白细胞介素-6的检测试剂、试纸、试剂盒及其应用的制作方法

[0001]
本发明实施例涉及激素检测领域，具体涉及一种白细胞介素-6的检测试剂、试纸、试剂盒及其应用。


背景技术：

[0002]
白细胞介素-6，简称白细胞介素-6(白细胞介素-6)，是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种，主要由巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、淋巴细胞以及t细胞等多种细胞产生。白细胞介素-6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。开发能够快速、特异的检测血液中的白细胞介素-6的含量对多种疾病的早期诊断、治疗以及预后具有重要作用。目前，白细胞介素-6的检测主要方法为化学发光法和酶联免疫法。
[0003]
专利cn104330551a公布了一种基于化学发光法的免疫荧光定量检测白细胞介素-6的试剂盒，以异硫氰酸荧光素标记的白细胞介素-6包被抗体和碱性磷酸酶标记的白细胞介素-6标记抗体制备抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂，双夹心法结合白细胞介素-6，以新型化学发光底物alps为底物，用化学发光仪检测发光强度进行定量。然而该试剂盒的制备步骤较复杂，需要成本较高，检测时需要水浴、分离等过程，操作多，耗时长。
[0004]
专利cn103969438a公布了一种采用定量夹心酶联免疫方法来检测白细胞介素-6。然而该方法检测步骤有酶标板的包被及封闭、标准品或被检血清的处理、单克隆抗体检测、检测过程中孵化时间长、洗板次数多，需要配套设备和专业人员。
[0005]
本发明人通过研究发现现有技术中：化学发光法和酶联免疫法均检测步骤多耗费时间较长。荧光免疫层析法是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，可根据荧光强度对物质进行定性定量分析，具有操作简单、灵敏度高、选择性强、准确度高等优点。因此，本领域有必要尝试开发基于荧光免疫层析法的白细胞介素-6检测试剂。


技术实现要素：

[0006]
本发明实施方式的目的在于提供一种白细胞介素-6的检测试剂，该检测试剂基于荧光免疫层析法开发，使得使用该检测试剂检测白细胞介素-6时操作简单、灵敏度高、选择性强、准确度高。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种白细胞介素-6的检测试剂，所述白细胞介素-6的检测试剂包含标记有白细胞介素-6抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球；所述羧基修饰时间分辨荧光微球通过链霉亲和素和生物素被白细胞介素-6抗体标记。
[0008]
本发明实施方式相对于现有技术而言，白细胞介素-6的检测试剂基于荧光免疫层析法开发，利用时间分辨荧光微球的具有极宽的stoke位移、极长的荧光猝灭时间和长荧光半衰期的稀土离子做标记物的优势，可消除基质干扰和降低背景干扰，有效提升检测灵敏度，利用偶连白细胞介素-6抗体特异性抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球，提高了标记物的稳定性，此外利用羧基修饰时间分辨荧光微球与链霉亲和素做修饰手臂，更易与生物素
化的抗体结合，由于链霉亲和素上含有四个相同的可结合生物素的肽链，放大终反应，提高了灵敏度；这种结合的亲和常数百万倍于一般抗原抗体反应，故使用本发明的白细胞介素-6的检测试剂测定白细胞介素-6的准确度和重复性得以提高；此外，这种结合具有高度的专一性，使得使用本发明的白细胞介素-6的检测试剂检测白细胞介素-6的选择性得以提升。此外，使用本发明的白细胞介素-6检测试剂检测白细胞介素-6无须进行检测时需要水浴、分离等过程，也无须进行检测孵化、洗板和分离等过程，只需将样品稀释后滴入加样孔，减少了处理步骤，操作更简单。
[0009]
本发明中的羧基修饰的时间分辨荧光微球采用稀土离子作为标记物，优选地，采用具有较长荧光半衰期的稀土离子作为标记物，例如：eu
3+
、sm
3+
等。
[0010]
本发明中羧基修饰的时间分辨荧光微球以螯合形式包被标记物，具体地，因此，本发明的白细胞介素-6的检测试剂可在固相界面发生反应，灵敏度优于传统化学发光法和酶联免疫法，且优于普通胶体金或有色乳胶免疫层析法1～3个数量级，可达到pg/ml。
[0011]
本发明中的羧基修饰的时间分辨荧光微球指的是时间分辨荧光微球外表面修饰有羧基，时间分辨荧光微球外表面修饰的羧基的数量不做限定，修饰的羧基以尽可能均一覆盖在时间分辨荧光微球外表面为佳。
[0012]
进一步地，本发明中的羧基修饰的时间分辨荧光微球表面还修饰有含有碳原子的氨基酸，修饰有含有碳原子的氨基酸的羧基修饰的时间分辨荧光微球在表面基团与目标蛋白偶连时，具有更适宜的空间距离和位阻，有利于后续与白细胞介素-6特异性结合，增加其灵敏度；优选地，含有碳原子的氨基酸为含有6个碳原子的氨基酸，含有6个碳原子的氨基酸相对更稳定，可使羧基修饰的时间分辨荧光微球长时间内维持较高的灵敏度。
[0013]
进一步地，一实施例中，所述含有碳原子的氨基酸为氨基正己酸。
[0014]
一实施例中，所述羧基修饰时间分辨荧光微球与所述含有碳原子的氨基酸的质量比为1：16～1：15；
[0015]
所述羧基修饰时间分辨荧光微球与链霉亲和素的质量比为10：1～12：1；
[0016]
所述羧基修饰时间分辨荧光微球与白细胞介素-6抗体的质量比为1：1～1：1.5；
[0017]
所述白细胞介素-6与生物素的质量比为10：1～12：1。
[0018]
本发明第二方面还提供了上述白细胞介素-6的检测试剂的制备方法，包括步骤：
[0019]
步骤一、在活性剂存在下，将羧基修饰时间分辨荧光微球与链霉亲和素进行偶联反应，从而得到活化的链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球；
[0020]
步骤二、将生物素标记的白细胞介素-6抗体与前述步骤一得到的活化的链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球进行偶联反应，从而得到标记有白细胞介素-6抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球；
[0021]
步骤三、封闭剂处理前述步骤二得到的标记有白细胞介素-6抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球，从而得到所述白细胞介素-6的检测试剂。
[0022]
一实施例中，所述方法步骤一前还包括步骤：
[0023]
步骤四、在活性剂存在下，将羧基修饰时间分辨荧光微球与含有碳原子的氨基酸进行偶联反应，从而得到连接有含有碳原子的氨基酸的羧基修饰时间分辨荧光微球。
[0024]
一实施例中，所述活性剂为含有-n＝c＝n-结构片段的有机化合物和/或nhs。
[0025]
一实施例中，所述活性剂为碳化二亚胺和/或nhs。
[0026]
一实施例中，所述步骤一使用的活性剂为碳化二亚胺，所述步骤二使用的活性剂为碳化二亚胺和nhs。
[0027]
一实施例中，所述步骤三使用的封闭剂为酪蛋白、牛血清白蛋白、血清、乙醇胺和/或脱脂奶粉。
[0028]
本发明第三方面还提供了一种白细胞介素-6的检测试纸，包括：底板、固定于所述底板的样品垫、标记垫、层析膜和吸水垫；
[0029]
所述样品垫、标记垫、层析膜和吸水垫依次排列在底板上且顺次接触；
[0030]
所述标记垫上喷有第一检测试剂和第一质控试剂；所述第一检测试剂为上述检测试剂；所述第一质控试剂包括标记有兔抗鸡igy抗体；
[0031]
所述层析膜远离标记垫的一端设置有质控线，所述质控线上固定包被有第二质控试剂，所述第二质控试剂包含兔抗鸡igy抗体；
[0032]
所述层析膜靠近标记垫的一端设置有检测线，所述检测线上固定包被有第二检测试剂；所述第二检测试剂包括白细胞介素-6抗体。
[0033]
在一实施例中，所述标记垫为玻璃纤维垫。
[0034]
在一实施例中，所述标记垫的制备包括以下步骤：将第一检测试剂和第一质控试剂混合；得到的混合物经稀释液稀释喷在玻璃纤维垫上，烘干，从而得到所述的标记垫。
[0035]
在一实施例中，所述标记有兔抗鸡igy抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球的制备方法包括以下步骤：
[0036]
在活性剂(edc)存在下，将羧基修饰时间分辨荧光微球与6个碳的氨基酸进行偶联反应，从而得到连接有6个碳的氨基酸的羧基修饰时间分辨荧光微球；
[0037]
在活性剂(edc和nhs)存在下，将前述步骤得到的连接有6个碳的氨基酸的羧基修饰时间分辨荧光微球球与链霉亲和素进行偶联反应，从而得到活化的链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球；
[0038]
将兔抗鸡igy抗体与前述步骤得到的活化的链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球进行偶联反应，从而得到标记有兔抗鸡igy抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球。
[0039]
在一实施例中，所述样品垫的制备方法包括以下步骤：所述样品垫经过样品垫处理液处理；所述样品垫处理液含有含0.2mg/ml异嗜性抗体阻断剂、rbc抗体、0.25％nacl、表面活性剂、ph 7.0的bbs。
[0040]
在一实施例中，所述样品垫处理液的用量为0.083～0.095ml样品垫处理液/cm2样品垫。
[0041]
在一实施例中，所述标记垫为玻璃纤维垫。
[0042]
在一实施例中，所述标记垫的制备包括以下步骤：将第一检测试剂和第一质控试剂混合；得到的混合物经稀释液稀释喷在玻璃纤维垫上，烘干，从而得到所述的标记垫。
[0043]
在一实施例中，所述标记有兔抗鸡igy抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球的制备方法包括以下步骤：
[0044]
在活性剂(edc)存在下，将羧基修饰时间分辨荧光微球与6个碳的氨基酸进行偶联反应，从而得到连接有6个碳的氨基酸的羧基修饰时间分辨荧光微球；
[0045]
在活性剂(edc和nhs)存在下，将前述步骤得到的连接有6个碳的氨基酸的羧基修饰时间分辨荧光微球球与链霉亲和素进行偶联反应，从而得到活化的链霉亲和素标记的羧
基修饰时间分辨荧光微球；
[0046]
将兔抗鸡igy抗体与前述步骤得到的活化的链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球进行偶联反应，从而得到标记有兔抗鸡igy抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球。
[0047]
在一实施例中，所述样品垫的制备方法包括以下步骤：所述样品垫经过样品垫处理液处理；所述样品垫处理液含有含0.2mg/ml异嗜性抗体阻断剂、rbc抗体、0.25％nacl、表面活性剂、ph 7.0的bbs。
[0048]
在一实施例中，所述样品垫处理液的用量为0.083～0.095ml样品垫处理液/cm2样品垫。
[0049]
本发明第四方面提供了一种白细胞介素-6的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述检测试纸。
[0050]
在一实施例中，所述检测试纸置于壳体中；所述壳体包括上壳和下壳；所述上壳开设有加样孔和观察孔。
[0051]
本发明第五方面提供了一种白细胞介素-6的检测方法，包括步骤：
[0052]
步骤a、取待检测样本与样本稀释液混合；
[0053]
步骤b、将步骤a得到的混合液加至权利要求8所述的检测试纸的样品垫上进行免疫层析反应；
[0054]
步骤c、检测所述检测试纸上检测线处的荧光值，根据标准曲线得到待检测样本中白细胞介素-6的含量。
[0055]
在一实施例中，所述待检测样本为血清样本、血浆样本或全血样本。
[0056]
在一实施例中，所述样本稀释液为包含s9、nacl、nan3的ph为8.0的tris-hcl缓冲液。
[0057]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0058]
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
[0059]
图1是根据本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒中的检测试纸的结构示意图；
[0060]
图2是根据本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒的样品结构示意图；
[0061]
图3是根据表一质控品浓度和使用本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒测得样本信号t1/c的平均值绘制的标准曲线；
[0062]
图4是根据本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒与罗氏电化学发光法检测白细胞介素-6试剂盒的相关性曲线。
具体实施方式
[0063]
本发明的第一方面提供了一种白细胞介素-6的检测试剂，白细胞介素-6的检测试剂包含标记有白细胞介素-6抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球；羧基修饰时间分辨荧光微球通过链霉亲和素和生物素被白细胞介素-6抗体标记。
[0064]
本发明实施方式相对于现有技术而言，白细胞介素-6的检测试剂基于荧光免疫层析法开发，利用时间分辨荧光微球的具有极宽的stoke位移、极长的荧光猝灭时间和长荧光半衰期的稀土离子做标记物的优势，可消除基质干扰和降低背景干扰，有效提升检测灵敏度，利用偶连白细胞介素-6抗体特异性抗体的羧基修饰时间分辨荧光微球，提高了标记物的稳定性，此外利用羧基修饰时间分辨荧光微球与链霉亲和素做修饰手臂，更易与生物素化的抗体结合，由于链霉亲和素上含有四个相同的可结合生物素的肽链，放大终反应，提高了灵敏度；这种结合的亲和常数百万倍于一般抗原抗体反应，故使用本发明的白细胞介素-6的检测试剂测定白细胞介素-6的准确度和重复性得以提高；此外，这种结合具有高度的专一性，使得使用本发明的白细胞介素-6的检测试剂检测白细胞介素-6的选择性得以提升。此外，使用本发明的白细胞介素-6检测试剂检测白细胞介素-6无须进行检测时需要水浴、分离等过程，也无须进行检测孵化、洗板和分离等过程，只需将样品稀释后滴入加样孔，减少了处理步骤，操作更简单。
[0065]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0066]
实施例1白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂制备
[0067]
一、羧基修饰时间分辨荧光微球溶液加刚性手臂
[0068]
取羧基修饰时间分辨荧光微球溶液200ml，置于超速离心机上，转速40000rpm，离心40min后弃上清，沉淀用ph为8.4的硼酸盐缓冲溶液(bbs)分散至约80ml，磁力搅拌器搅拌2小时后绢丝过滤，得到胶乳溶液。取90ml胶乳溶液后倒入500ml烧杯中，用量筒量取333ml氨基正己酸溶液(3.32g/l)加入上述烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上搅匀。用分析天平准确称取0.83g edc粉末，用移液管吸取10mlph为7.2磷酸缓冲盐溶液(pbs)溶解edc粉末，待溶解后加入上述羧基修饰时间分辨荧光微球溶液中，搅拌过夜。次日收集洗涤好的空白胶乳，即得有刚性手臂的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液，2-8℃保存待用。
[0069]
二、链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球制备
[0070]
2.1活化的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液制备
[0071]
取步骤一制得的带有刚性手臂的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液1ml，加入9ml ph为6.2的0.1mol/l的乙磺酸缓冲液(mes)混合均匀后加入浓度为1.0-1.5g/l的edc溶液0.42ml以及浓度为1.0-1.5g/l的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)0.42ml活化(edc与nhs比例1:1)，室温条件下温和搅拌20min；离心洗涤，去上清，沉淀用0.1mol/l pbs重悬，振荡、超声处理，即得到活化的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液。
[0072]
2.2链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液
[0073]
取链霉亲和素0.005g溶于ph为6.7的pbs缓冲液中，加入到步骤2.1得到的经过活化的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间3h；转速13000r离心20min，沉淀用含有0.05％tween20的pbs重复洗涤后得到的微球超声分散重悬于pbs缓冲
液中，加入赖氨酸0.0015g，室温轻微震荡30min，离心洗涤，即得链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液。
[0074]
三、生物素标记白细胞介素-6抗体的制备
[0075]
将待生物素化的白细胞介素-6抗体用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph 8.0)或0.5mol/l硼酸缓冲液(ph 8.6)稀释到1mg/ml，交互用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph 8.0)或0.5mol/l硼酸缓冲液(ph 8.6)对待生物素化的白细胞介素-6抗体进行充分透析；取透析后的待生物素化的白细胞介素-6抗体1ml，加入120μl n-羟基琥珀酰亚胺生物素(nhsb)溶液，于室温下搅拌充分后保温2～4小时，再加入9.6μl 1mol/l的nh4cl溶液，室温下搅拌10min，在4℃，用pbs充分透析，除去游离的生物素；将透析后的样品过1ml的分子筛柱，以pbs缓慢洗脱，收集1～3ml之间的洗脱物，加入叠氮钠(终浓度0.5g/l)及1.0g/l bsa，即得生物素标记白细胞介素-6抗体溶液。
[0076]
将制备的生物素标记白细胞介素-6抗体溶液置4℃，避光保存；或加入50％重蒸甘油，置于-20℃保存备用。
[0077]
四、生物素标记的白细胞介素-6抗体-羧基修饰时间分辨荧光微球-链霉亲和素的制备
[0078]
取111μl链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液加入0.44ml 0.05m的ph为6.5的bbs溶液后再加水定容至0.88ml，涡旋后加入edc 0.42ml活化，后加入0.5mg生物素标记白细胞介素-6抗体，25
°
过夜搅拌，转速14000r离心10min，加入1ml0.05m ph为8.0的bbs分散后加入10μl2％酪蛋白封闭，即得生物素标记的白细胞介素-6抗体-羧基修饰时间分辨荧光微球-链霉亲和素。置于2-8℃保存待用。
[0079]
实施例2：质控试剂的制备
[0080]
五、鸡igy抗体-羧基修饰时间分辨荧光微球-链霉亲和素的制备
[0081]
取111μl链霉亲和素标记的羧基修饰时间分辨荧光微球溶液加入0.44ml 0.05m的ph为6.5的bbs溶液后再加水定容至0.88ml，涡旋后加入edc 0.42ml活化，后加入0.5mg鸡igy抗体，25
°
过夜搅拌，转速14000r离心10min，加入1ml0.05m ph为8.0的bbs分散后加入10μl2％酪蛋白封闭，即得鸡igy抗体-羧基修饰时间分辨荧光微球-链霉亲和素。置于2-8℃保存待用。
[0082]
实施例3：检测试纸的制备
[0083]
六、样品垫的制备
[0084]
用样品垫处理液(含0.2mg/ml异嗜性抗体阻断剂、rbc抗体适量、0.25％nacl、表活适量、ph 7.0的bbs)，用量为0.095ml/cm2处理样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜，即得样品垫。
[0085]
七、标记垫的制备
[0086]
将步骤四得到的生物素标记的白细胞介素-6抗体-羧基修饰时间分辨荧光微球-链霉亲和素及步骤五得到的鸡igy抗体-羧基修饰时间分辨荧光微球-链霉亲和素分别用微球稀释液(含4％牛白、2％蔗糖、4％nacl)按12.5％、2％的比例稀释后，在标记垫上均匀喷涂一条线(即微球线)，用量为1.2μl/cm处理标记垫。置于烘箱中，37℃烘干过夜，即得标记垫。
[0087]
八、层析膜的制备
[0088]
用包被缓冲液(含2％蔗糖、2％nacl的200mm pbs缓冲液)将生物素标记白细胞介素-6抗体和鸡igy抗体分别稀释至生物素标记白细胞介素-6抗体1.2mg/ml、鸡igy抗体1mg/ml，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔8mm，用量为1μl/cm硝酸纤维素膜，在湿度<30％，温度37℃下在烘箱中晾干20小时，即得层析膜。封袋，备用。
[0089]
九、检测试纸及其制备
[0090]
9.1检测试纸
[0091]
如图1所示，检测试纸包括底板7，固定于底板7上的样品垫1、标记垫2及层析膜3；样品垫1部分覆盖在标记垫2上，样品垫1设有加样区，加样区设置在样品垫1的不与标记垫2重叠的部分。层析膜3部分被标记垫2覆盖，层析膜3上划有检测线4及质控线5，检测线4划在靠近层析膜3上靠近标记垫2的一端，质控线5划在层析膜3上背离标记垫2的一端。此外，底板7上固定有吸水纸6，吸水纸6的一端部分覆盖在层析膜3上，用于吸收层析后多余的样品。
[0092]
使用时，样品从样品垫1的加样区依次流经标记垫2、层析膜3上的检测线4及质控线5，流至吸水纸6。
[0093]
9.2检测试纸的制备
[0094]
在底板7(尺寸为70*300mm)上顺次相互搭接地粘贴实施例3制备的样品垫1(尺寸为17*300mm)、实施例3制备的标记垫2(30*5mm，玻璃纤维材质)、实施例3制备的层析膜3(尺寸为25*300mm)和吸水纸6(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成3.85mm宽度的试纸条，即得检测试纸。
[0095]
实施例4白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒的制备
[0096]
十、检测试剂盒的制备
[0097]
将实施例3制备的检测试纸组装在由上壳和下壳插合而成的外壳中(下壳上设置有供上壳插入的卡槽)。检测试纸也可以从外壳中取出。
[0098]
如图2所示，上壳开设有两个开孔，分别为加样孔10和判读窗11；加样孔10与实施例3制备的检测试纸的样品垫1对应设置。上壳上方还设有条形码12。下壳上设有固定检测试纸条的卡口。判读窗11与实施例3制备的检测试纸的硝酸纤维素膜3上的检测线4和质控线5对应设置，判读窗11用于观察检测线4和质控线5的变化。
[0099]
对比例1
[0100]
对比例1中检测试剂盒的制备与本发明第三方面所述的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法大致相同，不同之处在于：
[0101]
对比例1中检测试剂的制备与实施例1不同之处在于直接将白细胞介素-6抗体偶联在羧基修饰时间分辨荧光微球上。
[0102]
对比例1中的质控试剂的制备与实施例2的不同之处在于直接将兔igy抗体偶联在羧基修饰时间分辨荧光微球微球上。
[0103]
在标记垫的制备中，用对比例1中的检测试剂代替步骤四得到的白细胞介素-6抗体标记的羧基修饰时间分辨荧光微球；用对比例1中的质控试剂代替步骤五得到的兔igy抗体标记的羧基修饰时间分辨荧光微球。
[0104]
实施例5白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒的定量检测
[0105]
本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒中，每盒均含有标准曲线的id
卡，通过时间分辨荧光检测试纸测定不同浓度的质控品，以质控品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入id卡并生成标准曲线，通过干式荧光免疫分析仪可读取时间分辨荧光检测试纸上对应的标准曲线信息并测得相应浓度。
[0106]
5.1、标准曲线绘制
[0107]
向实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒中加入不同预设的浓度的白细胞介素-6质控品，预设的白细胞介素-6质控品浓度分别是1000pg/ml、500pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、5pg/ml、1pg/ml，层析15min后，通过广州蓝勃生物科技有限公司生产的afs-1000型干式荧光免疫分析仪读取c、t线荧光信号及c/t值，实验结果及分析见表1：
[0108]
表1
[0109]
浓度点/pg
·
ml-1
t/c10.0165735250.0417859100.0752147200.1353864500.29785001000.56293662000.99639775002.122327110004.0111982
[0110]
以白细胞介素-6质控品浓度和样本信号t1/c平均值分别绘制标准曲线，如图3所示。其中r2值为0.9973，线性好，可通过该标线对样品中所含白细胞介素-6浓度进行浓度定量测定。
[0111]
5.2样本稀释液制备
[0112]
取0.05m ph为8.0的tris-hcl缓冲液1l，加入10ml的表面活性剂s9(tetronic 1307)、9gnacl、0.1％nan3.1g，超声直至固体全部溶解，混匀，即得样本稀释液。
[0113]
5.3样品测定
[0114]
取待测样品，试用步骤5.2中制备的样本稀释液处理，后用实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒检测样品中的白细胞介素-6，具体操作步骤如下：
[0115]
a.将试剂盒取出，放置于室温(25℃)平衡至少30分钟；
[0116]
b.将id卡放于荧光免疫定量分析仪感应区，并在仪器“设置”界面点击“读卡”按钮；
[0117]
c.取出检测卡，放于平整台面上；
[0118]
d.若待检样本为血清或血浆，则吸取40μl待检样本，加入空的容器中，再加入80μl样本稀释液充分混匀，吸取80μl上述混匀物加入检测卡的加样孔内，室温(25℃)反应15分钟；
[0119]
e.若待检样本为全血，则先混匀全血样本，后吸取40μl待检样本，加入空的容器中，再加入80μl样本稀释液充分混匀，吸取80μl上述混匀物加入检测卡的加样孔内，室温(25℃)反应15分钟；
[0120]
f.15分钟后立即将检测卡放入荧光免疫定量分析仪，在仪器“检测”界面点击“测试”按钮进行检测。
[0121]
实施例6白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒的性能测试
[0122]
6.1检测限
[0123]
将空白样本重复使用实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒重复测定20次，测定结果见表2。计算20次测定结果的均值m与标准差sd，根据下面的计算公式计算检测限：
[0124]
检测限＝m+2sd。
[0125]
表2
[0126]
[0127][0128]
经计算，检测限为0.96pg/ml，低于1pg/ml，表明实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒灵敏度高。
[0129]
6.2线性范围
[0130]
在1～1000pg/ml线性范围内，取理论浓度分别为1pg/ml、180pg/ml、360pg/ml、540pg/ml、720pg/ml、900pg/ml的白细胞介素-6标准样，使用实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒对每个标准样重复测定3次，计算测定平均值并与理论浓度进行线性分析，结果见表3。
[0131]
表3
[0132]
[0133][0134]
在1～1000pg/ml线性范围之内，实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒的线性相关系数r＝0.9976，结果表明，实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒在1～1000pg/ml线性范围内相关性高，实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒线性范围宽。
[0135]
6.3准确度
[0136]
选择白细胞介素-6浓度分别为5pg/ml、30pg/ml和500pg/ml的质控样作为检测样本，分别编号66401、66402、66403，使用实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒对上述3个样本进行3次重复测定，取其均值进行计算。结果如表4所示。
[0137]
表4
[0138]
质控样66401664026640314.538.253025.328.857034.426.7510av4.7331.23536.67sd0.49336.124030.5505cv10.42％19.61％5.69％靶值5.0030.00500.00偏离度-5.33％4.11％7.33％
[0139]
经计算，测量偏差均在10％以内，表明实施例4制备的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒准确度较好。
[0140]
6.4与电化学发光法检测试剂盒相关性分析
[0141]
采集临床白细胞介素-6血浆样本20份，用本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒分别和日立7180电化学发光法检测白细胞介素-6试剂盒进行检测。白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒，取血浆样本80μl+样本稀释液40μl充分混匀后取80μl加入到检测卡加样孔中，层析15min后通过广州蓝勃生物科技有限公司生产的afs-1000型干式荧光免疫分析仪读取浓度，同一样本分别采用对比系统罗氏电化学发光法检测白细胞介素-6试剂盒进行浓度检测。对两种试剂盒检测结果进行相关性分析，结果如图4和表5所示，其相关性好，r2＝0.9909；r＝0.9954。
[0142]
表5
[0143][0144]
实施例7对比例1制备的试剂盒性能测试
[0145]
7.1检测限
[0146]
用实施例6测定检测限的方法测定对比例1制备的试剂盒的检测限，具体操作为：将空白样本重复使用对比例1制备的试剂盒重复测定20次，测定结果见表6。计算20次测定结果的均值m与标准差sd，根据下面的计算公式计算检测限：
[0147]
检测限＝m+2sd。
[0148]
表6
[0149][0150]
结果显示，对比例1制备的试剂盒的检测限为3.110，低于本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒，本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒灵敏度更好。
[0151]
7.2线性范围
[0152]
用实施例6测定线性范围的方法测定对比例1制备的试剂盒的检测限，具体操作为：在1～1000pg/ml线性范围内，取理论浓度分别为1pg/ml、180pg/ml、360pg/ml、540pg/ml、720pg/ml、900pg/ml的白细胞介素-6标准样，使用对比例1制备的试剂盒对每个标准样
重复测定3次，计算测定平均值并与理论浓度进行线性分析，结果见表7。
[0153]
表7
[0154][0155]
7.3准确度
[0156]
选择白细胞介素-6浓度分别为5pg/ml、30pg/ml和500pg/ml的质控样作为检测样本，分别编号66401、66402、66403，使用对比例1制备的试剂盒对上述3个样本进行3次重复测定，取其均值进行计算。结果如表8所示。
[0157]
表8
[0158]
质控样66401664026640313.840.2438025.328.841034.426.7406av4.5031.91398.67sd0.75507.287116.2891cv16.78％22.83％4.09％靶值5.0030.00500.00偏离度-10.00％6.38％-20.27％
[0159]
结果显示，对比例1制备的试剂盒检测质控样66401、66402、66403相对靶值偏离度均大于本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒检测质控样66401、66402、66403的结果，本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒准确度更好。
[0160]
由于对比例1制备的试剂盒中，直接将白细胞介素-6抗体偶联在羧基修饰时间分辨荧光微球上，没有结合生物素的链霉亲和素做修饰手臂，故其灵敏度和准确度都差于本发明的白细胞介素-6的荧光免疫层析检测试剂盒；此外，对比例1制备的试剂盒中，羧基修饰的时间分辨荧光微球表面未修饰有含有碳原子的氨基酸，故对比例1制备的试剂盒抗原-抗体特异性反应时没有更适宜的空间距离和位阻，降低了对比例1制备的试剂盒灵敏度。
[0161]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。