一种测定独活香豆素类成分含量的方法与流程

本发明涉及中药成分测定技术领域，特别是涉及一种测定独活香豆素类成分含量的方法。

背景技术：

独活(angelicaepubescentisradix)是重齿毛当归的干燥根。独活是最常用的中药之一。独活原载于“神农本草经”，为上品，具有祛风湿、解表、止痛等功效，常用于治疗风湿、腰膝痛、寒性头痛。羌活胜湿汤和独活寄生汤均以独活为君药，具有止风镇痛作用。其质量对临床用药的有效性和安全性有很大影响。

独活化学成分主要为挥发油和香豆素类化合物，其中香豆素类化合物是指含有二苯甲酮α-吡喃酮的基本结构的化合物。香豆素类化合物种类繁多，可分为简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和双香豆素。药物化学研究表明，独活的香豆素类成分主要为二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、伞形花内酯、二氢欧山芹醇、佛手柑内酯、当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯、异欧前胡素、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯，具有镇痛、抗炎、抑制血小板聚集、抗血栓作用。因此，香豆素类成分的含量测定对独活药材的质量控制具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种测定独活中香豆素类成分含量的方法，用以实现独活药材中二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯6种香豆素类成分的快速提取和检测，可用于独活药材的质量控制。具体技术方案如下：

本申请提供了一种测定独活中香豆素类成分含量的方法，采用离子液体-微波辅助萃取结合高效液相色谱-荧光检测法，同时测定独活中6种香豆素类成分的含量；所述6种香豆素类成分包括二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯，所述方法包括：

(1)建立6种香豆素类成分的标准曲线；

以甲醇为溶剂，配制5-10个含有不同已知浓度的6种香豆素类成分的混合对照品溶液；其中，二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、二氢欧山芹醇当归酸酯浓度分别为0.005-8μg/ml，当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯浓度分别为0.02-30μg/ml，蛇床子素浓度为0.3-30μg/ml；

在相同的色谱条件和荧光检测条件下，将体积v1的各混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，通过荧光检测确定各色谱峰的香豆素类成分，并获得各香豆素类成分的色谱峰面积；

其中，所述色谱条件包括：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：a相为甲醇，b相为水；采用体积分数40-85％a相，15-60％b相，梯度洗脱；流速：0.2-0.5ml/分钟；柱温：25-35℃；进样量v1:1-5μl；

以各香豆素类成分色谱峰的峰面积为纵坐标，以各香豆素类成分的浓度为横坐标，分别建立各香豆素类成分的标准曲线；

(2)获得待测样品溶液的色谱峰面积；

将质量为m的待测样品，以体积为v2、浓度为30-200毫摩尔每升的离子液体水溶液进行微波提取，过滤后作为待测样品溶液，其中，m/v2为(3-30)：1mg/ml，微波提取功率为50-600w，微波提取时间为1-7分钟；

在与步骤(1)中相同的色谱条件和荧光检测条件下，取体积v1的待测样品溶液注入高效液相色谱仪中，通过荧光检测确定各色谱峰的香豆素类成分，并获得各香豆素类成分的色谱峰面积；

(3)确定待测样品中6种香豆素类成分的含量；

根据已建立的各香豆素类成分的标准曲线，由待测样品溶液中各香豆素类成分的色谱峰面积，分别获得各香豆素类成分的浓度c1，并按照下列公式分别计算出待测样品中6种香豆素类成分的含量c；

c＝c1×v2/m。

在本申请的一些实施方式中，在步骤(2)中，将质量为m的待测样品，以体积为v2、浓度为50-150毫摩尔每升的离子液体水溶液进行微波提取，过滤后作为待测样品溶液，其中，m/v2为(5-20)：1mg/ml，微波提取功率为100-500w，微波提取时间为2-6分钟。

在本申请的一些实施方式中，在步骤(2)中，将质量为m的待测样品，以体积为v2、浓度为70-130毫摩尔每升的离子液体水溶液进行微波提取，过滤后作为待测样品溶液，其中，m/v2为(5-15)：1mg/ml，微波提取功率为200-400w，微波提取时间为2-5分钟。

在本申请的一些实施方式中，所述离子液体选自1-十二烷基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸盐、1-十二烷基-3-甲基-1h-咪唑氢硫酸盐、溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑和溴化-1-乙基-3-甲基咪唑中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述混合对照品溶液中，二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、二氢欧山芹醇当归酸酯浓度分别为0.02-5μg/ml，当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯浓度分别为0.1-25μg/ml，蛇床子素浓度为0.5-25μg/ml。

在本申请的一些实施方式中，在步骤(1)中，以甲醇为溶剂，配制含有6种香豆素类成分的混合对照品储备液，其中，二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、二氢欧山芹醇当归酸酯浓度分别为5-8μg/ml，当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯浓度分别为25-30μg/ml，蛇床子素浓度为25-30μg/ml；

以甲醇稀释所述混合对照品储备液，获得所述5-10个含有不同已知浓度的6种香豆素类成分的混合对照品溶液。

在本申请的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-5分钟，40％-40％a；5-10分钟，40％-45％a；10-15分钟，45％-45％a；15-25分钟，45％-52％a；25-35分钟，52％-52％a；35-37分钟，52％-75％a；37-42分钟，75％-80％a；42-45分钟，80％-85％a；45-50分钟，85％-85％a；50-52分钟，85％-40％a；52-57分钟，40％-40％a。

在本申请的一些实施方式中，所述荧光检测条件，包括：325nm的激发波长，400nm的发射波长。

本发明提供的测定独活中香豆素类成分含量的方法，采用离子液体-微波辅助萃取结合高效液相色谱-荧光检测，其中，离子液体-微波辅助萃取能够从干燥独活粉末中快速提取香豆素类成分，通过合理选择色谱条件和荧光检测条件，可以同时测定独活中6种香豆素类成分的含量，所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快等优势，从而可用于独活药材的质量控制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施例。

图1为独活经荧光检测的高效液相色谱图；其中a图为空白溶剂的高效液相色谱图；b图为混合对照品溶液的高效液相色谱图；c图为待测样品溶液的高效液相色谱图；其中，各数字标号分别代表：1.二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷；2.二氢欧山芹醇；3.当归醇a；4.二氢欧山芹醇乙酸酯；5.蛇床子素；6.二氢欧山芹醇当归酸酯。

图2为提取的总香豆素含量与单因素试验关系图；其中的单因素，a图为离子液体种类；b图为离子液体水溶液浓度，其中，离子液体为溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑；c图为药材量；d图为微波提取功率；e图为微波提取时间。

图3为单独变量对总香豆素含量影响的响应面图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

仪器

高效液相色谱仪：hplc1200(安捷伦科技，美国)；十万分之一电子天平：ax205(mettlertoledo，瑞士)；超纯水器：mill-qii型(millipore，美国)；微波提取仪：antonpaarmicrowavereactionsystemsolv(graz，austria)；粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

试剂

甲醇：色谱纯，fisher公司；超纯水：mill-qⅱ型，millipore公司；

离子液体：1-辛基-3-甲基咪唑四氯化铁([c8mim]fecl4)、1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁([c2mim]fecl3)、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([c6mim]bf4)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([c4mim]pf6)、1-十二烷基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸盐([c12mim]cf3so3h)、1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐([c12mim]hso4)、溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑([c12mim]br)、溴化-1-乙基-3-甲基咪唑([c2mim]br)，购自上海成杰化工有限公司(中国上海)；离子液体溶解于水中配制成相应浓度的离子液体水溶液。

材料

十二批次的独活药材购自四川、湖北、甘肃中药材市场，干燥的生药被粉碎机粉碎，并通过50目筛网，得到干燥独活粉末作为待测样品。标准品二氢欧山芹醇乙酸酯、二氢欧山芹醇当归酸酯和蛇床子素，购自于成都德斯特生物科技有限公司，标准品二氢欧山芹醇、当归醇a和二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷，实验室分离得到，经高效液相色谱测定，纯度均大于98％。各标准品结构式如下所示：

色谱条件

色谱柱：agilenteclipseplusc18(4.6×100mm,1.8μm)；流动相：a相为甲醇，b相为超纯水；梯度洗脱，洗脱程序为：0-5分钟，40％-40％a；5-10分钟，40％-45％a；10-15分钟，45％-45％a；15-25分钟，45％-52％a；25-35分钟，52％-52％a；35-37分钟，52％-75％a；37-42分钟，75％-80％a；42-45分钟，80％-85％a；45-50分钟，85％-85％a；50-52分钟，85％-40％a；52-57分钟，40％-40％a；柱温：30℃；流速：0.3ml/min；进样体积：2μl；

荧光检测条件

激发波长：325nm；发射波长：400nm。

实施例1标准曲线建立

1、混合对照品储备液的配制

精密称取二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯，分别用甲醇溶解，配制各对照品储备溶液，浓度均为1mg/ml。分别精密量取各对照品储备溶液，配制成含二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷5μg/ml、二氢欧山芹醇5μg/ml、当归醇a25μg/ml、二氢欧山芹醇乙酸酯25μg/ml、蛇床子素25μg/ml和二氢欧山芹醇当归酸酯5μg/ml的混合对照品储备液，置于4℃冰箱备用。

2、建立标准曲线

精确量取上述步骤1的混合对照品储备液，以甲醇为溶剂，依次稀释得到不同浓度的混合对照品溶液，见表1，取各个浓度上述混合对照品溶液，进样2μl分析，得到各对照品在不同浓度下的液相色谱图，其中，浓度4的混合对照品溶液的液相色谱图如图1中b图所示。以待测物峰面积(y)为纵坐标，待测物的浓度(x)为横坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，权重系数为1/x，求得各化合物的回归方程及相关系数，以s/n(信噪比)为10时各对照品的浓度作为定量限(loq)，以s/n为3时各对照品的浓度作为检测限(lod)，结果见表2。

表1混合对照品溶液

表2标准曲线、线性范围、lod和loq

实施例2独活提取条件确定

1、单因素试验

通过单因素试验研究离子液体种类(8种)、离子液体水溶液浓度(50、75、100、125、150mm)、药材量(50、100、150、200、250mg)、微波提取功率(100、200、300、400、500w)、微波提取时间(2、3、4、5、6min)，分别对独活香豆素类成分提取的影响。

1.1离子液体种类对提取结果的影响

选择8种不同种类的离子液体，1是1-辛基-3-甲基咪唑四氯化铁，2是1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁，3是1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，4是1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，5是溴化-1-乙基-3-甲基咪唑，6是溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑，7是1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐，8是1-十二烷基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸盐，分别溶于水，配制成浓度均为100毫摩尔每升(mm)的不同种类的离子液体水溶液。

精密称取100mg干燥独活粉末，称取8份，分别加入10ml浓度为100mm的不同种类的离子液体水溶液，进行微波提取，微波提取功率为300w，微波提取时间为4分钟，得到的提取溶液用0.22μm滤膜过滤，按上述色谱条件进样，测得峰面积并根据实施例1的标准曲线计算6种香豆素类成分的含量。

结果见图2的a图，其中，横坐标为离子液体种类；纵坐标为总香豆素含量，以6种香豆素类成分含量的总和计算(下同)。由图2的a图可知，离子液体种类为溴化-1-乙基-3-甲基咪唑、溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酸盐中任一种时，提取出的总香豆素含量较高，总香豆素的提取率较高。

1.2离子液体水溶液浓度对提取结果的影响

将溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑溶于水，配制成浓度分别为50、75、100、125、150mm的溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液。

精密称取100mg干燥独活粉末，称取5份，分别加入10ml上述不同浓度的溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液，进行微波提取，微波提取功率为300w，微波提取时间为4分钟，得到的提取溶液用0.22μm滤膜过滤，按上述色谱条件进样，测得峰面积并根据实施例1的标准曲线计算6种香豆素类成分的含量。

结果见图2的b图，其中，横坐标为溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液的浓度，纵坐标为总香豆素含量。由图2的b图可知，溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液浓度从50mm到100mm，提取的总香豆素含量增加，从100mm到150mm，提取的总香豆素含量基本不变。综合考虑提取效率和测试成本，本申请采用的离子液体水溶液浓度为30-200mm，优选为50-150mm，更优选为70-130mm。

1.3待测样品质量与离子液体水溶液体积比对提取结果的影响

分别称取50、100、150、200、250mg干燥独活粉末，加入10ml浓度为100mm的溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液，进行微波提取，微波提取功率为300w，微波提取时间为4分钟，得到的提取溶液用0.22μm滤膜过滤，按上述色谱条件进样，测得峰面积并根据实施例1的标准曲线计算6种香豆素类成分的含量。

结果见图2的c图，横坐标为药材量，纵坐标为总香豆素含量。由图2的c图可知，药材量为50-250mg时，即m/v2为(5-25)：1mg/ml时，提取的总香豆素含量均较高，总香豆素的提取率较高。因此，本申请中采用的m/v2为(3-30)：1mg/ml，优选为m/v2为(5-20)：1mg/ml，更优选为m/v2为(5-15)：1mg/ml。

1.4微波提取功率对提取结果的影响

精密称取100mg干燥独活粉末，称取5份，分别加入10ml浓度为100mm的溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液，进行微波提取，微波提取功率分别为100、200、300、400、500w，微波提取时间为4分钟，得到的提取溶液用0.22μm滤膜过滤，按上述色谱条件进样，测得峰面积并根据实施例1的标准曲线计算6种香豆素类成分的含量。

结果见图2的d图，横坐标为微波提取功率，纵坐标为总香豆素含量。由图2的d图可知，微波提取功率为100-500w时，提取的总香豆素含量均较高，总香豆素的提取率较高，因此本申请的微波提取功率选择50-600w，优选为100-500w，更优选为200-400w。

1.5微波提取时间对提取结果的影响

精密称取100mg干燥独活粉末，称取5份，分别加入10ml浓度为100mm的溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液，进行微波提取，微波提取功率为300w，微波提取时间分别为2、3、4、5、6分钟，得到的提取溶液用0.22μm滤膜过滤，按上述色谱条件进样，测得峰面积并根据实施例1的标准曲线计算6种香豆素类成分的含量。

结果见图2的e图，横坐标为微波提取时间，纵坐标为总香豆素含量。由图2的e图可知，微波提取时间为2-6分钟时，提取的总香豆素含量均较高，总香豆素的提取率较高，因此本申请的微波提取时间选择1-7分钟，优选为2-6分钟，更优选为2-5分钟。

2、响应面试验

根据以上单因素试验结果，采用三因素三水平boxbehnken设计(bbd)和响应面法(rsm)，确定方法参数对微波提取香豆素类成分的影响。自变量的bbd及其水平如表3所示。完整设计包括12个处理，中心点5个重复，如表4所示。总香豆素含量用6种香豆素类成分含量的总和表示。用二次多项式数学模型表示总香豆素值。数学模型如方程(1)所示。

y＝α0+α1x1+α2x2+α3x3+α4x12+α5x13+α6x23+α7x1²+α8x2²+α9x3²(1)

其中，x1、x2和x3分别表示药材量、微波提取功率和微波提取时间。α0是模型的截距。αn值代表相应的回归系数。

表3bbd中独立变量和水平

表4bbd的实验设计

响应面二次模型的方差分析如表5所示，试验中总香豆素的模型f值(588.28)和相关的下限p值为p<0.0001，这一结果证实了所建立的模型是有意义的，当p值<0.05时，模型项可以认为是有意义的。根据上述原则，模型b、c、bc、a²、b²和c²被认为是有意义的。从f值可以看出，影响香豆素类成分提取的因素大小顺序为：微波提取时间>微波提取功率>药材量。f值和p值的拟合缺失分别为4.45和0.0916，进一步证明该模型公式能较好地预测总香豆素的含量，建立的二阶模型如下：

y＝11.49+0.005x1+0.064x2+0.14x3-0.0025x12-0.0075x13-0.06x23-0.9x1²-0.66x2²-0.25x3²(8)

表5响应面二次模型的方差分析

^*方差来源p值<0.05；r²＝0.9987；r²adj＝0.9970

单独变量对总香豆素含量影响的响应图如图3所示，通过响应面软件最优化分析，预测最佳提取条件为微波提取功率303.56w，微波提取时间3.29min，药材量100.08mg。依实验的实际操作条件，将最佳提取条件调整为微波提取功率为300w，微波提取时间为3.3min，药材量为100mg。以10ml浓度为100mm的溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液为提取溶剂，在此条件下制备待测样品溶液，按上述色谱条件进样分析，得到提取的总香豆素含量为11.47mg/g，实验结果与预测值(11.514)非常接近，表明该最佳提取条件可靠。

3、待测样品溶液的制备

根据以上响应面试验确定的提取条件制备待测样品溶液，具体为：

精密称取100mg干燥独活粉末，加入10ml浓度为100毫摩尔每升(mm)的溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑([c12mim]br)，进行微波提取，微波提取功率为300w，微波提取时间为3.3分钟，得到的提取溶液用0.22μm滤膜过滤，即得待测样品溶液。

实施例3独活中香豆素类成分含量测定

取12批次独活药材粉末，每种3份，每份称取100mg，依照实施例2的待测样品溶液的制备方法得到待测样品溶液，依照上述色谱条件和荧光检测条件测定，获得独活样品中各香豆素类成分的高效液相色谱图，其中，批次为四川-1的待测样品溶液的高效液相色谱图如图1的c图所示，图1的a图为未加入待测样品的空白溶剂的高效液相色谱图。依照表2中各香豆素类成分的标准曲线，分别确定独活样品中各香豆素类成分的峰面积对应的浓度c1，并按照下列公式分别计算出待测样品中6种香豆素类成分含量；以6种香豆素类成分含量的总和计算总香豆素含量；结果记录于表6-1和表6-2。

各香豆素类成分含量

表6-1十二批次的独活香豆素类成分定量分析结果(n＝3)

注释：*按照《2015版中国药典》的独活提取方法提取

表6-2十二批次的独活香豆素类成分定量分析结果(n＝3)

注释：*按照《2015版中国药典》的独活提取方法提取

2015版中国药典中，待测样品溶液的提取方法为超声提取30分钟，与中国药典超声提取法相比，本申请离子液体结合微波辅助提取方法的提取时间(3.3分钟)有明显的缩短；采用本申请的提取方法提取得到的独活总香豆素的含量11.50mg/g(6种香豆素类成分含量的总和)，也优于经中国药典2015版的提取方法提取到的总香豆素含量11.18mg/g；表明本申请离子液体结合微波辅助提取独活香豆素类成分的提取方法具有简便快捷的优势。

实施例4精密度试验

制备低中高三个浓度的混合对照品溶液，按上述的色谱条件连续进样6次，计算日内精密度的相对标准偏差(rsd)；取3个浓度连续进样3天，每次6针，计算日间精密度rsd值。精密度结果见表7，二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的日内和日间精密度的相对标准偏差范围为0.26％～4.76％和0.55％～4.89％，准确度为96.76％～103.83％和96.66％～104.08％。这些试验结果表明所建立的方法精密度良好(rsd<5％)。

表7日内和日间精密度(n＝6)

实施例5重复性和稳定性试验

取同一批次独活样品，按实施例2待测样品溶液的制备方法，平行制备6份待测样品溶液，连续进样分析。结果如表8所示，6个成分含量的rsd值均小于5％，表明该方法重复性良好。

取同一待测样品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样分析，考察样品稳定性。结果如表8所示，6个成分含量的rsd值均小于5％，表明样品稳定性较好。

表8重复性和稳定性

实施例6加样回收率试验

精密称取同一批次独活样品50mg，精密加入一定量的混合对照品溶液，按实施例2待测样品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件进样测得峰面积，计算每个成分的含量，每份样品平行6次。同时，将未加标的50mg样品平行操作，测得峰面积并计算含量。以(测得量-原有量)/加标量×100％计算回收率，结果见表9，6种香豆素的平均回收率在96.80％-103.50％之间，相对标准偏差均小于5％，表明该方法准确可靠。

表9加样回收率(n＝6)

文献1(王计瑞,谭均,李隆云,等.独活的hplc指纹图谱及4个香豆素类成分的测定.药物分析杂志,2018,38(06):955-963.)公开了超声提取独活待测样品溶液，超声提取时间为20分钟，提取溶剂为甲醇；采用高效液相色谱-二极管阵列检测方法(hplc-dad)测定香豆素类成分含量，检测时间为100分钟；其中，二氢欧山芹醇的定量限为0.115μg/ml，检测限为0.028μg/ml；蛇床子素的定量限为0.148μg/ml，检测限为0.044μg/ml；二氢欧山芹醇当归酸酯的定量限为0.264μg/ml，检测限为0.069μg/ml。

文献2(王斌,周安,杨沫,等.独活药材香豆素类成分的高效液相色谱指纹图谱研究.安徽中医药大学学报,2019,38(01):87-92.)公开了超声提取独活待测样品溶液，超声提取时间为30分钟，提取溶剂为甲醇与二氯甲烷混合溶液；采用高效液相色谱-二极管阵列检测方法(hplc-dad)测定香豆素类成分含量，检测时间为70分钟。

文献3(贾萌,赵华聪,蔡淑慧,等.hplc指纹图谱及多成分定量的独活饮片质量评价研究.南京中医药大学学报,2020,36(01):88-93.)公开了超声提取独活待测样品溶液，超声提取时间为30分钟，提取溶剂为70％甲醇；采用高效液相色谱-二极管阵列检测方法(hplc-pda)测定香豆素类成分含量，检测时间为95分钟。

将本申请与文献1-3的提取方法和检测方法进行比较，见表10。由表10可知，本申请采用的提取溶剂为离子液体，而文献1-3均为有机溶剂，本申请采用离子液体较有机溶剂环保。本申请采用微波提取香豆素类成分的方法，提取时间仅3.3分钟，文献1-3的提取时间为20-30分钟，本申请的提取方法使待测样品溶液的制备变得快速、简便和高效。文献1-3的检测时间为70-100分钟，而本申请的检测时间仅为57分钟，本申请明显缩短了检测时间，使独活样品检测变得快速和高效。本申请检测的二氢欧山芹醇、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯的定量限和检测限分别为0.01μg/ml、0.003μg/ml，0.4μg/ml、0.13μg/ml，0.01μg/ml、0.003μg/ml；与文献1相比，本申请检测方法(hplc-fld)灵敏度明显较高。因此，本申请方法具有简便、高效、环保、灵敏度高、分析速度快等优势。

表10本申请与文献1-3的方法比较

本申请采用离子液体-微波辅助萃取结合高效液相色谱-荧光检测法，同时测定独活中二氢欧山芹醇-β-d-葡萄糖苷、二氢欧山芹醇、当归醇a、二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯6种香豆素类成分的含量，实现独活中香豆素类成分的快速提取和检测，具有简便、灵敏度高、分析速度快等优势。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。