一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法与流程

[0001]
本发明属于代谢组学技术领域，涉及一种杨树高温胁迫的代谢组学分析方法，具体涉及一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法。


背景技术：

[0002]
气候变化增加了全球极端高温出现的频率。高温胁迫是主要的环境胁迫之一，限制了植物的生长、代谢以及产量。植物作为固着生物，已经进化出复杂多样的系统响应高温，例如，植物利用抗氧化物酶清除由氧化胁迫所产生的过多活性氧(ros)、通过积累一些渗透调剂物质(脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖等)减轻渗透胁迫伤害。有关树木对高温胁迫响应的研究主要集中在种群、个体、器官以及细胞的水平上，而分子水平上的研究较少。利用代谢组学研究可以直接测定高温胁迫下代谢物的变化情况。在拟南芥、番茄、玉米和小麦等植物中已经展开了高温胁迫代谢组方面的研究，并鉴定出一些响应热胁迫得到代谢产物。例如：一些可溶性糖(蔗糖、葡萄糖、甜菜苷、棉子糖)和一些有机酸(柠檬酸、富马酸、苹果酸、阿魏酸)。此外，毛白杨在我国分布较为广泛，因其树干高大通直，树叶青翠欲滴，树姿优美、俊秀挺拔，常用于城乡行道树和庭荫树，是重要的绿化和观赏树种。特别是毛白杨适应性强，在夏季城市热岛效应下依然能够正常生长，显示其有很强的抗高温。因此，了解杨树的抗高温机理具有现实意义和应用价值。
[0003]
我们在期间研究中，对杨树设计温度处理：对照组和高温组。通过gc-ms测定了高温与对照叶片中的差异代谢物。本发明目的是筛选杨树响应高温的小分子代谢物，探明杨树高温胁迫下的代谢变化规律，阐释杨树对高温胁迫响应的代谢组学水平上的调控机制，为树木高温胁迫研究提供重要的参考依据，也为木本观赏植物抗高温研究提供有价值的参考。


技术实现要素：

[0004]
本发明目的在于提供一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法，通过该方法可以探明杨树响应高温的代谢相关变化规律，为阐明植物高温胁迫代谢物通路的变化情况提供有力的分析方法。
[0005]
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]
一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法，该方法包括以下步骤：
[0007]
(1)样品制备：在不同温度条件下处理杨树，获得高温组和对照组杨树叶片样本，对所述的高温组和对照组杨树叶片样本进行代谢物制备分别获得高温组和对照组代谢物；
[0008]
(2)基于gc/tof-ms对高温组和对照组代谢物进行检测：将步骤(1)获得的高温组和对照组代谢物分别经过衍生化处理后进行gc/tof-ms检测分析获得高温组和对照组代谢物检测数据；
[0009]
(3)数据分析：对获得的高温组和对照组代谢物检测数据依次进行预处理分析、主成分及相关性分析、正交偏最小二乘法判别分析和组间差异分析获得高温组和对照组两组
之间的差异代谢物即为响应杨树高温胁迫的关键代谢物，并进行代谢通路分析。
[0010]
作为一种优选技术方案，步骤(1)中处理所述高温组和对照组杨树的温度条件分别为：对照组(control,ctrl组)：25℃处理6小时；高温组(heat,h组)：先梯度升温，半小时内25℃升至35℃时，停留2小时后，再从35℃升至45℃，并维持45℃处理5小时；取顶芽下第3至第4个叶片，采样时间点：45℃5h。
[0011]
作为一种优选技术方案，步骤(1)中代谢物制备的过程为：取叶片组织样品加入ep管中，再加入提取溶剂和核糖醇溶液，所述的提取溶剂为按体积比计甲醇∶h2o＝3∶1的溶剂，所述核糖醇溶液的浓度为2mg/ml；用研磨仪处理萃取物4分钟后冰水浴5分钟，重复2次，冷冻离心15分钟(4℃,13000rpm)；取上清液转入gc/ms玻璃烧瓶中，在真空浓缩器中干燥提取物得到代谢物。
[0012]
作为一种优选技术方案，步骤(2)中对获得的高温组和对照组代谢物进行衍生化处理的过程为：向干燥后的代谢物中加入甲氧胺盐试剂，待缓慢混匀后，80℃孵育30分钟；随后，迅速加入bstfa，70℃孵育1.5h。
[0013]
作为一种优选技术方案，步骤(2)中采用配置db-5ms毛细管柱(5％二苯基，95％二甲基聚硅氧烷)的agilent 7890气相色谱-飞行时间联用仪进行gc/tof-ms检测分析，gc/tof-ms具体分析条件为：进样量：1μl，不分流模式；载气：氦气；前进样口吹扫流速：3ml
·
min-1
；柱流速：1ml
·
min-1
；柱温：50℃保持1分钟，以10℃每分钟的速率上升至310℃，保持8分钟；前进样口温度：280℃；传输线温度：270℃；离子源温度：220℃；电离电压：-70ev；扫描方式：50-500m/z；扫描速率：20spectra/sec；溶剂延迟：460s，采集模式为全扫描模式。
[0014]
作为一种优选技术方案，步骤(3)中对获得的高温组和对照组代谢物检测数据进行预处理分析是对数据进行过滤用于去除噪音数据获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。
[0015]
最优选的，采用agilent chemstation工作站采集总离子流图(tic)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，进行稳定性和重复性的考察。同时，为了能够对下游数据进行更好的分析，对数据进行过滤，目的是去除噪音数据获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。所用方法为：四分位数极差或四分位间距(interquartile range)、保留单组空值小于等于50％或所有组中空值小于等于50％的峰面积数据。对原始数据中的缺失值进行模拟，数值模拟方法为最小值二分之一法进行填补。对填补完以后的数据进行标准化处理，方法是内标归一法。
[0016]
步骤(3)中所述的主成分及相关性分析为：对所有样本预处理后的数据进行主成分分析，初步了解各组样本之间的总体差异和组内的变异度大小。
[0017]
步骤(3)中所述的正交偏最小二乘法判别分析的过程为：使用simca软件(v14.1,mks data analytics solutions,umea,sweden)对多维统计模型进行正交矫正偏最小二乘法判别分析(opls-da)，最大化地凸显模型内部与预测主成分(predictive component)相关的差异；opls-da首先进行log转换+uv格式化处理的数据标度换算方式，接着对第一，二主成分进行建模分析；模型的质量用7折交叉验证进行检验，并用交叉验证后得到的r2y(代表y变量的可解释性)和q2(代表模型的可预测性)对模型有效性进行评判；然后通过排列实验随机多次(n＝200)改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机q2值对模型有效性做进一步的检验；r2y(代表y变量的可解释性)，q2(代表模型的可预测性)越接近1说明opls-da
模型越能很好地解释两组样本之间的差异。
[0018]
这一过程需先建立多维统计模型，具体方法为：采用agilent chemstation工作站采集总离子流图(tic)，取原始数据信号后进行解卷积分析，定性代谢物并进行积分，最后在excel软件中进行后期整理，将结果组织为二位数据矩阵，包括观察量(样本)、其代谢物和代谢通路；将编辑后的数据矩阵导入simca(版本14.1)进行主成分分析(pca)、正交偏最小二乘法分析(opls)并且按照opls-da的vip值挖掘差异代谢物质。
[0019]
步骤(3)中所述的组间差异分析的过程为：通过分析比较两组样本间代谢物的定量数据，以vip>1且p-value<0.05为取阈值，获得差异性表达代谢物。
[0020]
步骤(3)中建立多维统计模型具体为：采用agilent chemstation工作站采集总离子流图(tic)，取原始数据信号后进行解卷积分析，定性代谢物并进行积分，最后在excel软件中进行后期整理，将结果组织为二位数据矩阵，包括观察量(样本)、其代谢物和代谢通路；将编辑后的数据矩阵导入simca(版本14.1)进行主成分分析(pca)、正交偏最小二乘法分析(opls)并且按照opls-da的vip值挖掘差异代谢物质。
[0021]
本发明公开一种筛选响应杨树高温胁迫下关键代谢物的方法，该方法通过gc/tof-ms技术检测杨树叶片高温胁迫下的代谢变化规律，筛选杨树响应高温的小分子代谢物与代谢通路，从而阐释杨树对高温胁迫响应的代谢组学水平上的调控机制。筛选到67个差异代谢物，高温胁迫下差异基因主要富集在缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成；半乳糖代谢；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢通路上。本发明也为树木高温胁迫研究提供重要的参考依据，为木本观赏植物抗高温研究提供有价值的参考。
[0022]
本发明的有益效果：
[0023]
通过本发明方法可以筛选杨树响应高温的小分子代谢物为杨树耐热分子育种奠定了良好基础，具有潜在的应用价值。
附图说明
[0024]
图1为本发明实施例1中实验材料与设计；其中，(a):杨树生长群体；(b):取样位置(箭头所指位置)；(c):实验设计示意图，ht：热处理；ctrl：对照组；上线表示热处理的时间。下方虚直线表示常温对照的时间。箭头表示采样时间点(qpcr:25℃2h,35℃2h,45℃2h,5h,12h；代谢组：45℃5h,25℃10h)。
[0025]
图2为本发明实施例4中叶片样品主成分分析(pca)得分图。
[0026]
图3为本发明实施例4中正交偏最小二乘法判别分析图，其中(a)：opls-da得分图；(b)：置换检验图；(c)：opls-da载荷图。
[0027]
图4为本发明实施例5中杨树叶片高温下代谢物富集代谢途径图。
具体实施方式
[0028]
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
[0029]
本发明采用优良品种84k杨为材料，通过代谢组学生物信息分析，筛选杨树响应高温的小分子代谢物，探明杨树高温胁迫下的代谢变化规律，阐释杨树对高温胁迫响应的代
谢组学水平上的调控机制。本发明筛选杨树响应高温的小分子代谢物为杨树耐热分子育种奠定了良好基础，具有潜在的应用价值。
[0030]
实施例1在温度环境下处理杨树，获得对照组和高温组杨树叶片样本
[0031]
对照组(control,ctrl组)：25℃处理6小时，高温组(heat,h组)：先梯度升温，半小时内25℃升至35℃时，停留2小时后，再从35℃升至45℃，并维持45℃处理5小时。取顶芽下第3至第4个叶片，采样时间点：45℃5h(如图1所示)。
[0032]
实施例2对高温组和对照组叶片样本进行代谢物制备
[0033]
取0.06g叶片组织样品加入2ml ep管中，再加入于0.48ml提取溶剂(甲醇∶h2o(v:v)＝3∶1)和24μl核糖醇溶液(2mg/ml)；用研磨仪处理萃取物4分钟，冰水浴5分钟(重复2次)，冷冻离心15分钟(4℃,13000rpm)；取0.35ml上清液转入2mlgc/ms玻璃烧瓶中。在真空浓缩器中干燥提取物；向干燥后的代谢物中加入80μl甲氧胺盐试剂(市售产品)，待缓慢混匀后，80℃孵育30分钟；随后，迅速加入100μl bstfa，70℃孵育1.5h。
[0034]
实施例3基于gc/tof-ms对高温组和对照组代谢物进行检测
[0035]
采用配置db-5ms毛细管柱(5％二苯基，95％二甲基聚硅氧烷)的agilent 7890气相色谱-飞行时间联用仪进行gc/tof-ms分析。gc/tof-ms具体检测分析条件为：进样量：1μl，不分流模式；载气：氦气；前进样口吹扫流速：3ml
·
min-1
；柱流速：1ml
·
min-1
；柱温：50℃保持1分钟，以10℃每分钟的速率上升至310℃，保持8分钟；前进样口温度：280℃；传输线温度：270℃；离子源温度：220℃；电离电压：-70ev；扫描方式：50-500m/z；扫描速率：20spectra/sec；溶剂延迟：460s，采集模式为全扫描模式。
[0036]
实施例4高温组和对照组叶片差异代谢组检测数据分析
[0037]
(1)叶片代谢数据预处理分析
[0038]
采用agilent chemstation工作站采集总离子流图(tic)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，进行稳定性和重复性的考察。同时，为了能够对下游数据进行更好的分析，对数据进行过滤，目的是去除噪音数据获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据。所用方法为：四分位数极差或四分位间距(interquartile range)、保留单组空值小于等于50％或所有组中空值小于等于50％的峰面积数据。对原始数据中的缺失值进行模拟，数值模拟方法为最小值二分之一法进行填补。对填补完以后的数据进行标准化处理，方法是内标归一法。
[0039]
(2)主成分及相关性分析
[0040]
对所有样本(包括质控样本)预处理后的数据进行主成分分析，以便初步了解各组样本之间的总体差异和组内的变异度大小。本实施例4中两组样本区分比较显著(如图2所示)。
[0041]
(3)正交偏最小二乘法判别分析
[0042]
使用simca软件(v14.1,mks data analytics solutions,umea,sweden)进行正交矫正偏最小二乘法判别分析(opls-da)，这一过程需先建立多维统计模型，具体方法为：采用agilent chemstation工作站采集总离子流图(tic)，取原始数据信号后进行解卷积分析，定性代谢物并进行积分，最后在excel软件中进行后期整理，将结果组织为二位数据矩阵，包括观察量(样本)、其代谢物和代谢通路；将编辑后的数据矩阵导入simca(版本14.1)进行主成分分析(pca)、正交偏最小二乘法分析(opls)并且按照opls-da的vip值挖掘差异
代谢物质。最大化地凸显模型内部与预测主成分(predictive component)相关的差异。opls-da首先进行log转换+uv格式化处理的数据标度换算方式，接着对第一，二主成分进行建模分析。模型的质量用7折交叉验证进行检验，并用交叉验证后得到的，r2y(代表y变量的可解释性)和q2(代表模型的可预测性)对模型有效性进行评判。在此之后，通过排列实验随机多次(n＝200)改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机q2值对模型有效性做进一步的检验。r2y(代表y变量的可解释性)，q2(代表模型的可预测性)越接近1说明opls-da模型越能很好地解释两组样本之间的差异。置换检验截距r2＝0.99，q2＝0.0318可以很好体现模型的稳健性。载荷图的左右两端物质为潜在的差异标志物(如图3所示)。
[0043]
(4)组间差异分析
[0044]
通过分析比较两组样本间代谢物的定量数据，以vip>1且p-value<0.05为取阈值，获得差异性表达代谢物。将所有代谢物通过kegg、pubchem等常用代谢物数据库进行映射，选择其相应物种数据库搜索，最后进行代谢通路富集和拓扑分析得到通路分析图。
[0045]
实施例5高温组和对照组叶片差异代谢物和代谢通路分析
[0046]
(1)高温胁迫下杨树叶片与对照组相比的差异类代谢物质
[0047]
通过gc-ms测定了高温与对照叶片中的差异代谢物，并筛选共得到67个差异代谢物，去除未知分析物，分别列举上调top前15(表3-3)和下调top前14的差异代谢物。在高温胁迫下，亮氨酸(leucine)、n-甲基-dl-丙氨酸(n-methyl-dl-alanine)、茚满酮(indanone)、6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanic acid)、脯氨酸(proline)、异亮氨酸(isoleucine)显著上升，琥珀酰高丝氨酸(o-succinylhomoserine)、雄烯二酮(androstanediol)、瓜氨酸(citrulline)、吡咯-2-羧酸(pyrrole-2-carboxylic acid)、二氨基丁酸(diaminobutyric acid)、尿嘧啶(uracil)等均显著下降。氨基酸类在对比常温对照组中，高温的条件下leucine的变化最为显著，增加了超过20倍，脯氨酸增加了6log-fold，异亮氨酸、缬氨酸(valine)和丝氨酸(serine)的水平均增加超过3倍，另一方面瓜氨酸和琥珀酰高丝氨酸的水平显著下调超过3倍。有机酸类中，对比常温对照组，丙酮酸和富马酸在高温中显著变化，此外，在我们的实验中对比常温对照组，在高温组中，一些糖类物质也发生了显著地变化，例如蜜二糖和棉子糖显著地增加，此外肌醇的水平为0.27133，低于常温中的0.35396(见表1)。
[0048]
表1为实施例5中杨树叶片高温与对照差异代谢物列表
[0049][0050][0051]
(2)高温胁迫下杨树叶片与对照组相比的差异物的代谢通路
[0052]
高温胁迫下，差异基因主要富集在以下通路：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成；半乳糖代谢；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢通路(如图4所示)。
[0053]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。