一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法与流程

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一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法，属于生命科学分析技术领域。


背景技术：

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卡那霉素是一种提取于链霉菌、小单胞菌培养液或以天然品为原料半合成提取而得到的碱性氨基糖苷类抗生素。卡那霉素溶于水，对革兰氏阴性杆菌具有较强作用，同时价格便宜、可在临床上作为一种重要的抗感染药物。在目前，卡那霉素也是我国农业、畜牧业以及水产业中常用的兽药之一。由于动物源性食品中的卡那霉素可在人体内蓄积，对人体造成一定程度的伤害。例如，卡那霉素会影响耳蜗神经，从而诱发耳毒症，造成听力损伤。此外，卡那霉素对肾脏也有一定损伤，会导致肾功能衰竭，因此，卡那霉素的残留问题也越来越受到关注。为保障人类健康，世界各国对牛奶中卡那霉素残留的最大允许残留量(mrl)作出了规定要求，其中我国规定牛奶中卡那霉素的mrl值为200μg/kg。目前，国内外关于卡那霉素的检测方法主要有：微生物检测法、免疫检测法、理化检测法等。其中，微生物检测法操作简单，经济实用，但专一性差并且只能对有生物活性的物质进行检测，具有一定的局限性。理化检测法主要包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等，方法灵敏度较高，但检测程序复杂且仪器昂贵。因而进一步研究一种灵敏度高、易于操作、选择性高的新方法显得尤为重要。
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核酸适配体是通过指数配体富集进化技术(selex)筛选得到的对特定物质(小分子化合物、蛋白质、细胞、离子等)具有高度亲和性的一段单链dna或者rna。相对于免疫识别检测技术，适配体因具有易合成、化学性质稳定、易于修饰、无免疫原性、价格低廉等优势在生物传感领域得到快速发展。基于适配体建立的生物传感检测体系具有灵敏度高、特异性强等优点，自卡那霉素适配体筛选得到以来，各种卡那霉素的生物传感检测方法不断涌现出来。
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与此同时，为了提高检测性能，各种信号放大技术，如杂交链式反应、滚环扩增反应、纳米材料、聚合反应等被应用于生物传感领域。其中，原子转移自由基聚合反应(atrp)具有反应进程可控、反应单体广泛等优点，自90年代被提出以来在材料、合成等领域得到了大量应用，其在生物传感中的应用也得到科研工作者的青睐。


技术实现要素：

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针对现存技术不足，本发明目的是提供一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法，具有高特异性、高灵敏度等特点。
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为了实现上述目的，本发明的技术方案：
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一种基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法，包括以下步骤：
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(1)发卡dna的预处理
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卡那霉素dna适配体(发卡适配体序列为：5
’-
n
3-ttt ttt tgg ggg ttg agg cta agc cga ctc ggaacc ccc a-(ch2)
6-sh-3’)粉末溶解在te溶液中(10mm tris-hcl，1mm edta，ph＝7.4)并在95℃加热15min，然后缓慢冷却至室温；
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(2)金电极的预处理
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用800目、1000目、2000目及5000目砂纸打磨金电极各3-5min；然后用0.3μm和0.05μm的氧化铝悬浮液分别抛光裸露的金电极，再依次用99.99％的乙醇和超净水进行超声清洗；再将所处理过的金电极浸泡在新制备的溶液(30％的h2o2和98％的h2so4＝1∶3 v∶v)中10min；之后将电极放在0.5m h2so4中用循环伏安法在-0.2-1.5v的电位范围内以0.1vs-1
的扫速进行电化学处理，直至获得稳定的循环伏安图；最后用超净水冲洗电极表面，并用氮气吹干；
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(3)金电极的修饰
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将10μl 1μm于上述(1)中形成的含巯基发卡dna滴加到干净的金电极上并在37℃下孵育1.5h；然后金电极用te缓冲溶液冲洗两次；随后将金电极浸泡在2mm的mch溶液(溶解于70％的酒精)0.5h；再用te缓冲液冲洗电极；最后将10μl 100ng/ml的卡那霉素滴加在金电极表面并于37℃孵育1.5h；
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(4)电极反应
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将修饰后的金电极浸泡在含10μl pbib(4mm)、10μl cuso4(4mm)、10μl aa(8mm)和370μl蒸馏水的点击反应溶液中并在37℃下避光孵育40min；
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(5)eatrp反应
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将进行上述(4)后所得的金电极用te溶液冲洗十秒；随后放入含有50μl fmma(10mm)、50μl cu
2+
/me6tren(10mm)、500μl kbr(1m)、900μl dmf和3500μl kpf6(0.1mm)的溶液中，并在其表面施加一个恒定的负电位(-0.53v)去反应40min；再用线性伏安扫描法(lsv)扫描(初始电位：0v；最终电位：0.2v；扫描速率：1.0vs-1
)以去除沉积在电极表面的铜；最后用dmf和超纯水清洗电极；
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(6)电化学测定
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将进行上述(5)后所得的金电极放入1.0m liclo4溶液中并用方波伏安法(初始电位为0v，终止电位为0.6v，电位增量4.0mv，脉冲幅值25mv，频率15hz)对电极表面从头合成的电活性聚合物进行检测。
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本方法设计并基于cuaac和eatrp原理对卡那霉素进行检测，避免了目前常用信号策略中纳米材料和生物酶(易受外界环境如ph和温度影响)的使用，信号得到成倍的放大，灵敏度极大提高的同时，稳定性和重现性相对更高。建立了一种简单、灵敏的检测卡那霉素残留的方法，为今后的监管提供了方便。
附图说明
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图1为检测体系的构建原理示意图。
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图2为检测体系可行性验证方波伏安图。
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图3为不同浓度卡那霉素的检测结果图：(a)不同浓度的卡那霉素检测的方波伏安图(b)卡那霉素与对应电流强度的线性关系图。
具体实施方式
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实施例1.可行性验证
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首先在电极表面构建检测体系，如图1所示。紧接着进行检测体系的可行性验证，实验步骤同发明内容(1)-(6)。如图2所示，首先，不加卡那霉素(kana)，hairpin dna/mch/pbib/fmma修饰电极(曲线b)电流强度较弱。相反，加入kana后，hairpin dna/mch/kana/pbib/fmma修饰电极(曲线a)可以在0.3v处观察到明显的电流峰值，这是因为大量的fmma通过eatrp被引入到金电极上，产生了极大的电流信号。通过对比实验，充分证明了基于叠氮炔环加成和电化学调控原子转移自由基聚合的卡那霉素电化学检测方法的可行性。
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实施例2.灵敏度实验
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实验步骤同发明内容(1)-(6)，分别检测目标液中不同浓度的卡那霉素(100fg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)产生的电流强度大小来研究本发明方法对于卡那霉素的检测性能。如图3所示，电流强度随着卡那霉素的浓度增加而增加，这是因为卡那霉素的浓度越大，远离电极且暴露的n3数目越多，进行cuaac且引入的引发剂pbib越多，进而导致fmma电化学聚合物单体越多，产生的电流强度越来越强。电流最大峰强度与卡那霉素浓度的对数值在100fg/ml到100ng/ml范围内呈现良好的线性关系，线性方程为i＝0.7716+0.4280logc(r2＝0.9989)，检测限为7.59fg/ml。结果表明本发明方法具有较高的检测灵敏度、较低的检测限、优异的性能。