一种检测猫冠状病毒的试纸条及其制备方法、试剂盒、检测方法与流程

[0001]
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测猫冠状病毒的试纸条及其制备方法、试剂盒、检测方法。


背景技术：

[0002]
猫传染性腹膜炎(fip)是感染猫冠状病毒而引起，该病最早发现于20世纪60年代，fip分为渗出型和非渗出型，随着病情的推进，非渗出型fip可转化为渗出型fip。渗出型fip主要临床特征为纤维蛋白性腹膜炎、胸膜炎、心包炎伴随腹腔、胸腔或心包积液；非渗出型fip无明显积液，主要临床特征为不同器官出现肉芽肿样病变，包括眼睛及中枢神经系统。渗出型fip和非渗出型fip均伴有严重的系统性疾病并产生不同程度的胸腔或腹腔积液。
[0003]
猫冠状病毒(feline coronavirus，fcov)为冠状病毒科冠状病毒属的成员，是家猫和野生猫致死性疾病fip的病原。基于临床症状及产生的病理变化不同，fcov分为两个生物型，猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus，fipv)和猫肠道冠状病毒(feline enteric coronavirus，fecv)。fecv在猫肠道中普遍存在，感染fecv的猫产生轻微的肠道症状，能够自愈，死亡率低。而fipv感染会引起的猫科动物一种慢性进行性致死性传染病，以腹膜炎、腹水大量积聚为主要特征，不同年龄的猫均可感染，但老龄猫和两岁以下的猫发病率较高，纯种猫的发病率高于一般品种的家猫，传染率非常高。
[0004]
fcov在世界各地猫群中普遍存在，不同地区、饲养环境、品种的猫感染的fcov阳性率存在较大差异，该病毒传播途径主要为粪口传播，少数可经衣物、食皿、寝具、人或昆虫等机械途径传播，潜伏期可达几个月，有些猫感染fcov后可持续带毒长达10年。美国加利福尼亚一项血清学调查显示，单独饲养的宠物猫fcov血清阳性率为20.0％，群居饲养的纯种猫血清fcov阳性率为87.0％，因此fcov的感染通常与猫的数量和饲养密度有关。虽然群居饲养不是流浪猫感染fcov的主要原因，但是群居饲养环境使猫感染fcov风险增加，尤其是流浪猫救助站的环境病毒载量更高，使猫更易于感染病毒。美国24家兽医教学医院历经10年对226720只猫进行研究，结果表明每200例新病例中就有一例是fip。公猫和幼龄猫患fip的风险较高，在美国兽医教学医院确诊中，6～24月龄的猫更易患病。通过对种群密度、饲养环境进行优化，可大大的降低群居饲养的猫感染fcov后发展成fip的发病率。
[0005]
fcov感染的实验室检查方法，主要有血清抗体筛查、rt-pcr法以及组织病理学染色切片等，这些检测方法均需要对猫类进行采血，而动物类采血，存在采血困难、样本量少的问题，另外，应用rt-pcr方法在渗出液中检测fcov时，由于存在假阳性结果，该方法诊断特异性有限，且检测时间过长。亟需寻找一种快速方便的诊断试剂，能够及时有效地诊断猫类是否感染fcov，避免感染fcov后，发展成可导致患致死性疾病fip。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的主要针对如何快速准确的检测猫冠状病毒的问题，提供了一种猫冠
状病毒检测试纸条。
[0007]
为实现上述目的，本申请提供了一种检测猫冠状病毒的试纸条，所述试纸条包括底板，所述底板上从左到右依次搭接样品垫层、胶体金垫层、硝酸纤维素膜层和吸水层，所述胶体金垫层上包被有胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜层上包被有猫冠状病毒单克隆抗体作为t1检测线，还包被有猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体作为t2检测线，以及包被有羊抗鸡igg作为质控线。本申请中，所述猫冠状病毒单克隆抗体主要针对猫肠道冠状病毒的检测，所述猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体主要针对猫传染性腹膜炎病毒的检测。
[0008]
作为本申请的进一步改进，所述胶体金垫层上包被的所述猫冠状病毒单克隆抗体和所述猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体的浓度为15μg/ml～25μg/ml；t1检测线上所述猫冠状病毒单克隆抗体的浓度为0.6mg/ml～1.2mg/ml；t2检测线上所述猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体的浓度为0.6mg/ml～1.2mg/ml；质控线上所述羊抗鸡igg的浓度为1.0mg/ml～1.5mg/ml。
[0009]
作为本申请的进一步改进，所述猫冠状病毒单克隆抗体和所述猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体的比例为2:1。
[0010]
作为本申请的进一步改进，所述胶体金垫层上还包被有胶体金颗粒标记的鸡抗猫igy抗体。
[0011]
作为本申请的进一步改进，所述鸡抗猫igy抗体的浓度为10μg/ml～15μg/ml。
[0012]
作为本申请的进一步改进，所述硝酸纤维素膜层粘贴到所述底板的中间位置，在所述底板上所述硝酸纤维素膜层的一侧粘贴吸水层，所述硝酸纤维素膜层的另一侧粘贴胶体金垫层及样品垫层，样品垫层一端压住胶体金垫层一端1.0mm～1.5mm，胶体金垫层另一端压住硝酸纤维素膜层一端0.5mm～1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜层另一端1.0mm～2.0mm。
[0013]
为实现上述目的，本申请还提供了一种所述的检测猫冠状病毒的试纸条的制备方法，包括如下步骤：s1、胶体金垫层的制备：在胶体金垫上包被胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体；s2、硝酸纤维素膜层的制备：在硝酸纤维素膜层上包被猫冠状病毒单克隆抗体作为t1检测线，还包被猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体作为t2检测线，以及包被羊抗鸡igg作为质控线；s3、样品垫层的制备：首先，配制处理液，含0.5％peg20000、0.05％～0.2％tween-20、0.01％～0.05％表面活性剂、0.3％～1.0％封闭剂的100mmol/l、ph9.0的tris-hcl缓冲液；其次，将所述处理液涂布于玻璃纤维上，得到样品垫层；s4、试纸条的制备：在底板1上从左到右依次搭接步骤s3中的样品垫层、步骤s1中的胶体金垫层、步骤s2中的硝酸纤维素膜层和吸水层，即得检测猫冠状病毒的试纸条。
[0014]
作为本申请的进一步改进，在所述胶体金垫上同时包被鸡抗猫igy抗体。
[0015]
为实现上述目的，本申请还提供了一种检测猫冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的检测猫冠状病毒的试纸条、取样拭子和样本稀释液。
[0016]
为实现上述目的，本申请提供了一种应用上述所述的试剂盒检测猫冠状病毒的方法，包括如下步骤：s1、将样品置于样品稀释液中，充分混合静置，取上清液为检测液样本；s2、将检测液样本滴加到试剂盒的样本孔中，静置一段时间，判定结果。
[0017]
本申请的有益效果在于，本申请提供了一种检测猫冠状病毒的试纸条以及由该试
纸条制备而成的试剂盒，所述试纸条包括底板，所述底板上从左到右依次搭接样品垫层、胶体金垫层、硝酸纤维素膜层和吸水层，所述胶体金垫层上包被有胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜层上包被有猫冠状病毒单克隆抗体作为t1检测线，还包被有猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体作为t2检测线，以及包被有羊抗鸡igg作为质控线。应用试纸条、试剂盒的形式检测猫冠状病毒抗原，操作简单，可应用在宠物医院、家庭等场所，达到真正的poct检测，可有效控制该病毒传播。
[0018]
本申请所述试纸条采用多抗体标记及多抗体包被的形式，通过“标记两个型的抗体”的方式制备胶体金垫层，以及分别包被两个型的单克隆抗体于硝酸素纤维素膜上，相比单一抗体标记单抗及单一抗体包被技术，最大限度地提高试剂灵敏度，增加检出率。本发明所述的试剂盒检测方法，步骤简单，可操作性强，可同时检测猫类动物的粪便、分泌物、腹水不同介质中的猫冠状病毒抗原，实现不同介质中猫冠状病毒抗原检测。家庭中宠物猫分泌物及粪便更易收集，实现宠物猫家庭自检使用。
附图说明
[0019]
图1为检测猫冠状病毒试纸条结构示意图；
[0020]
图2为试纸条判定结果为阴性时示意图；
[0021]
图3为试纸条判定结果为阳性时示意图；
[0022]
图4为试纸条判定结果为无效时示意图；
[0023]
图5为不同病毒样本的特异性检测试纸条测试结果显示示意图；
[0024]
图中：1、底板；2、样品垫层；3、胶体金垫层；4、硝酸纤维素膜层；5、吸水层；41、t1检测线；42、t2检测线；43、质控线。
具体实施方式
[0025]
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0026]
为了快速准确的检测猫冠状病毒，本申请提供了一种检测猫冠状病毒的试纸条，如图1所示，所述试纸条包括底板1，所述底板1上从左到右依次搭接样品垫层2、胶体金垫层3、硝酸纤维素膜层4和吸水层5，所述胶体金垫层3上包被有胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜层4上包被有猫冠状病毒单克隆抗体作为t1检测线41，还包被有猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体作为t2检测线42，以及包被有羊抗鸡igg作为质控线43。本申请中，所述猫冠状病毒单克隆抗体和所述猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体按一定比例混合，胶体金垫层3上混合2个生物型猫冠状病毒抗体，涵盖了猫冠状病毒的两个生物型，减少漏检，有利于提高猫冠状病毒的检出率。
[0027]
本申请中，作为优选的实施例，所述胶体金垫层3上包被的所述猫冠状病毒单克隆抗体和所述猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体的浓度为15μg/ml～25μg/ml；t1检测线41上所述猫冠状病毒单克隆抗体的浓度为0.6mg/ml～1.2mg/ml；t2检测线42上所述猫传染性腹膜
炎病毒多克隆抗体的浓度为0.6mg/ml～1.2mg/ml；质控线43上所述羊抗鸡igg的浓度为1.0mg/ml～1.5mg/ml。作为进一步优选的实施例，所述猫冠状病毒单克隆抗体和所述猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体的比例为2:1。
[0028]
本申请中，作为优选的实施例，所述胶体金垫层3上还包被有胶体金颗粒标记的鸡抗猫igy抗体，鸡抗猫igy抗体与哺乳动物免疫球蛋白(如类风湿因子、自身抗体)之间不会发生血清免疫交叉反应，避免了假阳性的产生。作为优选的实施例，所述鸡抗猫igy抗体的浓度为10μg/ml～15μg/ml。
[0029]
本申请中，为了快速准确的检测猫冠状病毒还提供了一种检测猫冠状病毒的试纸条的制备方法，s1、胶体金垫层3的制备：在胶体金垫上包被胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体；s2、硝酸纤维素膜层4的制备：在硝酸纤维素膜层4上包被猫冠状病毒单克隆抗体作为t1检测线41，还包被猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体作为t2检测线42，以及包被羊抗鸡igg作为质控线43；s3、样品垫层2的制备：首先，配制处理液，含0.5％peg20000、0.05％～0.2％tween-20、0.01％～0.05％表面活性剂、0.3％～1.0％封闭剂的100mmol/l、ph9.0的tris-hcl缓冲液；其次，将所述处理液涂布于玻璃纤维上，得到样品垫；s4、试纸条的制备：在底板1上从左到右依次搭接步骤s3中的样品垫层2、步骤s1中的胶体金垫层3、步骤s2中的硝酸纤维素膜层4和吸水层5，即得检测猫冠状病毒的试纸条。进一步的，常用的所述封闭剂有bsa、脱脂奶粉、酪蛋白、血清等，所述表面活性剂可以为曲拉通x-100。本申请中，所述tween-20的质量百分含量进一步限定为0.05％～0.1％。
[0030]
本申请中，作为一优选的实施例，胶体金垫层3的制备中：在胶体金垫上包被胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体，具体制备方法如下：胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备而得，在胶体金中按15μg/ml～25μg/ml比例缓慢加入猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体，进一步优选的，在胶体金中按20μg/ml比例缓慢加入猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体，充分反应后得到第一胶体金混合物，将第一胶体金混合物以7000rpm～10000rpm的离心速度离心30分钟，弃掉上清液，浓缩，静置反应20min～30min，制得胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体与猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体，即第一胶体金复合物，将第一胶体金复合物喷涂到玻璃纤维上，得到胶体金垫层3；作为进一步优选的实施例，猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体按照2:1的比例混合，对所述胶体金混合物浓缩的倍数为20倍，由猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体制备的所述第一胶体金复合物的浓度优选为15％。本申请中，作为一优选的实施例，第一胶体金复合物的具体喷涂过程如下：取玻璃纤维放入不锈钢盘中，量取45ml第一胶体金复合物，所述第一胶体金复合物中含4.5ml胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体以及2.25ml胶体金颗粒标记的猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体，倒入不锈钢盘，使第一胶体金复合物被完全均匀吸收，后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥，干燥时间为12小时，得到胶体金垫层3，保存备用。
[0031]
本申请中，作为另一优选的实施例，胶体金垫层3的制备中：在胶体金垫上包被胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体，在所述胶体金垫上还同时包被鸡抗猫igy抗体，具体制备方法如下：第一胶体金复合物的制备方法如上所述，第二胶体金复合物的制备方法如下所述：在胶体金中按10μg/ml～15μg/ml比例缓慢加入鸡抗猫igy抗体，充分反应后得到第二胶体金混合物，将第二胶体金混合物以8000rpm～
10000rpm的离心速度离心30分钟，弃掉上清液，浓缩，得到胶体金颗粒标记的鸡抗猫igy抗体，即第二胶体金复合物。作为另一优选的实施例，所述胶体金垫层3的制备为将上述第一胶体金复合物按10％～15％的浓度，第二胶体金复合物按3％～4％的浓度，喷涂于玻璃纤维上，干燥，得到胶体金垫层3。
[0032]
本申请中，作为一优选的实施例，硝酸纤维素膜层4的制备：在硝酸纤维素膜层4上包被猫冠状病毒单克隆抗体作为t1检测线41，还包被猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体作为t2检测线42，以及包被羊抗鸡igg作为质控线43，具体制备方法如下：将浓度为0.6mg/ml～1.2mg/ml的猫冠状病毒单克隆抗体用50mmol/l的pbs缓冲液进行稀释，并加入质量百分含量为2％～4％的蔗糖溶液，包被于硝酸纤维素膜上，于60℃环境中干燥2h，得到在硝酸纤维素膜层4上包被猫冠状病毒单克隆抗体后的t1检测线41；将浓度为0.6mg/ml～1.2mg/ml的猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体，用50mmol/l的pbs缓冲液进行稀释，并加入质量百分含量为2％～4％的蔗糖溶液，包被于硝酸纤维素膜上，于60℃环境中干燥2h，得到在硝酸纤维素膜层4上包被猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体的t2检测线42；将浓度为1.0mg/ml～1.5mg/ml的羊抗鸡igg用50mmol/l的pbs缓冲液进行稀释，并加入质量百分含量为2％～4％的蔗糖溶液，包被于硝酸纤维素膜上，于60℃环境中干燥2h，得到在硝酸纤维素膜层4上包被羊抗鸡igg的质控线43。
[0033]
本申请中，作为一优选的实施例，样品垫的制备：首先，配制处理液，含0.5％peg20000的大分子聚合物、0.05％～0.2％tween-20、0.01％～0.05％曲拉通x-100、0.5％bsa、0.3％酪蛋白的100mmol/l，ph9.0的tris-hcl缓冲液；其次，将所述处理液涂布于玻璃纤维上，干燥，得到样品垫；作为另一优选的实施例，样品垫的制备：首先，配制处理液，含0.5％peg20000的大分子聚合物、0.05％～0.2％tween-20、0.01％～0.05％曲拉通x-100、0.5％酪蛋白钠的100mmol/l，ph9.0的tris-hcl缓冲液；处理液配制的详细过程如下：称取12.114g tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解于900ml超纯水中，依次加入5g peg20000、5g酪蛋白钠、2ml tween-20、0.2ml曲拉通x-100，充分溶解混合后，hcl调节ph至9.0，应用超纯水定容至1l；其次，将所述处理液涂布于玻璃纤维上，干燥，进一步优选如下：将玻璃纤维裁剪为30cm
×
25cm大小的垫层，用50ml处理液均匀涂布垫层，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥，干燥时间为16个小时，得到样品垫，保存备用。
[0034]
本申请中，作为一优选的实施例，试纸条的制备：在底板1上从左到右依次搭接步骤s3中的样品垫层2、步骤s1中的胶体金垫层3、步骤s2中的硝酸纤维素膜层4和吸水层5，所述底板1为pvc板，在底板1的中间位置粘贴制备硝酸纤维素膜层4，在底板1固定硝酸纤维素膜位置的一侧粘贴吸水层5；在底板1固定硝酸纤维素膜位置的另一侧粘贴制备的胶体金垫层3及样品垫层2，样品垫层2一端压住胶体金垫层3一端1.0～1.5mm，胶体金垫层3另一端压住硝酸纤维素膜层4一端0.5～1mm，吸水层5的一端压住硝酸纤维素膜层4另一端1.0～2.0mm，将上述步骤得到的产品压平整后，切成3.0mm宽的试纸条，即得检测猫冠状病毒的试纸条，
[0035]
本申请中，还提供了一种检测猫冠状病毒抗原的试剂盒，所述试剂盒包括上面所述的检测猫冠状病毒的试纸条，还包括用于取样的拭子、样本稀释液；作为一优选的实施例，所述样本稀释液为含牛血清白蛋白bsa、tween-80以及防腐剂的10mmol/l的tris-hcl缓冲液。
[0036]
本申请中，还提供了一种猫冠状病毒抗原检测方法，所述检测方法包括如下步骤：s1、将样品置于样品稀释液中，充分混合静置，取上清液为检测液样本；s2、将检测液样本滴加到试剂盒的样本孔中，静置一段时间，判定结果。作为一优选的实施例，详细的检测步骤如下：s1、所述样品取自猫粪便、分泌物、腹水。取样的过程中，针对粪便样品，采集量不宜过多，以覆盖拭子1/3到2/3为宜；针对分泌物样品，如待检动物眼结膜、鼻腔、口腔、肛门等部位的分泌物样品，以拭子充分湿润为宜；针对腹水，用注射器从病猫腹腔中抽取腹水样品，取样量一般为2ml～3ml。将样品置于样品稀释液中，详细处理过程如下：若样品为粪便样本或分泌物样本，则将取样拭子直接插入装有缓冲液的样品管中；若样品为腹水，则取0.2ml腹水样品加到装有缓冲液的样品管中。样品置于样本稀释液中后，充分混匀后静置1min，取上清液作为检测液样本，用一次性塑料吸管吸取待检测的检测液样本，滴加2-3滴(80-100μl)至试剂盒的样品孔中，静置5min～8min之内判读结果，静置时间大于10min后的结果判定无效。结果判定的标准如下：
[0037]
阴性，如图2所示：仅质控线43c处出现一条红色条带，在猫冠状病毒抗原试纸条的检测线t1、t2处均无红色条带出现，表明猫冠状病毒抗原为阴性结果，样本中不含猫冠状病毒(fecv)及猫传染性腹膜炎病毒(fcov)；
[0038]
阳性，如图3所示：
[0039]
1、三条红色条带出现。两条红色条带分别出现于t1检测线、t2检测线处，另一条红色条带出现于质控线43c处。阳性结果表明：样本中同时含有猫冠状病毒(fecv)及猫传染性腹膜炎病毒(fcov)；
[0040]
2、两条红色条带出现。一条红色条带分别出现于t1检测线处，另一条红色条带出现于质控线43c处。阳性结果表明：样本中含有猫冠状病毒(fecv)；
[0041]
3、两条红色条带出现。一条红色条带分别出现于t2检测线处，另一条红色条带出现于质控线43c处。阳性结果表明：样本中含有猫传染性腹膜炎病毒(fcov)；
[0042]
无效，如图4所示：质控线43c处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效。判定结果为无效时，需进行重复实验。
[0043]
特异性检测：为了考察所述试纸条的特异性，分别对患有猫瘟病毒、猫肠道冠状病毒以及猫传染性腹膜炎病毒的猫进行取样检测，其中患有猫瘟病毒的样本作为阴性样本，按照上述所述的检测方法进行检测，检测结果如图5所示，其中，图5中
①
对应的为猫冠状病毒检测结果显示、图5中
②
对应的为猫传染性腹膜炎病毒检测结果显示、图5中
③
对应的为猫瘟病毒检测结果显示，根据检测结果显示，猫瘟病毒样本检测结果为阴性，猫冠状病毒样本及猫传染性腹膜炎病毒样本检测到的结果为阳性。
[0044]
猫冠状病毒灵敏度检测：将浓度分别为101tcid
50
/ml、102tcid
50
/ml、10
2.5
tcid
50
/ml、103tcid
50
/ml、10
3.5
tcid
50
/ml、104tcid
50
/ml、10
4.5
tcid
50
/ml、105tcid
50
/ml、10
5.5
tcid
50
/ml猫冠状病毒样本按照上述所述的检测方法进行检测，检测结果表明，试纸条的最低检测限为10
4.5
tcid
50
/ml。
[0045]
猫传染性腹膜炎病毒灵敏度检测：将浓度分别为102tcid
50
/ml、10
2.5
tcid
50
/ml、103tcid
50
/ml、10
3.5
tcid
50
/ml、104tcid
50
/ml、10
4.5
tcid
50
/ml、105tcid
50
/ml、10
5.5
tcid
50
/ml、106tcid
50
/ml猫传染性腹膜炎病毒样本按照上述所述的检测方法进行检测，检测结果表明，试纸条的最低检测限为105tcid
50
/ml。
[0046]
稳定性试验：分别于第1，5，10，15，19，20，21，22天对不同批次的免疫层析试纸稳定性进行检测，其方法是将10
4.5
tcid
50
/ml猫冠状病毒以及105tcid
50
/ml猫传染性腹膜炎病毒按照上述所述的检测方法进行检测，检测所用的试纸条是37℃条件下分别保存1，5，10，15，19，20，21，22天。不同批次间稳定性的检测结果相同，且均为阳性。
[0047]
综上所述，本申请提供了一种检测猫冠状病毒的试纸条以及由该试纸条制备而成的试剂盒，所述试纸条包括底板1，所述底板1上从左到右依次搭接样品垫层2、胶体金垫层3、硝酸纤维素膜层4和吸水层5，所述胶体金垫层3上包被有胶体金颗粒标记的猫冠状病毒单克隆抗体和猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜层4上包被有猫冠状病毒单克隆抗体作为t1检测线41，还包被有猫传染性腹膜炎病毒多克隆抗体作为t2检测线42，以及包被有羊抗鸡igg作为质控线43。应用试纸条、试剂盒的形式检测猫冠状病毒抗原，操作简单，具有良好的特异性、检测灵敏度和稳定性，可应用在宠物医院、家庭等场所，达到真正的poct检测，可有效控制该病毒传播。
[0048]
本申请所述试纸条采用多抗体标记及多抗体包被的形式，通过“标记两个型的抗体”的方式制备胶体金垫层3，以及分别包被两个型的单克隆抗体于硝酸纤维素膜上，相比单一抗体标记单抗及单一抗体包被技术，最大限度地提高试剂灵敏度，增加检出率。本发明所述的试剂盒检测方法，步骤简单，可操作性强，可同时检测猫类动物的粪便、分泌物、腹水不同介质中的猫冠状病毒抗原，实现不同介质中猫冠状病毒抗原检测。家庭中宠物猫分泌物及粪便更易收集，实现宠物猫家庭自检使用。
[0049]
需要强调的是：以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。