1.本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种检测牛早期怀孕的方法。
背景技术：
2.人绒毛膜促性腺激素(hcg)是妊娠期期间由胎盘滋养层细胞分泌产生的一种糖蛋白激素，由两个不同的亚基，α、β以非共价键连接组成。分子量为36700的糖蛋白激素，α亚基与垂体分泌的fsh(卵泡刺激素)、lh(黄体生成素)和tsh(促甲状腺激素)等基本相似，故相互间能发生交叉反应，而β亚基的结构各不相似。在激素的产生、分泌、代谢等过程中，hcg分子会发现断裂、离解等多种变化，从而在血、尿中以多种分子形式存在。hcg是唯一不随胎盘重量增加而分泌增多的胎盘激素。受精的卵子移动到子宫腔内着床后，形成胚胎，在发育成长为胎儿过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的hcg，可通过孕体血液循环而排泄到尿中。当妊娠1～2.5周时，血清和尿中的hcg水平即可迅速升高，第8周孕期达到高峰，至孕期第4个月始降至中等水平，并一直维持到妊娠末期。因此，可以通过检测血、尿中的hcg浓度以检测早孕。
3.目前，牛的妊娠检测主要有外部观察法和试情法，以及超声波检测法，免疫学检测法、红细胞凝集实验、血清酸滴定法等。外部观察法和试情法通常是以母牛配种后17～21d，观察母牛是否返情来检测是否妊娠，但牛胚胎停止发育，母牛在短时间内也不会返情，会处在假妊娠状态。超声波诊断法是利用超声波的物理特性，把超声波的物理特性和动物组织结构的声学特点密切结合的一种物理学检测，该方法需要在母牛配种40d后才能测出牛是否妊娠，60d后准确率才能达到100％。免疫学诊断法即利用妊娠前后母牛血清孕酮激素物质进行检测，根据其含量来判断母牛是否妊娠。但由于这些激素在妊娠和未妊娠母牛血清中，因品种、个体差异等因素的影响，目前还很难在生产中推广。红细胞凝集实验即将妊娠早期母牛体内特异性抗原与红细胞相结合，用其制备抗血清，与妊娠10～15d的母牛红细胞混合时会发生红细胞凝集现象，如未妊娠，则不发生红细胞凝集现象，此法对母牛妊娠28～60d的准确率为90％，但母牛胚胎停止发育后也会发生红细胞凝集现象，易导致母牛长期处于假妊娠状态。血清酸滴定法即母牛在胚胎快速生长过程中，机体生产出一种特有的免疫球蛋白，在酸性环境中与其它蛋白质形成低溶性复合物(絮状物)的特性，准确率可达90.81％，但母羊胚胎停止发育后也会发生与其它蛋白质形成低溶性复合物(絮状物)的特性，也易导致母牛长期处于假妊娠状态，操作过程繁琐，并且需要在18～25℃的室温环境下才能进行，不利于现场检测。
技术实现要素：
4.本发明为解决上述技术问题，提供了一种检测牛早期怀孕的方法。
5.为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种检测牛早期怀孕的方法，包括以下步骤：先收集待测样品，采用牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条对待测样品进行检测，将检测结果与试剂盒的比色卡进行比对，再判
断检测结果；具体包括以下步骤：
7.(1)样品采集：在母牛配种后的第7～14d，收集母牛的晨尿2～8ml；
8.(2)检测：将牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条插入步骤(1)的尿液中6～9s，取出，静置13～15min，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t的显色情况，放置15min后结果无效；
9.(3)结果判断：根据步骤(2)检测试纸显色结果：若试纸质控线c未显色、检测线t显色，表明检测结果无效，重新检测；若试纸质控线c显色，检测线t未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素hcg水平低下，隔日进行检测；若试纸质控线c及检测线t都显色，用该显色与hcg比色卡进行下列对比；
10.①
当促绒毛膜性腺激素hcg＜10miu/ml，表明母牛未怀孕；
11.②
当当促绒毛膜性腺激素hcg≥10miu/ml，表明母牛可能怀孕，连续测试两次，每隔一天测试一次；
12.③
当步骤
②
的两次检测试结果的促绒毛膜性腺激素hcg上升，且后一次的促绒毛膜性腺激素hcg是前一次的1～2倍，表明母牛怀孕，且为活胎；
13.④
当步骤
②
的两次检测结果的hcg维持不变或下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊。
14.进一步地，所述牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：
15.(一)将nc膜贴在pvc板上表面的中部作为底板，用xyz3010喷金划膜仪，并按0.7μl/cm的量、300mm/s的速度将igg包被液均匀地划在nc膜的上端作为质控线c，将hcg包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t，质控线c与检测线t相距5～7mm，质控线c距离nc膜上端7～9mm，检测线t距离nc膜下端6～8mm，然后放入干燥箱内，于温度为24～26℃、湿度为20～30％下干燥19～21h，制得划膜板；
16.(二)在100ml金溶液中加入1.15～1.2ml碳酸钾溶液、1.6～1.8mglhmb2，搅拌30～35min，滴加320～325ul封闭液，搅拌10～15min，于4℃、1200r/min的条件下离心25～30min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.2～5.4ml，加入38～42ml胶体金结合物稀释液混匀，均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，得金垫；
17.(三)按30ml/张的量，将样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为24～26℃、湿度为20～30％下干燥19～21h，得样本垫；
18.(四)将步骤(二)的金垫贴于步骤(一)的划膜板的nc膜下端，并使1～2mm的金垫后端搭在nc膜上，然后将步骤(三)的样本垫贴于金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端，再将吸水垫贴于pvc板后端，并使1～2mm的吸水垫前端搭在nc膜后端获得贴板，最后将贴板切割成2.8～3.3mm的试纸条，得牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试纸。
19.进一步地，所述igg包被液按照以下方法制备：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述igg包被液。
20.进一步地，所述hcg包被液按照以下方法制备：将160～180mg牛的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体hcgmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述hcg包被液。
21.进一步地，所述胶体金结合物稀释液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲氨基
甲烷、0.2份的聚乙烯吡咯烷酮、5份的蔗糖、0.9份的氯化钠、0.5份的牛血清白蛋白、3份的羊血清、0.15份的吐温20、100份的纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液。
22.进一步地，所述金溶液按照以下方法制备：将质量浓度为1％的氯金酸溶液2份、质量浓度为1％的柠檬酸钠加入纯化水至100份，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，制得金溶液。
23.进一步地，所述封闭液按照以下方法制备：将0.005份的牛血清白蛋白溶解在300份的纯化水中，再加入30份碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液。
24.进一步地，所述样本垫处理液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲氨基甲烷、1.5份的氯化钠完全溶解在100份的纯化水中，得样本垫处理液。
25.由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：
26.(1)本申请能够通过牛尿样，检测出牛是否怀孕，对牛的早期妊娠进行简单、方便、快速、准确的检测，且能牛胚胎是否存活，且最早在配种后一周之内就可以检测出来，进而带来假妊娠、空怀胎所造成的经济损失，以便尽快消除假妊娠、空怀胎，让母牛尽早恢复正常，缩短母牛的非繁殖天数，弥补了现有技术检出时间较晚且仅能判断牛是否妊娠，却不能反应牛胚胎是否存活。
27.(2)本发明方法无需对尿样进行处理，操作和检测方法简单，适用于现场、即时、快速检测，方便工作人员准确测定母牛是否怀孕，对于配种一两周内未怀孕的母牛，能够及时改变饲养和管理方式，提高牛的繁殖效率，减少种牛哺乳之后的死亡率，提高牛的养殖效益。
具体实施方式
28.下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
29.实施例1
30.一种检测牛早期怀孕的方法，包括以下步骤：先收集待测样品，采用牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条对待测样品进行检测，将检测结果与试剂盒的比色卡进行比对，再判断检测结果；具体包括以下步骤：
31.(1)样品采集：在母牛配种后的第7～14d，收集母牛的晨尿2ml；
32.(2)检测：将牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条插入步骤(1)的尿液中6s，取出，静置13min，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t的显色情况，放置15min后结果无效；
33.(3)结果判断：根据步骤(2)检测试纸显色结果：若试纸质控线c未显色、检测线t显色，表明检测结果无效，重新检测；若试纸质控线c显色，检测线t未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素hcg水平低下，隔日进行检测；若试纸质控线c及检测线t都显色，用该显色与hcg比色卡进行下列对比；
34.①
当促绒毛膜性腺激素hcg＜10miu/ml，表明母牛未怀孕；
35.②
当当促绒毛膜性腺激素hcg≥10miu/ml，表明母牛可能怀孕，连续测试两次，每隔一天测试一次；
36.③
当步骤
②
的两次检测试结果的促绒毛膜性腺激素hcg上升，且后一次的促绒毛
膜性腺激素hcg是前一次的1倍，表明母牛怀孕，且为活胎；
37.④
当步骤
②
的两次检测结果的hcg维持不变或下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊。
38.所述牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：
39.(一)将nc膜贴在pvc板上表面的中部作为底板，用xyz3010喷金划膜仪，并按0.7μl/cm的量、300mm/s的速度将igg包被液均匀地划在nc膜的上端作为质控线c，将hcg包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t，质控线c与检测线t相距5mm，质控线c距离nc膜上端7mm，检测线t距离nc膜下端6mm，然后放入干燥箱内，于温度为24℃、湿度为20％下干燥19h，制得划膜板；
40.(二)在100ml金溶液中加入1.15ml碳酸钾溶液、1.6mglhmb2，搅拌30min，滴加320ul封闭液，搅拌10min，于4℃、1200r/min的条件下离心25～30min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.2ml，加入38ml胶体金结合物稀释液混匀，均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，得金垫；
41.(三)按30ml/张的量，将样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为24℃、湿度为20％下干燥19h，得样本垫；
42.(四)将步骤(二)的金垫贴于步骤(一)的划膜板的nc膜下端，并使1mm的金垫后端搭在nc膜上，然后将步骤(三)的样本垫贴于金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端，再将吸水垫贴于pvc板后端，并使1mm的吸水垫前端搭在nc膜后端获得贴板，最后将贴板切割成2.8mm的试纸条，得牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试纸。
43.其中，所述igg包被液按照以下方法制备：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述igg包被液；所述hcg包被液按照以下方法制备：将160～180mg牛的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体hcgmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述hcg包被液；所述胶体金结合物稀释液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲氨基甲烷、0.2份的聚乙烯吡咯烷酮、5份的蔗糖、0.9份的氯化钠、0.5份的牛血清白蛋白、3份的羊血清、0.15份的吐温20、100份的纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；所述金溶液按照以下方法制备：将质量浓度为1％的氯金酸溶液2份、质量浓度为1％的柠檬酸钠加入纯化水至100份，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，制得金溶液；所述封闭液按照以下方法制备：将0.005份的牛血清白蛋白溶解在300份的纯化水中，再加入30份碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；所述样本垫处理液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲氨基甲烷、1.5份的氯化钠完全溶解在100份的纯化水中，得样本垫处理液。
44.实施例2
45.一种检测牛早期怀孕的方法，包括以下步骤：先收集待测样品，采用牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条对待测样品进行检测，将检测结果与试剂盒的比色卡进行比对，再判断检测结果；具体包括以下步骤：
46.(1)样品采集：在母牛配种后的第7～14d，收集母牛的晨尿8ml；
47.(2)检测：将牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条插入步骤(1)的尿液中9s，取出，静置15min，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t的显色情况，放置15min后结果无效；
48.(3)结果判断：根据步骤(2)检测试纸显色结果：若试纸质控线c未显色、检测线t显
色，表明检测结果无效，重新检测；若试纸质控线c显色，检测线t未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素hcg水平低下，隔日进行检测；若试纸质控线c及检测线t都显色，用该显色与hcg比色卡进行下列对比；
49.①
当促绒毛膜性腺激素hcg＜10miu/ml，表明母牛未怀孕；
50.②
当当促绒毛膜性腺激素hcg≥10miu/ml，表明母牛可能怀孕，连续测试两次，每隔一天测试一次；
51.③
当步骤
②
的两次检测试结果的促绒毛膜性腺激素hcg上升，且后一次的促绒毛膜性腺激素hcg是前一次的2倍，表明母牛怀孕，且为活胎；
52.④
当步骤
②
的两次检测结果的hcg维持不变或下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊。
53.所述牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：
54.(一)将nc膜贴在pvc板上表面的中部作为底板，用xyz3010喷金划膜仪，并按0.7μl/cm的量、300mm/s的速度将igg包被液均匀地划在nc膜的上端作为质控线c，将hcg包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t，质控线c与检测线t相距7mm，质控线c距离nc膜上端9mm，检测线t距离nc膜下端8mm，然后放入干燥箱内，于温度为26℃、湿度为30％下干燥21h，制得划膜板；
55.(二)在100ml金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.8mglhmb2，搅拌35min，滴加325ul封闭液，搅拌10～15min，于4℃、1200r/min的条件下离心30min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.4ml，加入42ml胶体金结合物稀释液混匀，均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，得金垫；
56.(三)按30ml/张的量，将样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为26℃、湿度为30％下干燥21h，得样本垫；
57.(四)将步骤(二)的金垫贴于步骤(一)的划膜板的nc膜下端，并使2mm的金垫后端搭在nc膜上，然后将步骤(三)的样本垫贴于金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端，再将吸水垫贴于pvc板后端，并使2mm的吸水垫前端搭在nc膜后端获得贴板，最后将贴板切割成3.3mm的试纸条，得牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试纸。
58.其中，所述igg包被液按照以下方法制备：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述igg包被液；所述hcg包被液按照以下方法制备：将160～180mg牛的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体hcgmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述hcg包被液；所述胶体金结合物稀释液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲氨基甲烷、0.2份的聚乙烯吡咯烷酮、5份的蔗糖、0.9份的氯化钠、0.5份的牛血清白蛋白、3份的羊血清、0.15份的吐温20、100份的纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；所述金溶液按照以下方法制备：将质量浓度为1％的氯金酸溶液2份、质量浓度为1％的柠檬酸钠加入纯化水至100份，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，制得金溶液；所述封闭液按照以下方法制备：将0.005份的牛血清白蛋白溶解在300份的纯化水中，再加入30份碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；所述样本垫处理液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲氨基甲烷、1.5份的氯化钠完全溶解在100份的纯化水中，得样本垫处理液。
59.实施例3
60.一种检测牛早期怀孕的方法，包括以下步骤：先收集待测样品，采用牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条对待测样品进行检测，将检测结果与试剂盒的比色卡进行比对，再判断检测结果；具体包括以下步骤：
61.(1)样品采集：在母牛配种后的第7～14d，收集母牛的晨尿6ml；
62.(2)检测：将牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条插入步骤(1)的尿液中8s，取出，静置14min，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t的显色情况，放置15min后结果无效；
63.(3)结果判断：根据步骤(2)检测试纸显色结果：若试纸质控线c未显色、检测线t显色，表明检测结果无效，重新检测；若试纸质控线c显色，检测线t未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素hcg水平低下，隔日进行检测；若试纸质控线c及检测线t都显色，用该显色与hcg比色卡进行下列对比；
64.①
当促绒毛膜性腺激素hcg＜10miu/ml，表明母牛未怀孕；
65.②
当当促绒毛膜性腺激素hcg≥10miu/ml，表明母牛可能怀孕，连续测试两次，每隔一天测试一次；
66.③
当步骤
②
的两次检测试结果的促绒毛膜性腺激素hcg上升，且后一次的促绒毛膜性腺激素hcg是前一次的1.5倍，表明母牛怀孕，且为活胎；
67.④
当步骤
②
的两次检测结果的hcg维持不变或下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊。
68.所述牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试剂条的制备方法，包括以下步骤：
69.(一)将nc膜贴在pvc板上表面的中部作为底板，用xyz3010喷金划膜仪，并按0.7μl/cm的量、300mm/s的速度将igg包被液均匀地划在nc膜的上端作为质控线c，将hcg包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t，质控线c与检测线t相距6mm，质控线c距离nc膜上端8mm，检测线t距离nc膜下端7mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃、湿度为25％下干燥20h，制得划膜板；
70.(二)在100ml金溶液中加入1.18ml碳酸钾溶液、1.7mglhmb2，搅拌33min，滴加323ul封闭液，搅拌13min，于4℃、1200r/min的条件下离心27min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3ml，加入41ml胶体金结合物稀释液混匀，均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，得金垫；
71.(三)按30ml/张的量，将样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃、湿度为25％下干燥20h，得样本垫；
72.(四)将步骤(二)的金垫贴于步骤(一)的划膜板的nc膜下端，并使1.5mm的金垫后端搭在nc膜上，然后将步骤(三)的样本垫贴于金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端，再将吸水垫贴于pvc板后端，并使1.5mm的吸水垫前端搭在nc膜后端获得贴板，最后将贴板切割成3.1mm的试纸条，得牛促绒毛膜性腺激素hcg检测试纸。
73.其中，所述igg包被液按照以下方法制备：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述igg包被液；所述hcg包被液按照以下方法制备：将160～180mg牛的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体hcgmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，制得所述hcg包被液；所述胶体金结合物稀释液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲
氨基甲烷、0.2份的聚乙烯吡咯烷酮、5份的蔗糖、0.9份的氯化钠、0.5份的牛血清白蛋白、3份的羊血清、0.15份的吐温20、100份的纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；所述金溶液按照以下方法制备：将质量浓度为1％的氯金酸溶液2份、质量浓度为1％的柠檬酸钠加入纯化水至100份，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，制得金溶液；所述封闭液按照以下方法制备：将0.005份的牛血清白蛋白溶解在300份的纯化水中，再加入30份碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；所述样本垫处理液按照以下方法制备：将0.605份的三羧甲氨基甲烷、1.5份的氯化钠完全溶解在100份的纯化水中，得样本垫处理液。
74.本申请所述hcg比色卡为常规产品。
75.下面通过对比实验证明本发明的效果：
76.采用实施例1～3的方法，分别对120头母牛进行检测，其中将120头牛分为三组，每组40头，分别用与实施例1～3的方法进行检测，检测结果如下：
77.第一组有37头怀孕，且均为活胎，3头没有怀孕；第二组有36头怀孕，有35头活胎，1头胚胎停育，4头没有怀孕；第三组有34头怀孕，有32头活胎，2头胚胎停育，6头没有怀孕。准确率为100％。
78.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。