一种磁性微球介导的包被微球生化检测系统的制作方法

1.本发明涉及生物医学诊断领域的液相免疫或配位体检测技术，具体地说，是关于一种磁性微球介导包被微球生化检测系统及其检测方法。。


背景技术：

2.免疫分析技术利用抗原与抗体之间高特异性的识别和结合反应实现生物分子的检测，具备灵敏度高、特异性强、适用面广、所需设备简单、线性范围较宽等优点，已成为当今最具竞争力和挑战性的分析测试技术之一，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。
3.检测用试剂与被检物质具有相关结构因而二者能够特异性识别并结合，常用如：针对被检物质（抗原）的抗体（多克隆抗体，单克隆抗体），还可以是单克隆抗体的一部分肽段或利用抗原表位在噬菌体肽库中筛到的高结合肽。以结构的互补识别为基础，具有高度特异性和灵敏性的一对物质，定义二者的关系互为配位体（关系）。在给定条件下的互为配位体的物质a、b和复合物ab的浓度平衡关系是在一定范围内，复合物浓度与每个的游离态浓度成正比：[ab] =k[a][b]，k是常数。复合物ab具有一定稳定性，可以在适当的纯化过程中不发生解离。
[0004]
被检物质的信号来自于标记试剂，具体是复合物中的结合态标记试剂。在一定的被检物质浓度及检测试剂浓度下，结合态标记试剂所占比例与被测物质的量具有简单的关系。
[0005]
酶标板包被蛋白（通常是抗原或抗体）增强了蛋白的稳定性，酶标板上包被的用于识别被检物质的蛋白（一种检测用试剂）识别并捕获被检信号分子，并在酶标板固态表面形成包含包被蛋白和标记试剂结合的复合物，酶标板的应用方便除去溶液中杂质，但需要包埋、洗脱、分离等多步操作，分析过程繁琐，分析时间长，不能满足快速检测和诊断的要求。
[0006]
用可溶性高分子颗粒包被蛋白同样增强蛋白的稳定性，专利文献cn201110306613.4公开了使用底部是渗透性滤膜的96孔过滤板、聚苯乙烯微球包被hcv-cag一抗（单克隆抗体，抗hcv-cag第一抗体）和酶标记抗体hcv-cag二抗（单克隆抗体，抗hcv-cag第二抗体）定量检测人血清中hcv-cag，对比市售elisa试剂盒，灵敏度高（4.3pg/ml vs 50pg/ml）, 且线性范围（13pg-50ng/ml）宽（大于三个数量级vs小于两个数量级）。文献对渗透性滤膜的孔径没有规定。
[0007]
专利文献cn201310228708.8公开了一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法：将固定捕获试剂的乳胶微球放入反应杯，与标记试剂进行静态的混合孵育反应，反应混合物转入设有深孔滤板的检测杯，随后通过吸水杯作用将反应溶液及洗涤溶液从滤板的滤膜流尽，标记试剂等小分子或小粒径的物质随溶液流出了深孔滤板，包被微球则在穿越底部滤膜时被部分截留，随后通过光学对膜表面进行检测得到相关检测信号的实验。这个方法的意义在于免疫反应试剂在均相环境中进行了静态孵育，可以降低对免疫抗体抗原的亲和力要求；同时孵育反应后溶液中承载着反应复合物的包被微球被集聚到滤膜
中，起到了良好的反应物质浓缩作用。但是，该专利文献中的包被微球的粒径与滤膜的孔径的关系没有明确界定，微球将渗入滤膜一定深度，这将导致部分微球穿越滤膜，从而导致检测结果不准确。同时，也将导致滤膜不同深度的微球反射的光谱信号的差异。
[0008]
样本的杂质有可能影响过滤操作，比如阻塞滤膜的孔道或粘附和产生阻力等。
[0009]
利用磁力装置可以控制有磁性的组分，使之固定在设定的表面，完成分离、除杂、转移等操作。专利文献cn201520303370.2和cn201620401672.8公开了两种磁力架，分别用于分离纯化和提取核酸。目前技术条件下还存在磁性微球影响光信号的问题。


技术实现要素：

[0010]
本发明提供一种磁性微球介导的包被微球生化检测系统，在样品前处理到检测过程中使用磁力进行除杂、转移等操作，并且在检测时磁性微球不影响光信号因而不影响检测。
[0011]
一种磁性微球介导包被微球生化检测系统包括与被测物质进行特异性结合反应的捕获试剂（固定于包被微球表面）和标记试剂（游离态），捕获试剂（固定于包被微球表面）和标记试剂（游离态）与待检样中的被测物质的特异性结合反应在孵育容器中完成。孵育容器为一种上方开口的容器，检测时使用的检测杯，可以是孵育容器充当，可以是另设的检测杯，包括但不限于标记信号处于液态的检测杯，和标记信号集中在固态表面的微孔滤杯。
[0012]
捕获试剂、标记试剂与被测物质的高特异性和高灵敏度的结合反应是免疫分析的检测基础。标记试剂的结合状态量和游离状态量的比例即信号强度，由三者的结合反应决定。在适量的捕获试剂和标记试剂存在且待检样及其中被测物质的浓度在检测范围内时，被测物的量与复合物中标记试剂的量存在简单和确定的数量关系，即通过浓度曲线或简化的理论推算可以得到被测物质的量与检测信号强度的数量关系并由该数量关系和检测信号强度得到被测物质的量。
[0013]
本发明的技术方案包括除去待检物中杂质并完整保留被测物质，精确地除去游离状态的标记试剂，并精确地测定复合物中标记试剂的量。
[0014]
一种磁性微球介导包被微球生化检测系统还包括磁力装置，磁力装置作用于磁性微球使之分散或聚集，与磁性微球相联的包被微球随之分散或聚集，从而影响包被微球表面捕获试剂所结合的被测物质和标记试剂。
[0015]
检测过程中样品经过过滤纯化的，磁性微球介导的前处理，解决“样本的杂质有可能影响过滤操作，比如阻塞滤膜的孔道或粘附和产生阻力等”的问题。令包被微球的直径大于微孔滤膜的孔径。解决过滤造成信号处于滤膜不同深度造成信号强度偏差的问题。
[0016]
磁性微球与包被微球表面分别设置具有互为配位体关系的物质因而能结合在一起，包被微球与磁性微球结合时具有磁性，能被磁力装置聚集固定，能被磁力装置转移。当包被微球与磁性微球的结合解除时，两者同在溶液中且磁性微球不影响对包被微球-标记试剂的光谱信号的检测。解决“目前技术条件下还存在磁性微球影响光信号的问题。”本发明的磁性微球介导的包被微球生化检测系统的有益的效果是：1. 光信号不受磁性微球影响。从孵育容器转移的步骤除杂，滤膜截留完整和严格地获取复合物中的标记试剂，标记试剂本身的信号强度高且配合检测方法。因此得到的检测结果本底低，灵敏度高。
被测物质复合物互为直接或间接配位体关系的标记试剂（002，菱形）。
[0025]
在孵育过程中，为了得到最接近理想状态的动态平衡，磁性微球-包被微球的最佳状态是均匀分散在溶液中，捕获试剂最接近游离态、标记试剂初始是游离态。有特定结构的被测物质与捕获试剂、标记试剂相互作用，经过一段时间孵育，达到动态平衡，形成一定量的含捕获试剂-标记试剂的复合物。
[0026]
在动态平衡体系中，存在游离态和结合态的标记试剂，检测复合物的量须要精准地分离出复合物。因为复合物具有一定的稳定性，分离的精准取决于分离过程的速度以及分离手段对复合物结构以及动态平衡的影响程度。
[0027]
具体的任一种磁性微球介导的包被微球生化检测系统（产品）的包被微球、捕获试剂和标记试剂的量固定，在一定浓度区间，待测物中被测物质的量、被测物质与捕获试剂复合物的量以及相应的标记试剂在复合物中的比例的数量关系确定且有简单和足够精确的公式。
[0028]
孵育容器（特别是容器的形状、容积，以及材质）可以适合或不适合检测的需要，孵育后，包被微球-标记试剂复合物被分离，并且被检测。如需要，包被微球-标记试剂复合物被从孵育容器转移到检测杯中。
[0029]
磁力装置可以作用于孵育容器外壁（磁力架）或作用于孵育容器中溶液里（磁棒和棒 套），磁性微球吸附在磁铁附近，聚集在孵育容器壁或棒套壁。棒套不提供容器，棒套壁可以方便地转移被吸住的磁性微球且不（能）夹带溶液，磁棒移动时夹带溶液的话，溶液会一路失控地污染环境，建议在转移磁性微球前先移去溶液（并稍洗涤）。棒套可以一次性使用，方便避免污染。磁力架可以设计磁铁可动，或/和孵育容器可动。
[0030]
磁力作用的好处：1操作方便快速，磁力聚集可以与各种高效的物理分离手段，如快速移液、强力冲洗，配合，并能避免在分离复合物过程引入误差；2适于自动操作，保障操作一致性，检测结果精度高。
[0031]
图2左的上下两例，磁性微球和包被微球连在一起，磁性微球会影响光信号。为了使磁性微球不影响光信号，在除去杂质和除去检测用平衡体系中的游离态标记试剂之后，分开磁性微球（003，椭圆）和包被微球（001，圆形），可选的方案1包括加入使磁性微球-包被微球解离的含配位竞争物质（不影响检测）的溶液或2将磁性微球与包被微球的结合处特异性切断的酶，结果如图2中的上下两例。如果需要（如图2中的下例），用磁力装置移走磁性微球（如图2微孔滤膜101最右的图示）。
[0032]
检测过程包括溶液混匀、检测反应达到平衡的慢步骤和对包被微球-标记试剂复合物除杂、转移、检测的越快所得的结果越精准的步骤，后者的操作包括在磁力配合下实现磁性微球聚集/分散时移去含杂溶液，转移磁性微球（用磁棒不带溶液或不用磁力装置和溶液一起转移）、切开磁性微球与包被微球联系等目的的转移、添加、移去操作。
[0033]
实施例2一种磁性微球介导的包被微球生化检测系统的检测方法以检测杯为孵育容器1、设有包被微球-磁性微球和标记试剂的孵育容器（检测杯）内放入待测溶液2、在孵育容器（检测杯）内完成检测反应，形成包被微球-磁性微球和标记试剂复合物。结合态标记试剂的量与待测溶液中的被测物质的量有简单的数学关系。
[0034]
3、使用磁力架固定磁性微球（在检测杯容器壁）或使用磁棒+棒套固定磁性微球（在棒套壁）。
[0035]
4、移去溶液，洗涤，重悬在适合检测的量的溶液中5、切断磁性微球和包被微球的联系，可做可不做：使用磁力架将磁性微球固定在检测杯容器壁或使用磁棒+棒套移去磁性微球6、检测以能控制液体暂不从通孔流出的微孔滤杯为孵育容器，可能难以除去阻塞滤膜的杂质。
[0036]
1、设有包被微球-磁性微球和标记试剂的孵育容器（滤杯）内放入待测溶液2、在孵育容器（滤杯）内完成检测反应，形成包被微球-磁性微球和标记试剂复合物。结合态标记试剂的量与待测溶液中的被测物质的量有简单的数学关系。
[0037]
3、使用磁力架固定磁性微球（在滤杯容器壁）或使用磁棒+棒套固定磁性微球（在棒套壁）。
[0038]
4、移去溶液，洗涤，重悬在适合检测的量的溶液中，移去溶液的步骤可以除去阻塞滤膜的杂质。
[0039]
5、切断磁性微球和包被微球的联系，使用微孔滤杯磁力架将磁性微球固定在检测杯容器壁或使用磁棒+棒套移去磁性微球；溶液从通孔流出，含包被微球的复合物被滤膜截留，6、检测预处理体积较大，设孵育容器。
[0040]
1、设有包被微球-磁性微球和标记试剂的孵育容器内放入待测溶液2、在孵育容器内完成检测反应，形成包被微球-磁性微球和标记试剂复合物。结合态标记试剂的量与待测溶液中的被测物质的量有简单的数学关系。
[0041]
3、使用磁力架固定磁性微球（在容器壁）或使用磁棒+棒套固定磁性微球（在棒套壁）。
[0042]
4、移去溶液，洗涤，重悬在适合检测的量的溶液中5.1切断磁性微球和包被微球的联系，5.11使用磁棒+棒套移去磁性微球，将溶液转移到检测杯或微孔滤杯。
[0043]
或5.12 使用磁力架固定磁性微球（在容器壁），将溶液转移到检测杯或微孔滤杯。
[0044]
或5.2 转移含有包被微球-磁性微球和标记试剂复合物的溶液到检测杯，重悬，切断磁性微球和包被微球的联系。
[0045]
或5.3使用磁棒+棒套移去磁性微球转移包被微球-磁性微球和标记试剂复合物到检测杯，重悬，切断磁性微球和包被微球的联系。
[0046]
或5.4转移含有包被微球-磁性微球和标记试剂复合物的溶液到能控制液体暂不从通孔流出的微孔滤杯，重悬，切断磁性微球和包被微球的联系。
[0047]
或5.5 使用磁棒+棒套移去磁性微球转移包被微球-磁性微球和标记试剂复合物到能控制液体暂不从通孔流出的微孔滤杯，重悬，切断磁性微球和包被微球的联系。
[0048]
5.41&5.51使用微孔滤杯磁力架将磁性微球固定在检测杯容器壁或使用磁棒+棒套移去磁性微球；5.42&5.52溶液从通孔流出，含包被微球的复合物被滤膜截留，6、检测永磁铁和电磁铁都可以提供磁力。本发明提供两种包含磁铁的磁力装置方案：作用在溶液外的磁力架（针对孵育容器和针对微孔滤杯）以及作用于溶液内的磁棒加棒套，以及它们的组合。且两种方案都可以批量处理样品。磁力架采用的磁铁为环形、圆形或长条形片状，薄片的两面分别为n/s极，磁棒的两端分别为n/s极。磁力架使具有磁性的微粒固定在孵育容器壁表面然后除去含杂质的溶液，使具有磁性的微粒分散在孵育容器中新换的溶液中；磁棒和棒 套组合使具有磁性的微粒固定在棒套表面然后分散在孵育容器或供检测的检测杯或微孔滤杯中的溶液里。从溶液的外部加磁力，有容器壁隔开磁力部件和溶液；从溶液的内部加磁力，有棒套隔开磁力部件和溶液；都使有磁性的微粒固定在容器内离磁力部件n/s极最近的位置，方便使磁性的微粒及其复合物与溶液及没有磁性的微粒分离。
[0049]
实施例3 使用检测杯的一种磁性微球介导的包被微球生化检测系统检测降钙素原（pct）。pct是机体对细菌、真菌感染的重要指标，急诊科、重症监护等常规监视血浆pct指标（目前临床多为定性或半定量检测）。文献记载人体正常pct含量是10-50ng/l,病理情况下可达到10*103ng/l。
[0050]
建立pct检测系统的方法。
[0051]
(1)pct蛋白的获取。
[0052]
(2)获取pct单克隆抗体对。
[0053]
(3)建立磁性微球介导的包被微球生化检测系统双抗夹心检测降钙素，获得浓度(ng/l)-od(450nm)双对数线性关系： y=0.00212x+0.07194；r2=0.9924。
[0054]
(4)检测和检测结果质控。
[0055]
样品血清杂质较少，简单地使用磁性微球从孵育容器转到检测杯即可得到cv<5%的精度。检测时间在10分钟以内。检测限可达到50ng/l。
[0056]
实施例4微孔滤杯100和微孔套杯110夹持微孔滤膜101。
[0057]
微孔套杯的作用是与微孔滤杯配合，夹持微孔滤膜。
[0058]
如图3所示，微孔滤杯100的第一通孔102的底部外表面贴合的微孔滤膜101；如图4
所示，微孔滤杯100和微孔套杯110夹持微孔滤膜101。
[0059]
微孔滤杯底面103中心设第一通孔102，微孔滤膜贴合在第一通孔外壁。微孔滤杯底面以第一通孔的中心为轴、为最低点设置成弧形面、球形面或一定倾斜角度的锥形面；微孔滤杯底面与侧壁、与第一通孔交界处为圆角，使溶液不滞留。包被微球直径均匀，微孔滤膜孔径均匀，包被微球直径大于微孔滤膜孔径，标记试剂直径小于微孔滤膜孔径。溶液在微孔滤杯中穿越微孔滤膜流出。游离的标记试剂随溶液流出，与包被微球结合的标记试剂被截留在第一通孔微孔滤膜内，被检测并根据检测结果推算出被测物质的量。
[0060]
如实施例1所述，与包被微球结合的标记试剂被截留在第一通孔微孔滤膜内。将微孔滤膜连同微孔滤杯（如图3）或连同微孔滤杯和微孔套杯（如图4）放置到检测仪器的待检位置检测微孔滤膜表面截留的包被微球-信号分子复合物。并根据检测结果推算出被测物质的量。
[0061]
可以用胶水等使微孔滤膜贴在第一通孔外表面（如图3所示），但因为贴合面积小难以取得好的效果。需要在微孔滤膜下方对其位置加以保护。也可以同时用胶水和微孔套杯固定微孔滤膜。用胶水时希望微孔滤膜粘得牢，一般微孔滤膜用后弃去，微孔滤杯如果洗净后重复使用的话，又会希望容易把废弃微孔滤膜完整地取下来，所以，这种情况下不用胶水、单用微孔套杯比较好。
[0062]
如图4所示，微孔滤杯和微孔套杯通过下方的第二凹槽或第二凸环（105和115，图3、图4示105为凸起，105也可以是凹槽）密封连接。密封连接的目的是阻止溶液从微孔滤膜侧面进入微孔滤杯和微孔套杯间狭小的空间，如果有溶液携标记试剂滞留在微孔滤膜周边，很可能不易被洗涤除去从而影响实验结果。微孔滤杯和微孔套杯的第二凹槽或第二凸环的密封与第一通孔和第二通孔夹持微孔滤膜两处在微孔滤杯和微孔套杯之间形成一个极小的空间，在溶液穿越微孔滤膜的过程中可以认为该极小的空间符合密封的设定：压强和体积的乘积pv为定值。密封空间的体积越小，同样的压强变化对应的体积变化率一样，则体积变化越小，即体积小的空间因为外界压力而让出来给液体进入的绝对值小，而同样的体积变化对应的体积变化率越大，因而压强变化越大，即渗入同样体积的液体的难度和阻力越大。所以，密封的第二凹槽或第二凸环设计在下方。但对于较长时间，该极小的空间的压强是与外界一样的，即，该空间不是绝对的密封。
[0063]
微孔滤杯和微孔套杯通过上方的第一凹槽或第一凸环（104和114，二者相互匹配，可凹可凸）卡扣连接，卡扣连接的目的是使第一通孔和第二通孔夹持微孔滤膜的力量足够大。保障微孔滤膜贴合第一通孔的力量主要是两个：第一通孔与第二通孔相抵时极微量的弹性变形造成的应力，应力和微孔滤膜及微孔滤杯和微孔套杯的表面性质决定的摩擦力。卡扣连接须要定位准确，且不必密封。
[0064]
实施例5为了避免污染或穿越微孔滤膜的溶液还有收集的必要，设计了由套管420和收集管410组成的收集套管（图5）。收集套管与微孔套杯连接。微孔套杯外壁和底面（外侧）设计有突起117，如图7所示，四个突起贯通外壁且延伸到底面，与收集套管平滑的内表面配合形成气体通道。
[0065]
为了使溶液更快地穿越微孔滤膜，本发明提供了两个方案，离心力和抽真空，并且抽真空的方案中为避免产生溶液的气雾，设计在微孔滤膜之后溶液向下到收集管，抽真空
的气路在微孔套杯外向上接抽真空装置。
[0066]
如图6所示离心转头与通常离心转头的设计目的很不同（通常的离心转头设计是为了容忍各离心管不一致导致不平衡）。
[0067]
本发明中的离心管是完全一致的，特点是：1、离心机静止时离心管竖直且位置固定，可以很方便地定位夹取；2、离心机转动时，离心管的中轴线能无限接近在离心力和重力合力的方向，便于底部有孔洞的离心管溶液甩离干净。
[0068]
实施例6如图7所示，真空套件（抽气进气柱体510+密封套管520）、微孔套杯110及微孔滤杯100、收集套管400的组装。图7左上示组装好的外观；图7右上示三部分：真空套件（抽气进气柱体510+密封套管520）、微孔套杯110及微孔滤杯100、收集套管400；除去密封套管520，如图7左下、右下所示，从上到下依次为：抽气进气柱体510、微孔滤杯100、微孔套杯110、收集套管400。密封套管520在微孔滤杯100、微孔套杯110外，上端和下端分别与抽气进气柱体510和密封套管520连接。
[0069]
图10、图11示一个具体的抽气进气柱的两个截面，分别可见抽气通路（抽气柱511和抽气管道513）和进气通路（进气柱512和进气管道514）。所示抽气进气柱的抽气和进气通路在空间相互避让，表现为位于中间的进气柱和抽气柱占据不同高度，相应的位于周边的进气管道和抽气管道在不同的高度设置与中间的进气柱或抽气柱相通的管道。在具体实施例中，抽气通路或进气通路并不一定在一个平面上，它们在空间上是同时存在和有功能的。
[0070]
图9示组装好的真空套件、微孔滤杯+微孔套杯、收集套管三件套功能结构。左图示抽气通路，右图示进气通路。抽气通路从微孔滤膜下方，由微孔套杯外壁突起117（图8）支撑的套管-微孔套杯的空隙417连通抽气管道513和抽气柱511。进气通路从进气管道514、进气柱512到微孔滤杯，进气通路在微孔滤膜上方。密封套管和抽气进气柱体通过第四凹槽或第四凸环 卡扣连接，此处连接是密封的。密封套管与收集套管密封连接。真空套件和收集套管构成封闭空间。抽气进气柱体的外部套设有第三凸环，所述第三凸环插接在微孔滤杯或微孔套杯的上方开口内，并且与微孔滤杯或微孔套杯密封连接，确保进气柱内的气体仅从微孔滤杯的第一通孔流出和/或进气柱内的气体仅从微孔套杯的第二通孔相通。此处密封的另一个方案：采用垫片，垫片在进气柱和微孔滤杯或微孔套杯之间，微孔套杯下方抵住收集套管，收集套管与密封套管-抽气进气柱体密封相连，即进气柱与微孔滤杯或微孔套杯压紧垫片形成密封连接。
[0071]
本发明提供的真空套件方案，进气路径保持与外界大气压一致，微孔滤膜之后压力低于大气压，而收集管的压力只是略低于大气压，一方面提供的动力较小，另一方面不会破坏液滴的界面，不会形成气雾。液体在重力做用下到达收集管，气体经由微孔套杯与收集管间的空隙、微孔套杯与密封套管间的空隙，通过抽气管道513和抽气柱511，接抽真空装置。
[0072]
实施例7磁性微球介导的微孔膜截留集聚的包被微球生化检测系统检测植物油中的苯并芘 bap。
[0073]
1．样品前处理：植物油（稀释倍数20）。准确吸取 500
µ
l植物油样本于15ml离心管
中，加入9.5ml 70%乙醇水；振荡混匀，5000rpm室温离心5min；取上层溶液50
µ
l用于分析。
[0074]
2．特异性反应：孵育容器（含已经包被偶联bsa-baq抗原的微球和偶联baq鼠单克隆抗体的荧光微球）中放入上清混匀，孵育15min。
[0075]
3．洗涤，除杂：使用磁棒+棒套集聚磁性微球+包被微球，移去上清溶液，加入适量水溶液振荡混匀，使用磁棒+棒套集聚磁性微球+包被微球，移去水溶液。
[0076]
4．转移兼除杂：使用磁棒+棒套集聚磁性微球+包被微球，磁棒+棒套转移到微孔滤杯中含配位竞争物质的溶液里，拔出磁棒，包被微球溶于微孔滤杯中的水溶液里，磁棒插入棒套底，磁性微球被磁棒+棒套集聚并移除。
[0077]
5．离心或真空抽滤：微孔膜截留集聚包被微球。
[0078]
6．取出微孔滤杯，放入荧光检测系统中读取荧光值。浓度（ppb）od值040980.0525980.2517481.2511466.2576831.25496
[0079]
将标准品的平均od值与浓度指数作图（y=log10<平均od值>，x= log10<浓度（ppb） >，浓度为0的点不计），y=-0.2569x+3.08439，斜率和截距的方差/本值比值都小于1/100。根据拟合直线计算，从样品平均od值得到样本浓度（ppb）为0.0520（样本1的od值2586）、5.38（样本2的od值788）。
[0080]
步骤3中磁棒在溶液中吸附磁性微球用时在二十秒或十秒以内，因此限制溶液中物质距棒套约几毫米量级，实际操作中使用的孵育管容积500ul，溶液约50-100ul。步骤3，4中加入的水溶液不含目标分子或能影响目标分子与捕获试剂结合的物质。步骤1前处理相对简便，适用于难溶于水（<0.01g/100ml）的微量物质检测，上清是酒精-水溶液，如果被测物质在脂质中的含量很大，用此法萃取会在油中有残留。