一种新型光助双极自供能适配体传感器件的构建方法与流程

1.本发明属于电化学生物传感技术领域，涉及一种基于光助双极燃料电池的自供能适配体传感器件的构建方法。


背景技术：

2.自供能型电化学传感器是一种新兴的电化学检测技术，与传统的电化学传感系统不同，自供能传感器无需要外加电源，可为自身传感过程供能，通过将目标物的浓度变化转换为电源信号(如开路电压、电流密度或功率等)的变化，实现目标物的定量检测。自供能型电化学传感技术在推动传感器微型化、便捷化和低成本化等方面具有独特优势，如：无需外加电源，仅由两个电极(阳极和阴极)实现电化学检测，利于微型化；简单的电压表/电流表即可输出检测信号，降低了设备成本，易于实现检测便捷化；此外，由于未施加额外电源，避免了一些电活性物质在电极表面的反应，提高了传感器的特异性。
3.目前自供能电化学传感器研究主要通过生物质燃料电池(biomass fuel cell，bfc)途径实现。但是，生物质燃料电池系统中具有生物活性成分，存在着操作复杂、反应条件苛刻和不稳定等缺点，只能实现生物质能/电能的单一能源转换。为了克服这些问题，基于光助燃料电池(photofuel cell，pfc)的自供能电化学传感器引起了研究人员的广泛关注。pfc型自供能电化学传感器采用光敏半导体材料代替生物催化剂，将太阳能和化学能转化为电能，是一种二维能源转换装置，具有电子传输快、操作简单、理化性质稳定和输出性能高等优点。根据电池中光电极的个数，pfc分为单极pfc和双极pfc。目前，大多数研究主要集中在单极pfc，即只有一个电极是光敏材料，可以响应太阳光，另一个电极选用贵金属催化剂pt、染料普鲁士蓝(pb)或一些电催化剂。为了提高太阳能利用效率，同时也是为了减少贵金属催化剂的使用，设计一种阴阳两极均为半导体光敏材料的双极pfc是很有意义的。双极pfc的构建，通常是以n-型半导体光阳极具有高于p-型半导体光阴极的费米能级为基础，确保驱动电子从光阳极流向光阴极。此外，在以往的报道中，自供能电化学传感器依然主要依靠电化学工作站采集和处理信号数据，难以实现现场检测，阻碍了其实际应用。因此，本发明采用万用表这一简单装备作为直接读出策略，替代了电化学工作站这种大体积的仪器，设计了一种便于现场检测的便携式自供能电化学传感器件。
4.磺胺二甲基嘧啶(smz)是一种广谱抗生素，作为兽医和畜牧业常用的饲料添加剂，在畜禽疾病的防治中发挥着重要作用。但是，过度使用smz导致的动物源性食品中的残留问题，严重威胁了人类健康。目前检测smz的方法有酶联免疫分析法、高效液相色谱法以及荧光免疫分析法等，虽然这些方法精确，但大多耗时、劳动密集、操作复杂，在实际应用方面存在局限性。因此，开发一种简单、快速、便携和低成本的分析方法是非常有必要的。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种集快速、简单、微型化、低成本化等优点为一体的便携式光助双极燃料电池自供能适配体传感器应用于smz的检测，利用简单万用表替代电化学工作站
作为直接读出策略。
6.本发明中自供能传感器件的构建包括如下步骤：
7.步骤1、制备光阳极材料黑二氧化钛(b-tio2)：
8.将钛酸四丁酯与乙醇混合，得到溶液a；将浓硝酸、乙醇和水混合，得到溶液b；将溶液a逐滴滴加到溶液b中，搅拌均匀，得到混合液c，转移至不锈钢高压釜中进行溶剂热反应，反应完毕后，得到固体产物二氧化钛；将得到的二氧化钛与硼氢化钠在研钵中研磨充分，转移至瓷坩埚中，在管式炉中氩气气氛下煅烧还原，反应完毕后，得到的固体产物即为b-tio2；
9.步骤2、制备光阴极材料三维氮掺杂石墨烯水凝胶负载氧化亚铜纳米球(cu2o/3dngh)：
10.首先，将氧化石墨烯分散液与尿素搅拌，转移至高压釜中进行溶剂热反应，反应完毕后，得到3dngh。然后，将硝酸铜溶于水，在磁力搅拌下滴入水合肼溶液，充分反应后离心洗涤，真空干燥，得到cu2o粉末。最后，将得到的cu2o与异丙醇、3-氨丙基三甲基硅烷混合，搅拌均匀，离心洗涤，得到带正电荷的表面功能化cu2o后再与3dngh水溶液充分搅拌，从而制备了固体产物cu2o/3dngh。
11.步骤3、修饰电极的制造：
12.将步骤1和步骤2中得到的b-tio2和cu2o/3dngh分散于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，分别得到b-tio2分散液、cu2o/3dngh分散液，将b-tio2、cu2o/3dngh分散液分别滴涂于面积固定的ito电极上，置于红外灯下烘干，得到的b-tio2/ito电极作为光阳极，cu2o/3dngh/ito电极作为光阴极。
13.步骤4、构建检测smz的光助双极自供能适配体传感器件
14.首先，在光阳极b-tio2/ito上滴涂壳聚糖(chit)溶液，置于红外灯下烘干。接着，将戊二醛(ga)溶液滴于电极表面，并置于室温下反应，反应完毕后，用pbs淋洗，除去电极表面多余的ga。用tris-hcl为溶剂配制smz适配体溶液，将smz适配体滴加在电极上，反应一段时间后，用pbs淋洗以除去过量的未吸附的适配体，然后滴加牛血清蛋白(bsa)溶液以封闭非特异性活性位点，最终得到适配体修饰的光阳极(aptamer/b-tio2/ito),与光阴极cu2o/3dngh/ito构成光助双极自供能适配体传感器件。
15.步骤1中，
16.所述溶液a中，钛酸四丁酯与乙醇的用量比为1～3ml：0.05～5ml；
17.溶液b中，浓硝酸、乙醇和水的用量比为0.05～0.15ml：0.05～5ml：0.1～1ml；
18.溶液a和溶液b混合时，钛酸四丁酯和浓硝酸的比例为1～3ml：0.05～0.15ml；
19.所述溶剂热反应的温度为160～200℃，反应时间为10～14h；二氧化钛与硼氢化钠的质量比为3：1；煅烧温度为300～400℃，时间为0.5～1.5h，升温速率为10℃/min。
20.步骤2中，
21.氧化石墨烯分散液和尿素的用量比例为50ml：2g，其中，氧化石墨烯分散液的浓度为1g/ml；所述溶剂热反应的温度为150℃，反应时间为10h。
22.硝酸铜、水、水合肼溶液的用量比例为0.25g：50ml：4ml；其中，水合肼溶液的浓度为0.5mol/l。
23.cu2o、异丙醇、3-氨丙基三甲基硅烷的用量比例为0.1g：10ml：0.1ml，搅拌时间为
12～36h。
24.得到的带正电荷的表面功能化cu2o与3dngh水溶液用量比为25～75mg：5～15ml，其中，3dngh水溶液的浓度为1g/ml，搅拌时间为2～6h。
25.步骤3中，b-tio2分散液、cu2o/3dngh分散液的浓度均为1-3mg/ml；b-tio2、cu2o/3dngh分散液滴加的量均为20～40μl，ito固定面积为0.09πcm2；
26.步骤4中，
27.所述chit的质量百分浓度为0.1％，滴加量10μl；
28.所述ga的体积百分浓度为2.5％，滴加量20μl；chit与ga反应时间为1～2h；
29.smz适配体序列为：5
′-
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2-tta gct tat gcg ttg gcc ggg ata agg atc cag ccg ttg tag att tgc gtt cta act ctc-3
′
；smz适配体浓度为3μm，滴加量为20～40μl，反应时间10～14h；bsa的质量百分浓度为3％。
30.将本发明制备的光助双极自供能适配体传感器件用于检测磺胺二甲基嘧啶smz的用途，具体步骤为：
31.(1)将不同浓度的smz溶液滴到aptamer/b-tio2/ito光阳极上，并在室温下孵育一段时间；
32.(2)将步骤(1)处理过的光阳极、光阴极cu2o/3dngh/ito放入含有的pbs的单室电解池中，氙灯光源同时垂直照射两个光电极，用万用表连接两极，直接收集电位信号；将电位值与smz浓度的对数值做标准曲线；
33.(3)将未知浓度的smz溶液采用如上方法收集电位信号，并代入标准曲线中，得出smz溶液的浓度。
34.为了验证所收集信号的准确性，同时经过电化学工作站两电极系统，进行电化学分析。
35.步骤(1)中，smz浓度为0.001～100100ng/ml，具体为0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50和100ng/ml，滴加量为10～30μl；
36.步骤(2)中，pbs量为20～30ml；氙灯光源的强度为25％～100％。
37.本发明的有益效果为：
38.本发明制备b-tio2纳米颗粒作为光阳极活性材料，cu2o/3dngh作为光阴极活性材料，成功建立了光助双极自供能适配体传感器，实现对smz的分析检测，其特色和优点表述如下：
39.(1)本发明制备b-tio2纳米颗粒作为光阳极活性材料,cu2o/3dngh作为光阴极活性材料来构建光助双极自供能适配体传感器，双光电极间能级匹配良好，电能输出性能优异。
40.(2)本发明制备cu2o/3dngh作为光阴极活性材料，替代了昂贵的铂电极，引入双光敏电极，降低了成本，显著提高太阳能的利用率。
41.(3)本发明所提出的光助双极自供能适配体传感器实现了对smz的灵敏检测，在0.001～100ng/ml的浓度区间内，smz浓度的对数值(lg c
smz
)与自供能传感平台的电位输出(ocp)值呈现良好的线性关系，检出限可达0.33pg/ml。
42.(4)本发明构建的新型光助双极自供能适配体传感器不需要外加电源，同时采用万用表作为直接读出策略，替代电化学工作站采集数据，便于携带，可以在室外操作，从而达到即时检测的效果。
附图说明
43.图1为构建的光助双极自供能适配体传感器的机理图；
44.图2为制备的b-tio2和cu2o/3dngh的透射电镜图；
45.图3(a)为实施例1的步骤(3)中由b-tio2/ito光阳极和不同的光阴极组成的自供能平台的电压—电流曲线(v-i)关系图，(b)功率密度—电流曲线(p-i)关系图，(c)万用表读出电压的数字照片和(d)开路电位值；其中，pt(a)、3dngh/ito(b)、cu2o/ito(c)、cu2o/3dngh/ito(d)；。
46.图4(a)、(b)为不同smz浓度下自供能传感平台的万用表读出电压的数字照片和开路电位值；(c)为smz浓度与自供能传感平台的输出电位的关系图(内嵌图为其线性关系图)；(d)、(e)为传感器的选择性和稳定性测试图。
具体实施方式
47.以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
48.图1为构建的光助双极自供能适配体传感器的机理图。
49.实施例1：
50.(1)b-tio2的制备
51.量取1.7ml钛酸四丁酯与2.5ml乙醇混合，搅拌均匀，得到溶液a；量取0.1ml浓硝酸、2.5ml乙醇和0.5ml水混合，搅拌均匀，得到溶液b；将溶液a逐滴滴加到溶液b中，搅拌0.5h，得到混合液c，转移至不锈钢高压釜中，180℃下反应12h，得到固体产物二氧化钛；称取200mg二氧化钛与66.66mg硼氢化钠混合，在研钵中研磨充分，转移至瓷坩埚中，放入管式炉，在氩气气氛中350℃煅烧1h，升温速率为10℃/min，得到b-tio2纳米颗粒。
52.(2)cu2o/3dngh的制备
53.首先，将50ml氧化石墨烯分散液(1g/ml)与2g尿素搅拌，转移至高压釜中，180℃下反应12h，得到3dngh。然后，将0.25g硝酸铜溶于50ml水，在磁力搅拌下滴入4ml水合肼溶液(0.5mol/l)，充分反应后离心洗涤，真空干燥，得到cu2o粉末。接着，称取0.1g cu2o与10ml异丙醇、0.1ml 3-氨丙基三甲基硅烷混合，充分搅拌24h，离心洗涤，得到带正电荷的表面功能化cu2o。最后，称取50mg带正电荷的表面功能化cu2o与10ml 3dngh水溶液(1g/ml)充分搅拌4h，从而得到cu2o/3dngh。
54.图2是实施例1获得的b-tio2和cu2o/3dngh的透射电镜图，可看到所制备的b-tio2为均匀分布的5-10nm的纳米颗粒；对于cu2o/3dngh复合材料，褶皱结构的3dngh包覆着直径约为500nm的cu2o球。
55.(3)修饰电极的制造
56.在制备光阳极和光阴极之前，先对ito进行预处理。将ito电极置于1m氢氧化钠溶液中煮沸30分钟，再依次用丙酮、蒸馏水和乙醇超声清洗，氮气吹干备用。将洗净的ito电极采用聚酰亚胺胶带(“金手指”)封装，最终使ito暴露的几何面积为0.09πcm2。称取2mg b-tio2和cu2o/3dngh分别分散于1ml dmf中，得到b-tio2、cu2o/3dngh分散液，移取20μl b-tio2、cu2o/3dngh分散液分别均匀滴涂于ito电极上，置于红外灯下烘干，得到光阳极b-tio2/ito和光阴极cu2o/3dngh/ito。
57.将光阳极、不同的光阴极pt(a)、3dngh/ito(b)、cu2o/ito(c)、cu2o/3dngh/ito(d)
放入含有的磷酸缓冲液(pbs)的单室电解池中，垂直于两个光电极的氙灯同时照射光阳极和光阴极，用万用表连接两极，直接收集电位信号。其中，pbs浓度为0.1mol/l,ph＝5。
58.为了验证所收集信号的准确性，同时经过电化学工作站两电极系统，进行电化学分析。
59.图3为由b-tio2/ito光阳极和不同的光阴极(pt(a)、3dngh/ito(b)、cu2o/ito(c)、cu2o/3dngh/ito(d))组成的自供能平台的(a)电压—电流曲线(v-i)关系图，(b)功率密度—电流曲线(p-i)关系图，(c)万用表读出电压的数字照片和(d)开路电位值。由图3可以看出，由光阳极b-tio2/ito和光阴极cu2o/3dngh/ito构成的自供能平台具有最好的电输出性能；同时，万用表直接读出的自供能平台的输出电位值与电化学工作站测得的电位值相一致,证明了万用表读出数据的准确性。
60.(4)光助双极自供能适配体传感器件的构建
61.首先，在光阳极b-tio2/ito上滴涂10μl 0.1％的chit溶液，置于红外灯下烘干。接着，将20μl 2.5％的ga溶液滴于电极表面，并置于室温下反应1h，反应完毕后，用pbs(ph＝5.0，0.1mol/l)淋洗2次，除去电极表面多余的ga。用tris-hcl(ph＝7.4，0.05mol/l)配制浓度为3μm的smz适配体溶液，smz适配体序列为：5
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。将20μl smz适配体滴加在电极上，置于4℃冰箱中反应12h，用pbs淋洗2次以除去过量的未吸附的适配体，然后滴加20μl 3％的bsa溶液以封闭非特异性活性位点，最终得到适配体修饰的光阳极(aptamer/b-tio2/ito),与光阴极cu2o/3dngh/ito构成光助双极自供能适配体传感器件。
62.光助双极自供能适配体传感器件检测smz
63.此后，将20μl浓度为0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50和100ng/ml的smz分别滴到光阳极aptamer/b-tio2/ito电极上，并在室温下孵育一段时间。最后，将光阳极aptamer/b-tio2/ito、光阴极cu2o/3dngh/ito放入含有20ml的pbs(ph＝5.0，0.1mol/l)的单室电解池中，经过电化学工作站两电极系统，在氙灯光源(强度为25％～100％)同时垂直照射两个光电极下进行电化学分析。
64.检测结果如图4：
65.图4(a)、(b)为不同smz浓度下自供能传感平台的万用表读出电压的数字照片和开路电位值，从图中可以看出，随着smz浓度的增加，万用表读出的自供能传感平台的输出电位逐渐增加；(c)为smz浓度与自供能传感平台的输出电位的关系图(内嵌图为其线性关系图)，在0.001～100ng/ml的浓度区间内，电位值与smz浓度之间呈现良好的线性关系，检出限可达0.33pg/ml；
66.实施例2：
67.(1)b-tio2纳米颗粒的制备
68.量取1ml钛酸四丁酯与1.5ml乙醇混合，搅拌均匀，得到溶液a；量取0.05ml浓硝酸、1.25ml乙醇和0.25ml水混合，搅拌均匀，得到溶液b；将溶液a逐滴滴加到溶液b中，搅拌0.5h，得到混合液c，转移至不锈钢高压釜中，180℃下反应10h，得到固体产物二氧化钛；称取100mg二氧化钛与33.33mg硼氢化钠混合，在研钵中研磨充分，转移至瓷坩埚中，放入管式炉，在氩气气氛中300℃煅烧1h，升温速率为10℃/min，得到b-tio2纳米颗粒。
69.(2)cu2o/3dngh的制备
70.首先，将50ml氧化石墨烯分散液(1g/ml)与2g尿素搅拌，转移至高压釜中，180℃下反应12h，得到3dngh。然后，将0.25g硝酸铜溶于50ml水，在磁力搅拌下滴入4ml水合肼溶液(0.5mol/l)，充分反应后离心洗涤，真空干燥，得到cu2o粉末。接着，称取0.1g cu2o与10ml异丙醇、0.1ml 3-氨丙基三甲基硅烷混合，充分搅拌12h，离心洗涤，得到带正电荷的表面功能化cu2o。最后，称取25mg带正电荷的表面功能化cu2o与5ml 3dngh水溶液(1g/ml)充分搅拌2h，从而得到cu2o/3dngh。
71.步骤(3)和(4)同实施例1的步骤(3)和(4)。
72.实施例3：
73.(1)b-tio2纳米颗粒的制备
74.量取3ml钛酸四丁酯与4ml乙醇混合，搅拌均匀，得到溶液a；量取0.15ml浓硝酸、3.75ml乙醇和0.75ml水混合，搅拌均匀，得到溶液b；将溶液a逐滴滴加到溶液b中，搅拌0.5h，得到混合液c，转移至不锈钢高压釜中，180℃下反应14h，得到固体产物二氧化钛；称取300mg二氧化钛与100mg硼氢化钠混合，在研钵中研磨充分，转移至瓷坩埚中，放入管式炉，在氩气气氛中400℃煅烧1h，升温速率为10℃/min，得到b-tio2纳米颗粒。
75.(2)cu2o/3dngh的制备
76.首先，将50ml氧化石墨烯分散液(1g/ml)与2g尿素搅拌，转移至高压釜中，180℃下反应12h，得到3dngh。然后，将0.25g硝酸铜溶于50ml水，在磁力搅拌下滴入4ml水合肼溶液(0.5mol/l)，充分反应后离心洗涤，真空干燥，得到cu2o粉末。接着，称取0.1g cu2o与10ml异丙醇、0.1ml 3-氨丙基三甲基硅烷混合，充分搅拌36h，离心洗涤，得到带正电荷的表面功能化cu2o。最后，称取75mg带正电荷的表面功能化cu2o与15ml 3dngh水溶液(1g/ml)充分搅拌6h，从而得到cu2o/3dngh。
77.步骤(3)和(4)同实施例1的步骤(3)和(4)。