一种细胞密度测量方法与流程

本发明涉及细胞量化分析、细胞工程实验装置领域，具体涉及一种新型的细胞密度测量方法。

背景技术：

在过去的十几年里，医学、化学和生物学领域中对溶液微小粒子密度计算与检测的需求越来越多，要求也越来越高。在计算溶液中细胞密度时，传统的粒子计数检测方法主要为劳动密集型、消耗时间多的人工计数；传统的在芯片上利用阻抗法进行细胞计数的微流通道，在实际使用时发生细胞堵塞的机率很高，严重地影响了细胞计数的工作。

为了得到某一阶段的流体体积，传统方法中常使用注射泵设定固定流速，但其流速可能会受外界影响而不稳定，如果按照设定的固定流速进行计算的话，最终会导致计算的细胞密度不准确，同时这种方式还不便于系统的集成；此外，传统的细胞密度测量方法中溶液流速测量的成本昂贵、精度不高。

技术实现要素：

针对现有技术的技术缺陷，本发明的目的是提供一种计数准确、流速测定准确、适用性广泛的细胞密度测量方法。

本发明的第一方面提供一种细胞密度测量方法，该方法采用集成流式计数装置统计一定时间的细胞数量；采用流量测量装置计算液体的流量。其中，用于统计细胞数量的集成流式计数装置可采用电阻抗技术和/或集成光纤技术。

在具体实施中，用于统计细胞数量的集成流式计数装置可使用计数电极，且计数电极与流量测量装置的流量传感器连接在微流控芯片上。其中用于计算液体流量的流量传感器可以是测温电极。

本发明的第二方面提供一种用于细胞密度测量的微流控芯片，包括入口、入口端微流通道、计数通道、出口端微流通道、出口、计数电极、测温电极。

其中微流通道提供溶液处理操作空间，长度为24mm，宽度为10-5000μm，主要功能为提供待处理液体的操作空间。入口与出口基于微流通道对称，其入/出口宽度为10-5000μm，主要功能为作为细胞溶液注入及流出的通道，计数通道同为矩形结构，其长度为3-1000μm，宽度为10-100μm。主要功能是用于限定单个细胞通过，并减小细胞通过引起的阻抗峰值宽度，便于细胞计数和流通。

计数电极有两个且都垂直于技数通道并等距排列，单个电极的宽度为10-5000μm，长度为200-500μm。两个电极的间距为200-595μm。使两电极外接引线，将引线接入外部的阻抗仪上用于观察计数通道中阻抗的变化，通过观察阻抗峰值的个数来进行细胞计数。

测温电极垂直于出口端微流通道等距排列，电极的宽度为10-20μm，长度为2000-10000μm。该电极测温部分的电阻占整个电极电阻的60-90％，测温电极的主要功能为通过检测测温部分温度的变化来得出流体流速。测温电极测温处的形状设计为蛇形如图1，目的在于更好地让流速同温度，同电阻值进行关联。

本发明的第三方面提供一种集成流式计数及流量测量装置，包括上述的微流控芯片，还包括阻抗仪和外接测量电路。其中阻抗仪与计数电极使用引线相连，外接测量电路与测温电极使用引线相连。

溶液以任意滴加或流动方式经入口进入入口端微流通道，溶液中的粒子以单个形式通过计数通道，当粒子流过两个计数电极之间，阻抗仪出现波峰，用于计数。

根据本领域技术人员的理解，使用上述细胞密度测量方法或上述微流控芯片或上述的集成流式计数及流量测量装置，用于检测溶液微小粒子密度也属于本发明保护的范围。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所述细胞密度测量方法，使用集成流式计数装置统计一定时间的细胞数量；采用流量测量装置计算液体的流量，计数准确、使用方便、便于后续系统的集成，展现出良好的发展前景。

(2)本发明所用的微流控芯片系统具有实时记录细胞个数和实时测量流体流速的功能，可以精确地得出某一个时间段内的细胞密度。

(3)本发明所用的集成流式计数及流量测量装置，无复杂机械结构，使用场景广，可进一步用于医学、化学和生物学领域中对溶液微小粒子的密度计算与检测。

附图说明

图1为本发明集成流式计数及流量测量装置的示意图。

图2为本发明实施例2荧光微球实验中，显微镜及抗阻仪观察到的现象。

图3为本发明实施例3中hela细胞计数实验中，显微镜及抗阻仪观察到的现象。

图4为本发明实施例4中流量传感器的恒温差电路示意图。

图5为本发明实施例4中流量传感器的输出特性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若无特殊说明，实施例中所用实验试剂、耗材均为市售；

实施例1

细胞密度测量装置示意图如图1所示，其中，微流控芯片的总长度为32mm，芯片总宽度为200μm，芯片深度为300μm；包括微流流道、计数通道、计数电极、测温电极。

微流通道为矩形结构，其长度为24mm，宽度为200μm，深度为100μm，主要功能为提供待处理液体的操作空间。入口与出口基于微流通道对称，其入/出口宽度为200μm，主要功能为作为细胞溶液注入及流出的通道。计数通道同为矩形结构，其长度为1000μm，宽度为10μm。主要功能是用于限定单个细胞通过，并减小细胞通过引起的阻抗峰值宽度，便于细胞计数和流通。

阻抗法细胞计数是将流过微流通道的细胞简化为一个微小的均匀绝缘的球状颗粒，给流体通道旁边的外加电极施加一个适当频率的交流电信号或者直流信号，这样当细胞流过特定区域时，该区域的电流发生变化，因此其阻抗也发生变化。通过此原理，可观察相应的阻抗信息来进行细胞的计数。

计数电极有两个且都垂直于微流通道并等距排列，单个电极的宽度为100μm，长度为500μm，两个电极的间距为595μm。使两电极外接引线，将引线接入外部的阻抗仪上用于观察计数通道中阻抗的变化，通过观察阻抗峰值的个数来进行细胞计数。

测温电极垂直于出口端微流通道等距排列，电极的宽度为20μm，长度为3580μm。该电极测温部分的电阻占整个电极电阻的85％，测温电极的主要功能为通过检测测温部分温度的变化来得出流体流速。给测温电极施加固定电压后，当流体流过测温电极的测温电阻时，其阻值会发生变化。当流速缓慢时，测温部分温度较高其阻值较大；当流速快速时，测温部分温度较低其阻值较小。鉴于此目的，将测温电极的测温部分设计成如图1所示的图案，测温电阻为蛇形设计，这样的设计便于加强流速，温度，电阻值三者的联系。

实施例2荧光微球计数实验

使用实施例1中的芯片对20微米的荧光微球作微粒计数实验。将芯片放置在电子显微镜上，左侧通道为入口，使用搭建在微泵上的针管，分别通入di水、微球水溶液，流速为5μl/min。显微镜及阻抗仪下观察现象如图2。

从实验现象可以看出，每当荧光小球流过两个计数电极之间时，阻抗仪上会出现一个波峰，通过波峰的数值来记录流过的小球数量。

实施例3hela细胞计数实验

将芯片放置在电子显微镜上，左侧两通道为入口，使用搭建在微泵上的针管，分别通入hela细胞培养液、pbs溶液，流速为5μl/min，采用差分测量的方法，消除了低频漂移的影响。显微镜及阻抗仪下观察的现象如图3。

从实验现象可以看出，每当计数电极之间通过细胞时，阻抗仪上都会出现一个对应的峰值，通过向上峰值的个数，可以得出流过的细胞个数。

实施例4

流量传感器采用恒温差电路(见图4)对流体流量进行读取，输出特性如图5所示。流体体积计算公式：v＝微流体的横截面积×流速×时间；经多次测试，在充分混合的情况下，流体体积计数误差在5％以内。

实施例5细胞密度测定

使用商用计数装置及本发明所述集成流式计数及测量装置来计算溶液中细胞密度。

对2个不同密度的细胞进行充分的混合。使得细胞均匀的分布在液体中，采用商用仪器(countessiifl)及本发明所述装置进行测定，并计算密度，实验结果如表1所示。实验结果显示，本发明提供的细胞密度测定装置与常用仪器均可完成细胞密度测定的需求，本发明提供的装置可以自动化集成到整个细胞生产流水线中，可以通过计数和体积的测量自动化的实现细胞密度的测量；商用光学方法计数仪，需要人工加样等操作且必须固定体积的样本，降低了精度和方便性。

表1不同装置细胞密度测定结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。