一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法与流程

1.本发明属于化学分析领域，具体提供了一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法。


背景技术：

2.氨氯地平为二氢吡啶类钙通道阻滞剂，有苯磺酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐几种盐型，氨氯地平的几种盐型可以互换，用于治疗高血压及冠心病，通过扩张血管来降压，通过增加心肌血流量治疗冠心病，该药为who 以及多个国家的基本药物。氨氯地平原研单位为辉瑞公司，其产品络活喜已经在我国地产化上市。苯磺酸氨氯地平的合成过程中采用了乙醇、甲醇、丙醇和异丙醇作为溶剂，残留乙醇、甲醇、丙醇和异丙醇在生产和贮存过程中易于苯磺酸起酯化反应生成:苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯，苯磺酸酯为基因毒性杂质，需要严格控制。欧洲药典采用了lc-ms法测定控制该基因毒性杂质含量，但仪器昂贵，不利于生产广泛应用控制且成本昂贵；也有文献报道采用hplc法测定，仅测定苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯，该吸收峰位于主成分拖尾峰后，影响积分，而且基线噪音较大。为此，本发明建立了苯磺酸氨氯地平原料中基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯含量的高效液相色谱法(hplc)测定方法，并采用梯度洗脱，使氨氯地平峰延长到25min左右，使其分别在主成分前后出峰，并按照《中国药典》的相关要求做了方法学研究和验证。
3.最接近方案说明：牛慧敏等报道了“苯磺酸氨氯地平原料中基因毒性杂质苯磺酸甲酯与苯磺酸乙酯的含量测定”[1]，该方法流动相中加入了三乙胺，容易造成基线噪音，方法的灵敏度和准确度均不高；主成分为过载峰，峰明显不呈正态分布。


技术实现要素：

[0004]
本发明旨在建立有效分离苯磺酸氛氯地平原料中基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯含量的高效液相色谱法(hplc)测定方法。
[0005]
为实现上述发明目的，本发明一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法，具体实施方案为：本发明所述一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法，该方法为苯磺酸氛氯地平原料中基因毒性杂质含量测定高效液相色谱法，所述基因毒性杂质为苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯。
[0006]
本发明所述一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法，该方法采用c18色谱柱，以磷酸水溶液为流动相a；乙腈：甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为210nm-220nm，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，柱温为38℃-48℃，进样品量20μl。
[0007]
本发明所述一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法，该方法流动相的初始比例为a：b=55：45-65:35，其中流动相a磷酸水溶液浓度为0.01-2%,ph值为3.8-5.2，流动项b乙腈：甲醇=70：20。
[0008]
本发明所述一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法，该方法流动相a磷酸水溶液浓度为0.1-1%,ph值为4.0-5.0，其中ph值调节剂为氢氧化钠溶液。
[0009]
本发明所述一种分离苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质方法，该方法采用c18色谱柱，以0.1-0.5%磷酸水溶液为流动相a，乙腈：甲醇=70：20为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为215 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为45℃，进样品量20μl。
[0010]
本发明所述一种苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质分离方法，该方法样品配制方法包括杂质对照品贮备液配制、系统适用性溶液配制、对照品溶液配制、供试品溶液配制，其中用稀释剂定容。
[0011]
本发明所述一种苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质分离方法，该方法样品配制方法中所述杂质对照品配制浓度为20-40%。
[0012]
本发明所述一种苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质分离方法，该方法样品配制方法中所述杂质对照品配制浓度为30%。
[0013]
本发明所述一种苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质分离方法，该方法样品配制方法中所述稀释剂为乙腈：水：盐酸=400-600: 400-600:1.1-6.6，优选地乙腈：水：盐酸=500:500:4.4。
[0014]
本发明所述一种苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质分离方法，该方法采用gl inertsustain c18色谱柱（250
×
4.6mm，5μm），以0.1%磷酸水溶液（0.5m氢氧化钠溶液调ph至4.0）为流动相a；乙腈：甲醇=70：20为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为215 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为45℃，进样品量20μl。
[0015]
本发明所述一种苯磺酸氨氯地平基因毒性杂质分离方法，该方法各基因毒性杂质线性浓度范围为：苯磺酸甲酯0.1466μg/ml~2.1989μg/ml、苯磺酸乙酯0.1570μg/ml~2.3553μg/ml、苯磺酸丙酯2.9493μg/ml~22.1199μg/ml、苯磺酸异丙酯3.1439μg/ml~23.5794μg/ml，限度要求：各基因毒性杂质峰面积小于等于0.015%。
[0016]
本发明有益效果分析：现有的合成路线有以下缺点：采用了lc-ms法测定控制该基因毒性杂质含量，但仪器昂贵，不利于生产广泛应用控制且成本昂贵；也有文献报道采用hplc法测定，仅测定苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯，该吸收峰位于主成分拖尾峰后，影响积分，而且基线噪音较大。为此，本发明建立了苯磺酸氨氯地平原料中基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯含量的高效液相色谱法(hplc)测定方法，并采用梯度洗脱，使氨氯地平峰延长到25min左右，使其分别在主成分前后出峰，并按照《中国药典》的相关要求做了方法学研究和验证。
[0017]
本发明建立了苯磺酸氛氯地平原料中基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯含量的高效液相色谱法(hplc)测定方法。研究苯磺酸氛氯地平原料中基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯定量测定。结果:苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯吸收峰与氨氯地平能达到有效分离;苯磺酸甲酯在0.1466μg/ml~2.1989μg/ml浓度范围内，线性方程为y=120.2053x+0.4638，相关系数r=0.9997，线性关系良好;苯磺酸乙酯0.1570μg/ml~2.3553μg/ml浓度范围内，线性方程为y=19.0015x + 0.0639，相关系数r=1.0000，y轴截距为100%响应值的0.22%；响应因子的rsd为2.1%，线性关系良好；苯磺酸丙酯线性范围为2.9493μg/ml~22.1199μg/ml，在此
范围内线性回归方程为y=1.5562x-1.0905，线性相关系数为0.9998（r≥0.990），符合要求；苯磺酸异丙酯线性范围为3.1439μg/ml~23.5794μg/ml，在此范围内线性回归方程为y=0.5953x-0.3871，线性相关系数为0.9945（r≥0.990），符合要求。本发明共检测3批苯磺酸氨氯地平原料，且均未检测出苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯的量。本发明所述方法专属性强，准确度与重复性良好，可用于苯磺酸氨氯地平原料中基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯的控制。
[0018]
说明书附图：图1苯磺酸甲酯线性；图2苯磺酸乙酯线性；图3苯磺酸丙酯线性；图4苯磺酸异丙酯线性。
具体实施方式
[0019]
下面实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明范围。
[0020]
实施例1样品配制方法：（1）杂质对照品贮备液配制：精密称定30mg苯磺酸甲酯于100ml容量瓶中，稀释剂溶解定容后，得苯磺酸甲酯母液；精密移取5ml于20ml容量瓶中，作为苯磺酸甲酯贮备液。
[0021]
精密称定30mg苯磺酸乙酯于100ml容量瓶中，稀释剂溶解定容后，得苯磺酸乙酯母液；精密移取5ml于20ml容量瓶中，作为苯磺酸乙酯贮备液。
[0022]
精密称定30mg苯磺酸丙酯于100ml容量瓶中，稀释剂溶解定容后，得苯磺酸丙酯母液；精密移取5ml于20ml容量瓶中，作为苯磺酸丙酯贮备液。
[0023]
精密称定30mg苯磺酸异丙酯于100ml容量瓶中，稀释剂溶解定容后，得苯磺酸异丙酯母液；精密移取5ml于20ml容量瓶中，作为苯磺酸异丙酯贮备液。
[0024]
（2）系统适用性溶液配制：精密移取各杂质贮备液各1ml于同一100ml容量瓶中，稀释剂稀释定容即得系统适用性溶液。
[0025]
（3）对照品溶液配制：同系统适用性溶液。
[0026]
（4）供试品溶液配制：精密称定100mg苯磺酸氨氯地平原料药于20ml量瓶中，加入少许稀释剂超声使溶解后，加入稀释剂定容即得。
[0027]
（1）-（4）所述稀释剂的配制比例为乙腈：水：盐酸=500:500:4.4检测方法：采用gl inertsustain c18色谱柱（250
×
4.6mm，5μm），以0.1%磷酸水溶液（0.5m氢氧化钠溶液调ph至4.0）为流动相a；乙腈：甲醇=70：20为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为215 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为45℃，进样品量20μl。
[0028]
实施例2同实施例1的区别在于检测方法流动项ph值为4.8，检测波长为210 nm，流速为0.8 ml/min，柱温为38℃。
[0029]
实施例3同实施例1的区别在于检测方法流动项ph值为5.2，检测波长为220 nm，流速为1.2 ml/min，柱温为42℃。
[0030]
实施例4同实施例1的区别在于样品配制中杂质对照品贮备液配制浓度为40%，稀
释剂配制比例为乙腈：水：盐酸=400:600:6.6；检测方法流动项ph值为5.0，检测波长为210 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为48℃。
[0031]
实施例5同实施例1的区别在于样品配制中杂质对照品贮备液配制浓度为20%，稀释剂配制比例为乙腈：水：盐酸=600:400:2.2；检测方法流动项ph值为4.5，检测波长为220 nm，流速为0.8ml/min，柱温为45℃。
[0032]
实验例1专属性试验a．空白溶剂干扰：精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、杂质定位溶液各20
µ
l，注入液相色谱仪，记录色谱图；空白溶剂应无干扰峰。通过比对对照品溶液色谱图、苯磺酸甲酯定位溶液色谱图、苯磺酸乙酯定位溶液色谱图、苯磺酸丙酯定位溶液色谱图、苯磺酸异丙酯定位溶液色谱图，实验结果：空白溶剂对本品的检测无干扰。
[0033]
b.系统适用性试验：通过系统适用性实验，空白溶剂无干扰，系统适用性溶液中四杂质分离度大于1.5，满足分离检测要求。该方法专属性较强。
[0034]
实验例2检出限根据系统适用性溶液的信噪比值，稀释出四个杂质的检出限溶液，进样后记录色谱图，以s/n≥3计算检出限，结果见下表：苯磺酸氨氯地平基因毒杂质测定方法验证
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检出限结果（1）苯磺酸氨氯地平基因毒杂质测定方法验证
--
检出限结果（2）由上述实验可知，苯磺酸甲酯检出限为0.9360ng，相当于供试品溶液浓度的0.001%，苯磺酸乙酯检出限为1.5950ng，相当于供试品溶液浓度的0.002%，苯磺酸异丙酯检出限为3.2000ng，相当于供试品溶液浓度的0.003%，苯磺酸丙酯检出限为6.1200ng，相当于供试品溶液浓度的0.006%。
[0035]
实验例3线性详见图1-4图谱：结论：苯磺酸甲酯在0.1466μg/ml~2.1989μg/ml浓度范围内，线性方程为y=120.2053x+0.4638，相关系数r=0.9997，y轴截距为100%响应值的0.26%，响应因子的rsd为2.5%，线性关系良好；苯磺酸乙酯0.1570μg/ml~2.3553μg/ml浓度范围内，线性方程为y=19.0015x + 0.0639，相关系数r=1.0000，y轴截距为100%响应值的0.22%，响应因子的rsd为2.1%，线性关
系良好；苯磺酸丙酯线性范围为2.9493μg/ml~22.1199μg/ml，在此范围内线性回归方程为y=1.5562x-1.0905，线性相关系数为0.9998（r≥0.990），符合要求；苯磺酸异丙酯线性范围为3.1439μg/ml~23.5794μg/ml，在此范围内线性回归方程为y=0.5953x-0.3871，线性相关系数为0.9945（r≥0.990），符合要求。
[0036]
实验例4重复性精密量取各杂质对照品母液5ml，置于同一100ml量瓶中，加稀释剂定容得杂质对照品母液，取苯磺酸氨氯地平原料（批号：17ad129）100mg，精密称定，置20ml量瓶中，加1ml杂质对照品母液，加入稀释剂振摇使溶解后释至刻度，摇匀，滤过，作为重复性加标供试品溶液，重复制备6 份加标供试品溶液；精密量取20
µ
l，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取1ml杂质对照品母液于20ml量瓶中，加稀释剂稀释成对照品溶液，按外标法以峰面积计算。
[0037]
苯磺酸氨氯地平基因毒杂质测定方法验证
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重复性试验上述实验数据表明：所得6份加标供试液中四杂质的rsd为分别为3.5%、3.0%、4.7%、5.0%，该方法的重复性良好。
[0038]
实验例5溶液稳定性照
ꢀ“
样品配制方法”项下对照品溶液配制方法配制一份对照品溶液，在室温条件下放置进样，考察其溶液稳定性，结果见下表。
[0039]
苯磺酸氨氯地平基因毒杂质测定方法验证
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溶液稳定性试验结果
结果：对照品溶液在室温条件下不稳定，需临用新配。
[0040]
实验例6耐用性取空白溶液、对照品溶液，分别在以下表格中试验条件下进样，考察四杂质分离度，来评估测定条件有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。试验条件变动的范围和耐用性结果见下表。
[0041]
苯磺酸氨氯地平基因毒杂质测定方法验证
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耐用性实验色谱条件变动范围表苯磺酸氨氯地平基因毒杂质测定方法验证
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耐用性实验结果
由上表可以看出，将色谱条件中的参数作适度变化后，如色谱条件中的流速、波长、流动相比例、流动相ph及柱温等参数作微小调整后，对各杂质之间的分离度没有影响，说明本系统具有较好的耐用性。
[0042]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。