s112、自动画门分析或者手动画门分析：

自动画门分析包括在前散fsc通道和侧散ssc通道生成的散点图上圈出主团，以及在编码通道散点图上圈出相应的编码团，其中编码通道和编码通道散点图上粒子团个数由相对应的免疫检测试剂确定，取得门内的测试通道的数据，计算其中位数为其荧光值，荧光值自动输入分析软件系统中；

手动画门分析通过流式荧光分析手动画门，画门后系统计算统计值，再将计算的荧光值手动收入分析软件系统中。

采用上述各个技术方案，所述的用于流式荧光分析系统的分析方法中，步骤s12中，还包括如下步骤：

s121、曲线拟合：根据系统预设的最高浓度以及浓度梯度，生成浓度梯度点，对浓度梯度点和画门分析得到的荧光值，进行曲线拟合，其中x轴为荧光值，y轴为浓度梯度点；

s122、保存显示：将拟合结果在图形中显示，同时保存到计算机中方便测试样本数据计算时调用。

采用上述各个技术方案，所述的用于流式荧光分析系统的分析方法中，步骤s2中，在测试样本界面得到测试样本数据，通过自动画门分析或者手动画门分析得到测试样本的荧光值。

采用上述各个技术方案，所述的用于流式荧光分析系统的分析方法中，步骤s111中，标准样本包含至少一个试管，若有多个试管，对每个试管的数据分别进行读取。

采用上述各个技术方案，所述的用于流式荧光分析系统的分析方法中，前散fsc通道和侧散ssc通道的自动画门以及编码通道的自动画门采用基于图像的处理方法。

采用上述各个技术方案，所述的用于流式荧光分析系统的分析方法中，基于图像的处理方法为图像形态学方法或图像分割算法。

采用上述各个技术方案，本发明设置两个步骤，免疫检测标准浓度曲线的建立以及测试样本浓度的自动计算，通过自动画门分析很容易就能得到标准样本和测试样本的荧光值，若自动画门失败可以采用手动画门分析，方便操作，兼容性强、适用范围广。

附图说明

图1为本发明的主要步骤示意图；

图2为本发明的主要步骤详细内容示意图；

图3为本发明的免疫检测标准曲线步骤图；

图4为本发明的自动画门示意图；

图5为本发明的测试样本浓度计算步骤图；

图6为本发明的标准曲线建立实施例示意图；

图7为图6左侧放大示意图；

图8为图6右侧放大示意图；

图9为本发明的测试样本浓度实施例示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

如图1和图2，本发明提供了一种用于流式荧光分析系统的分析方法，主要是将流式荧光免疫检测自动分析方法集成到传统的数据采集软件中，构成了一个完整的流式荧光分析系统。本发明主要涉及两个方面：免疫检测标准浓度曲线建立以及测试样本浓度自动计算。测试样本浓度可以是抗原浓度、蛋白浓度或者细胞因子浓度等，本发明以细胞因子浓度进行说明，抗原浓度和蛋白浓度的测试原理相同，在此不做过多的赘述。

步骤s1为免疫检测标准浓度曲线建立，主要包括两个部分：

s11、标准样本数据采集：根据流式荧光数据采集，提供相对应检测项目的标准曲线模板，完成标准样本数据采集。标准样本中可包含一个或多个试管数据，取决于相关检测项目试剂浓度梯度设置。

s12、标准曲线生成：在相对应检测项目的标准曲线模板中，所有相对应检测项目采集的样本都显示在模板中，当选中若干个样本中的某一个样本，将自动分析生成标准曲线。

步骤s2为测试样本浓度自动计算：根据测试样本浓度的荧光值以及步骤s1中的标准曲线，得到测试样本浓度值。

优选的，如图3和图4，步骤s12标准曲线建立的具体过程为：

s121、读取数据：读取选中的标准样本在样本数据采集模块中采集的数据。标准样本包含至少一个试管，若有多个试管，对每个试管的数据分别进行读取。此处的读取数据为现有技术的流式荧光分析中的数据采集方法。

s122、自动画门分析或者手动画门分析：本发明中设置两种画门方式，优先考虑的画门方式为自动画门，当自动画门不成功或者用户对自动画门不满意时才考虑手动画门。

自动画门分析包括在前散fsc通道和侧散ssc通道生成的散点图上标注出主团，以及在编码通道散点图上标注出相应的编码团，其中编码通道和编码通道散点图上粒子团个数由相对应的免疫检测试剂确定，取得门内的测试通道的数据，计算其中位数为其荧光值，荧光值自动输入分析软件系统中。

其中，前散fsc通道和侧散ssc通道的自动画门以及编码通道的自动画门采用基于图像的处理方法，比如图像形态学方法或图像分割算法，如分水岭算法等。

手动画门分析通过流式荧光分析手动画门，画门后系统计算统计值，再将计算的荧光值手动收入分析软件系统中。

优选的，如图3和图4，步骤s12标准曲线建立的具体过程还包括：

s123、曲线拟合：根据系统预设的最高浓度以及浓度梯度，生成浓度梯度点，对浓度梯度点和画门分析得到的荧光值，进行曲线拟合，其中x轴为荧光值，y轴为浓度梯度点。采用的拟合公式除了常用的四参数拟合和五参数拟合外，也可以用户自定义。拟合算法可采用常用的最小二乘算法及其改进，如levenberg-marquardt算法等。

s124、保存显示：将拟合结果在图形中显示，同时保存到计算机中方便测试样本数据计算时调用。

优选的，如图5，步骤s2中，对测试样本的细胞因子浓度计算具体过程为：在测试样本界面得到测试样本数据，通过自动画门分析或者手动画门分析得到测试样本的荧光值。此过程中的自动画门分析或者手动画门分析与前述标准曲线建立所采用的方法一样，圈出各团细胞因子，然后计算各团细胞因子的荧光值。

通过标准曲线可知，x轴为荧光值，y轴为浓度梯度点，因此，当得到测试样本的细胞因子荧光值，将荧光值代入标准曲线，即可得到对应的细胞因子浓度值。

一种流式荧光分析设备，用于上述流式荧光分析方法，包括免疫检测标准浓度曲线建立模块和测试样本浓度自动计算模块：

所述免疫检测标准浓度曲线建立模块包括：标准样本数据采集模块以及标准曲线生成模块；所述标准样本数据采集模块根据流式荧光数据采集，提供相对应检测项目的标准曲线模板，完成标准样本数据采集；所述标准曲线生成模块，在相对应检测项目的标准曲线模板中，所有相对应检测项目采集的样本都显示在模板中，当选中若干个样本中的某一个样本，将自动分析生成标准曲线；

所述测试样本浓度自动计算模块：根据测试样本浓度的荧光值以及步骤s1中的标准曲线，得到测试样本浓度值。

进一步的，还包括液路、光学传感器、存储器以及处理器；

液路，被配置为容纳测试样本；

光学传感器，被配置为对所述液路中的测试样本发射激光并收集来自所述测试样本的光学反馈，以提供流式荧光数据采集；

存储器，存储有被执行时进行自动分析以获取测试样本浓度值的计算机可执行指令；

处理器，被配置为在执行上述计算机可执行指令时，可进行上述的流式荧光分析方法。

通过上述方法方法步骤和设备，提供两个实施例进行进一步说明。

实施例一

如图6～8，在流式荧光的分析系统中提供单独一个模块用于免疫检测项目(例如，细胞因子分析)的标准曲线分析。每一组拟合曲线中，左侧列表为用户实时采集的细胞因子曲线样本数据，该样本根据试剂浓度梯度要求，包含多个浓度点和多个细胞因子的测试数据。用户通过点击该样本，系统将自动解析该样本数据，进行自动画门分析操作，计算得到各个细胞因子团的各个浓度点的荧光值，将其显示于右侧各个细胞因子的荧光值框中。然后对各个细胞因子的浓度值和荧光值进行曲线拟合，根据用户选择的拟合方法，拟合得到拟合参数以及误差、曲线等，将其显示于界面上，用户可根据拟合结果判断是否采用这一组结果，若觉得结果不满意，可在荧光值框中手动输入自己画门分析得到的荧光值，并点拟合，得到相应的拟合结果以及曲线。

系统将自动保存当前用户选择的样本生成的标准曲线，作为后续测试样本使用。用户可通过点击左侧样本决定采用哪组标准曲线。

实施例二

如图9，当用户测试某一个样本(例如，细胞因子样本)时，分析系统将通过自动算法，自动圈出各个细胞因子团，并根据存储的曲线，自动计算得到各个细胞因子的浓度值，将结果显示于报告中。同时用户可手动调整各个门，浓度结果将相应改变，得到用户想要的结果。

采用上述各个技术方案，本发明设置两个步骤，免疫检测标准浓度曲线的建立以及测试样本浓度的自动计算，通过自动画门分析很容易就能得到标准样本和测试样本的荧光值，若自动画门失败可以采用手动画门分析，方便操作，兼容性强、适用范围广。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。