用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒及其制备方法与流程

[0001]
本发明属于肿瘤相关标志物体外诊断技术领域，具体涉及一类用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒及其制备方法。


背景技术：

[0002]
在癌症发病率的排行榜上，肺癌居首位。因肺癌早期就发生扩散且通常在晚期被查出，所以患者的5年生存率很低。提高肺癌生存率最有效的方法就是早发现和早治疗。肺癌筛查技术包括影像学和肿瘤标志物，随着胸部计算机断层扫描检查(computed tomography，ct)，尤其是低剂量薄层ct(ldct)筛查项目在中国的广泛开展，越来越多的无症状肺部磨玻璃结节(ground glassnodules，ggns)被发现。假性结节的大量检出是ldct筛查亟待解决的问题，需要其它辅助手段加以补充。肺癌的血液肿瘤相关标志物主要有神经元特异性烯醇化酶(nse)、鳞状上皮细胞癌抗原(scc)、癌胚抗原(cea)、细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)和胃泌素释放太前体(progrp)，但是这些标志物在肺癌晚期阳性率增加，在肺癌早期不敏感。研究发现，肺癌自身抗体能在肺癌临床诊断之前5年被发现，国内一项针对肺癌早期血液生物标志物包括p53、黑色素瘤抗原(magea1)、g抗原(gage7)、肿瘤相关基因(cage)、atp结合rna解旋酶(gbu4-5)、性别决定基因家族成员2(sox2)和蛋白基因产物 9.5(pgp9.5)的自身抗体的研究，共计纳入肺癌患者818例，结果显示肺癌组抗体浓度高于肺部良性疾病组，总体敏感性达61％，特异性达90％，研究结果表明，自身抗体谱检测可能是一项十分有价值肺癌早筛工具，可辅助影像学检验，提高早期肺癌诊断的准确率。
[0003]
吖啶酯在免疫化学发光分析中的应用始于1979年，吖啶酯可以分为两大类：酰胺类和dmae类，二者发光性能相近。吖啶酯化学发光为闪光型，在加入启动剂0.4s后发射光强度达到最大，半衰期为0.9s，2s内发光基本结束，可以实现快速检测。吖啶酯标记工艺简单，标记反应一步完成，发光过程只需要在碱性条件下，经过氧化氢氧化就可以直接发光，不需要其它发光催化剂。链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，它能与生物素发生特异性结合，它们之间的结合力是目前已知的最强的非共价键结合力。链霉亲和素以同源四聚体的形式存在，每摩尔的四聚体分子可结合四摩尔的生物素分子，所以在免疫检测领域具有信号放大作用。


技术实现要素：

[0004]
针对现有肺癌影像学诊断技术假性结节出现的不足，本发明提供一类用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒及其制备方法。
[0005]
为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006]
本发明提供一种用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒，包括：
[0007]
链霉亲和素磁珠；
[0008]
吖啶酯标记的抗体或抗原；
[0009]
生物素标记的抗原；
[0010]
所述抗体为抗人igg抗体，抗原均为p53抗原、magea1抗原、gage7 抗原、cage抗原、gbu4-5抗原、sox2抗原或pgp9.5抗原。
[0011]
优选的是，所述试剂盒包括磁颗粒反应液r1、吖啶酯标记物反应液r2和生物素标记物反应液r3；
[0012]
所述磁颗粒反应液r1包括链霉亲和素磁珠、第一表面活性剂、氯化钠、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂；
[0013]
所述吖啶酯标记物反应液r2包含吖啶酯标记的抗原、氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂；
[0014]
或者，吖啶酯标记物反应液r2包含吖啶酯标记的抗人igg抗体、氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂；
[0015]
所述生物素标记物反应液r3包含生物素标记的抗原、氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂。
[0016]
更优选的是，所述磁颗粒反应液r1中，链霉亲和素磁珠的浓度为0.01wt％-0.2wt％；链霉亲和素磁珠的粒径为0.1-5μm。
[0017]
更优选的是，所述吖啶酯标记物反应液r2中，吖啶酯标记的抗原或吖啶酯标记的抗人igg抗体的浓度分别为0.01-2μg/ml；抗原或抗人igg抗体与吖啶酯按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记；吖啶酯为n-羟基丁二酰亚胺(nhs)
-ꢀ
吖啶酯，结构式如式ⅰ所示：
[0018][0019]
式ⅰ中，r1为
[0020]
r2和r3独立地选自：h、中的一种，n＝1-12；
[0021]
r4为n＝1-12；
[0022]
r5为
[0023]
更优选的是，所述生物素标记物反应液r3中，生物素标记的抗原的浓度为 0.05-5μg/ml；抗原和生物素按照摩尔浓度1:(1-50)的比例进行标记；生物素的结构式如式ⅱ或式ⅲ所示：
[0024][0025]
式ⅱ和式ⅲ中，n＝1-13。
[0026]
更优选的是，所述第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液独立的选自2-(n
-ꢀ
吗啡啉)乙磺酸(mes)、哌嗪-nn-双(2-乙磺酸)(pipes)、3-(n-码啡基)-2
-ꢀ
羟基丙磺酸钠(mopso)、tris-盐酸、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷 (bistris)、磷酸盐(pb)或4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，ph分别为5.0-8.5，浓度分别为10-600mmol/l；ph分别为5.0-8.5，第一缓冲液在磁颗粒反应液r1 中的浓度为10-600mmol/l，第二缓冲液在吖啶酯标记物反应液r2中的浓度为 10-600mmol/l，第三缓冲液在生物素标记物反应液r3中的浓度为 10-600mmol/l。
[0027]
更优选的是，所述第一防腐剂、第二防腐剂和第三防腐剂独立的选自nan3、 proclin 300或proclin 950，第一防腐剂在磁颗粒反应液r1中的质量浓度为 0.01％-1％，第二防腐剂在吖啶酯标记物反应液r2中的质量浓度为0.01％-1％，第三防腐剂在生物素标记物反应液r3中的质量浓度为0.01％-1％。
[0028]
更优选的是，所述第一表面活性剂、第二表面活性剂和第三表面活性剂独立的选自吐温、聚乙二醇、泊洛沙姆、曲拉通或氯化胆碱，第一表面活性剂在磁颗粒反应液r1中的质量浓度为0.01％-2％，第二表面活性剂在吖啶酯标记物反应液r2中的质量浓度为0.01％-2％，第三表面活性剂在生物素标记物反应液 r3中的质量浓度为0.01％-2％。
[0029]
更优选的是，所述第一蛋白稳定剂、第二蛋白稳定剂和第三蛋白稳定剂独立的选自牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白、牛血清gamma球蛋白(bgg)、卵蛋白、鱼蛋白中的一种或几种，质量浓度分别为0.1％-5％；第一蛋白稳定剂在磁颗粒反应液r1中的质量浓度为0.1％-5％，第二蛋白稳定剂在吖啶酯标记物反应液r2中的质量浓度为0.1％-5％，第三蛋白稳定剂在生物素标记物反应液r3中的质量浓度为0.1％-5％。
[0030]
本发明还提供上述用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒
的制备方法，包括：
[0031]
步骤一、磁颗粒反应液r1的制备
[0032]
将第一表面活性剂、氯化钠、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂混合，配制成r1基础缓冲液；
[0033]
取链霉亲和素磁珠，用ph7.2的pbs缓冲液清洗，然后将磁珠重悬至r1 基础缓冲液中，配成磁颗粒反应液r1；
[0034]
步骤二、吖啶酯标记物反应液r2的制备
[0035]
将氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂混合，配制成r2基础缓冲液；
[0036]
取吖啶酯标记的抗原或吖啶酯标记的抗人igg抗体置于r2基础缓冲液中，配成吖啶酯标记物反应液r2；
[0037]
步骤三、生物素标记物反应液r3的制备
[0038]
将氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂混合，配制成r3基础缓冲液；
[0039]
取生物素标记的抗原置于r3基础缓冲液中，配成生物素标记物反应液r3。
[0040]
本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的检测原理：
[0041]
(1)双抗原夹心法原理
[0042]
试剂盒包括链霉亲和素磁颗粒、吖啶酯标记的抗原和生物素标记的抗原；如图1所示，吖啶酯标记的抗原、生物素标记的抗原与自身抗体的反应表位不同，吖啶酯标记的抗原、生物素标记的抗原与样本中的自身抗体发生免疫反应，进一步通过生物素链霉亲和素连接桥固定在磁珠表面，磁珠在化学发光分析仪的磁场下固定在反应杯的特定区域，清洗掉干扰物质后，使用酸和碱激发吖啶酯发光，样本中的自身抗体含量与系统所检测的相对光单位(rlu)成正比。
[0043]
(2)间接法原理
[0044]
试剂盒包括链霉亲和素磁颗粒，吖啶酯标记的抗人igg抗体和生物素标记的抗原；如图2所示，吖啶酯标记的抗人igg抗体、生物素标记的抗原与样本中的自身抗体发生免疫反应，进一步通过生物素链霉亲和素连接桥固定在磁珠表面，磁珠在化学发光分析仪的磁场下固定在反应杯的特定区域，清洗掉干扰物质后，使用酸和碱激发吖啶酯发光，样本中的自身抗体含量与系统所检测的相对光单位(rlu)成正比。
[0045]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0046]
本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒，基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系，测试原理可以是双原夹心法或间接法，利用化学发光分析仪进行样本检测，根据吖啶酯发光强度 (rlu)和被测物浓度的标准曲线，即可以实现被测物的定性分析。
[0047]
本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒，针对肺癌影像学(ldct)筛查出现的假性结节无法鉴别的问题，补充检测患者血液中的p53、magea1、gage7、cage、gbu4-5、sox2和pgp9.5的自身抗体，进行肺癌的风险评估。该方法可提高早期肺癌的检测灵敏度和特异性，是肺癌筛查的重要辅助手段。
附图说明
[0048]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0049]
图1为本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的以双抗原夹心法检测的检测原理示意图；
[0050]
图2为本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的以间接法试剂盒检测的检测原理示意图；
[0051]
图中，表示链霉亲和素磁颗粒，表示生物素标记的抗原，表示自身抗体(被测物)，表示吖啶酯标记的抗原，表示吖啶酯标记的抗人igg抗体。
具体实施方式
[0052]
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
[0053]
本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒，包括：链霉亲和素磁珠、吖啶酯标记的抗体或抗原和生物素标记的抗原。其中，抗体为抗人igg抗体，抗原均为p53抗原、magea1抗原、gage7抗原、cage 抗原、gbu4-5抗原、sox2抗原或pgp9.5抗原。优选，包括磁颗粒反应液r1、吖啶酯标记物反应液r2和生物素标记物反应液r3；磁颗粒反应液r1包括链霉亲和素磁珠、第一表面活性剂、氯化钠、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂；吖啶酯标记物反应液r2包含吖啶酯标记的抗原、氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂；或者，吖啶酯标记物反应液 r2包含吖啶酯标记的抗人igg抗体，氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂；生物素标记物反应液r3包含生物素标记的抗原、氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂。
[0054]
上述技术方案，磁颗粒反应液r1中，链霉亲和素磁珠的浓度优选为 0.01wt％-0.2wt％；链霉亲和素磁珠的粒径优选为0.1-5μm，粒径为1-3μm。
[0055]
上述技术方案，吖啶酯标记物反应液r2中，吖啶酯标记的抗原或吖啶酯标记的抗人igg抗体的浓度分别为0.01-2μg/ml；抗原或抗人igg抗体与吖啶酯按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记；吖啶酯为n-羟基丁二酰亚胺(nhs)-吖啶酯，结构式如式ⅰ所示：
[0056][0057][0058]
式ⅰ中，r1为
[0059]
r2和r3独立地选自：h、中的一种，n＝1-12；
[0060]
r4为n＝1-12；
[0061]
r5为
[0062]
上述技术方案，生物素标记物反应液r3中，生物素标记的抗原的浓度为 0.05-5μg/ml；抗原和生物素按照摩尔浓度1:(1-50)的比例进行标记；生物素的结构式如式ⅱ或式ⅲ所示：
[0063][0064]
式ⅱ或式ⅲ，n＝1-13。
[0065]
上述技术方案中，第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液独立的选自2-(n
-ꢀ
吗啡啉)乙磺酸(mes)、哌嗪-nn-双(2-乙磺酸)(pipes)、3-(n-码啡基)-2
-ꢀ
羟基丙磺酸钠(mopso)、tris-盐酸、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷 (bistris)、磷酸盐(pb)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，ph分别为5.0-8.5，在各自反应液中的浓度分别为10-600mmol/l。
[0066]
上述技术方案中，第一防腐剂、第二防腐剂和第三防腐剂独立的选自nan3、proclin 300或proclin 950，质量浓度分别为0.01％-1％。
[0067]
上述技术方案中，第一表面活性剂、第二表面活性剂和第三表面活性剂独立的选自吐温、聚乙二醇、泊洛沙姆、曲拉通和氯化胆碱，在各自反应液中的质量浓度分别为0.01％-2％。
[0068]
上述技术方案中，第一蛋白稳定剂、第二蛋白稳定剂和第三蛋白稳定剂独立的选自牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白、牛血清gamma球蛋白(bgg)、卵蛋白、鱼蛋白中的一种或几种，在各自反应液中的质量浓度分别为0.1％-5％。
[0069]
上述技术方案，在磁颗粒反应液r1、吖啶酯标记物反应液r2和生物素标记物反应液r3中，氯化钠的摩尔浓度均为0.15mol/l；
[0070]
上述技术方案中，试剂盒还可以包括校准品，校准品是校准函数中用做独立变量值的参考物质，包含两个到多个浓度水平，用于定量检测时对检测项目的校准。
[0071]
本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的制备方法，包括：
[0072]
步骤一、磁颗粒反应液r1的制备
[0073]
将第一表面活性剂、氯化钠、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂混合，配制成r1基础缓冲液；
[0074]
取链霉亲和素磁珠，用ph7.2的pbs缓冲液清洗，然后将磁珠重悬至r1 基础缓冲液中，配成质量浓度为0.01％-0.2％的r1反应液，pbs缓冲液包括 20mmol/l pb与150mmol/l氯化钠；
[0075]
步骤二、吖啶酯标记物反应液r2的制备
[0076]
将氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂混合，配制成r2基础缓冲液；
[0077]
取吖啶酯标记的抗原或吖啶酯标记的抗人igg抗体置于r2基础缓冲液中，配成浓度为0.01-2μg/ml的吖啶酯标记物反应液r2；
[0078]
步骤三、生物素标记物反应液r3的制备
[0079]
将氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂混合，配制成r3基础缓冲液。
[0080]
取生物素标记的抗原置于r3基础缓冲液中，配成浓度为0.05-5μg/ml的生物素标记物反应液r3。
[0081]
步骤四、校准品的制备
[0082]
校准品的制备根据被测物(自身抗体)的不同，按照本领域技术人员常规方法制备即可，被测物为p53、magea1、gage7、cage、gbu4-5、sox2或pgp9.5。
[0083]
本发明的用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的检测方法，具体包括：
[0084]
双抗原夹心检测方法1
[0085]
第一步，将样本、生物素标记物反应液r3、吖啶酯标记物反应液r2(含吖啶酯标记的抗原)加入反应杯中，孵育0-25min；第二步，加入磁颗粒反应液 r1孵育5-25min；第三步，加入清洗液清洗；第四步，将预激发液(过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加
入到反应混合物中，激发发光反应。采用化学发光分析仪测量产生的光量子数，样本中被测物的含量与光量子数成正比。
[0086]
双抗原夹心检测方法2
[0087]
第一步，将样本、生物素标记物反应液r3、磁颗粒反应液r1加入反应杯中，孵育0-25min；第二步，加入吖啶酯标记物反应液r2(含吖啶酯标记的抗原)孵育5-25min；第三步，加入清洗液清洗；第四步，将预激发液(过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加入到反应混合物中，激发发光反应。采用化学发光分析仪测量产生的光量子数，样本中被测物的含量与光量子数成正比。
[0088]
间接法检测方法
[0089]
第一步，将样本、生物素标记物反应液r3和磁颗粒反应液r1加入反应杯中，孵育0-25min；第二步，加入清洗液清洗；第三步，加入吖啶酯标记物反应液r2(吖啶酯标记的抗人igg抗体)孵育5-25min；第四步，加入清洗液清洗；第五步，将预激发液(过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加入到反应混合物中，激发发光反应。采用化学发光分析仪测量产生的光量子数，样本中被测物的含量与光量子数成正比。
[0090]
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。
[0091]
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
[0092]
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0093]
实施例1
[0094]
1.1用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的组成
[0095][0096][0097]
1.2用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的制备方法
[0098]
步骤一、磁颗粒反应液r1的制备
[0099]
将第一表面活性剂、氯化钠、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂混合，配制成r1基础缓冲液；
[0100]
取链霉亲和素磁珠，粒径为3μm，用ph7.2的pbs缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至的r1基础缓冲液中，配成磁珠质量浓度为0.2％的磁颗粒反应液 r1。
[0101]
步骤二、吖啶酯标记物反应液r2的制备
[0102]
将氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂混合，配制成r2基础缓冲液；
[0103]
取吖啶酯标记的抗原于r2基础缓冲液中，配成抗原浓度浓度为0.2μg/ml 的吖啶酯标记物反应液r2。
[0104]
步骤三、生物素标记物反应液r3的制备
[0105]
将氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂混合，配制成r3基础缓冲液；
[0106]
取生物素标记的抗原于r3基础缓冲液中，配成浓度为0.7μg/ml的生物素标记物反应液r3。
[0107]
1.3用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的检测方法
[0108]
双抗原夹心方法1：第一步，将50μl样本、60μl生物素标记物反应液r3 和60μl吖啶酯标记物反应液r2加入反应杯中，孵育5min；第二步，加入50μl 磁颗粒反应液r1孵育10min；第三步，加入清洗液清洗；第四步，将预激发液 (过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加入到反应混合物中，激发发光反应，使用化学发光分析仪测量产生的光量子数。
[0109]
双抗原夹心检测方法2
[0110]
双抗原夹心方法2：第一步，将50μl样本、60μl生物素标记物反应液r3 和60μl磁颗粒反应液r1加入反应杯中，孵育15min；第二步，加入吖啶酯标记物反应液r2孵育5min；第三步，加入清洗液清洗；第四步，将预激发液(过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加入到反应混合物中，激发发光反应，使用化学发光分析仪测量产生的光量子数。
[0111]
经检测，实施例1的试剂盒的线性>0.99，重复性>5％，回收>85％。
[0112]
注：试剂盒所用抗原根据检测自身抗体的不同而分为p53、magea1、 gage7、cage、gbu4-5、sox2和pgp9.5。
[0113]
实施例2
[0114]
1.1用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的组成
[0115][0116]
1.2用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的制备方法
[0117]
步骤一、磁颗粒反应液r1的制备
[0118]
将第一表面活性剂、氯化钠、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂混合，配制成r1基础缓冲液；
[0119]
取链霉亲和素磁珠，粒径1μm，用ph7.2的pbs缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至的r1基础缓冲液中，配成质量浓度为0.01％的磁颗粒反应液r1。
[0120]
步骤二、吖啶酯标记物反应液r2的制备
[0121]
将氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂混合，配制成r2基础缓冲液；
[0122]
取吖啶酯标记的抗人igg抗体于r2基础缓冲液中，配成抗体浓度为1μg/ml 的吖啶酯标记物反应液r2。
[0123]
步骤三、生物素标记物反应液r3的制备
[0124]
将氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂混合，配
制成r3基础缓冲液；
[0125]
取生物素标记的抗原r3基础缓冲液中，配成浓度为4μg/ml的生物素标记物反应液r3。
[0126]
1.3用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒的检测方法双抗原夹心检测方法2
[0127]
第一步，将50μl样本、90μl磁颗粒反应液r1、90μl生物素标记物反应液r3加入反应杯中，孵育20min；第二步，在反应杯中继续加入70μl吖啶酯标记物反应液r2孵育5min；第三步，加入清洗液，清洗五次；第四步，将将预激发液(过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加入到反应混合物中，激发发光反应。测量产生的光量子数，样本中被测物的含量与光量子数成正比。
[0128]
间接法检测方法
[0129]
第一步，将样本、生物素标记物反应液r3、磁颗粒反应液r1加入反应杯中，孵育0-25min；第二步，加入清洗液清洗；第三步，加入吖啶酯标记物反应液r2孵育5-25min；第四步，加入清洗液清洗；第五步，将将预激发液(过氧化氢和硝酸溶液)和激发液(氢氧化钠溶液)加入到反应混合物中，激发发光反应。采用化学发光分析仪测量产生的光量子数，样本中被测物的含量与光量子数成正比。
[0130]
经检测，实施例2的试剂盒的线性>0.99，重复性>5％，回收>85％。
[0131]
注：试剂盒所用抗原根据检测自身抗体的不同而分为p53、magea1、 gage7、cage、gbu4-5、sox2和pgp9.5。
[0132]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。