一种基于绝缘微球浓度变化导致微通道电阻改变的生物传感检测方法与流程

[0001]
本发明属于生物传感领域，涉及一种生物传感检测方法，尤其是一种基于绝缘微球浓度变化导致微通道电阻改变的生物传感检测方法，本发明还涉及一种生物传感检测装置及用于生物传感检测的微流控芯片。


背景技术：

[0002]
开发性能优异、成本低廉、操作简便的现场快速检测技术在食品安全、疾病诊断、环境监测等方面将发挥重要作用。近年来，生物传感器由于其良好的灵敏度和特异性、易实现集成化等优势，在现场快速检测领域倍受关注。生物传感器往往以生物分子(如抗原、抗体、核酸)为识别元件，通过换能器将识别信息转换为可检测的信号。迄今为止，光学、电化学、磁性等信号读出方式仍然是广泛采用的信号读出方式。然而，对于现场快速检测，这些方法依然受到诸如仪器复杂、成本高、易受环境干扰以及需要专业人员的操作等限制。例如传统的光学检测手段，需要光源、滤波片、光子检测器以及精准的光路设计，这不仅增加了仪器的复杂性，同时也提高了成本。电化学生物传感方法也是常见的传感方法，但其电极一般需要打磨和修饰，导致方法的稳定性和准确性较差。为了克服这些限制，研究者们正在探索更加有效、稳定的信号读出方式。近年来，压力、距离、温度甚至气味等也作为读出信号，并在现场快速检测方面展现出一定的优势，但这些信号读出方式的稳定性和可操作性不够好。
[0003]
在生物传感器中，采用不同的物理化学原理，可将生物识别信息转换为不同的读出信号。例如采用纳米酶催化的产气反应，可将生物识别信息转换为气压、距离等信号；采用热敏元件，可将酶促反应过程产生的热量转换为温度信号。上述信号可采用压力计、温度计等简单设备方便地读出，尤其适合构建便携式生物传感器。然而，类似气压、温度这些物理参数极易受到环境干扰，给现场操作带来了不便；另外，这些信号的产生仍然依赖于化学反应，一定程度上增加了结果的不确定性。因此，在现场快速检测技术中，一个理想的读出信号，不仅要具有极高的抗干扰能力，还要与生物识别反应具有直接的量化关系。
[0004]
由于电信号如电压、电阻、电流等，不仅测量方便，而且不易受到外界环境的干扰，若能将生物识别信息直接转变为电流或电压信号，会大大降低传感器的成本，同时可以提高仪器的抗干扰能力。经检索，目前尚未发现以生物识别引起的电流或电压变化为读出信号的现场快速检测技术的报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个目的是为解决现有的生物传感器在现场快速检测中成本高、易受干扰等问题，提供一种成本低、稳定性好、抗干扰能力强的基于绝缘微球浓度变化导致微通道电阻改变的生物传感检测方法，本发明的另一个目的是提供一种生物传感检测装置及用于生物传感检测的微流控芯片。
[0006]
本发明所提供的方法和装置，其工作原理如下：
[0007]
在微米尺寸的通道内，当绝缘颗粒穿过时，会产生明显的阻塞效应。若在通道两端施以恒定的电压或电流，则绝缘颗粒的存在会导致电阻改变，并且改变幅度与绝缘颗粒的浓度呈正相关。因此，我们首先将生物识别分子分别修饰在磁珠和绝缘微球表面，然后加入待测目标物进行孵育，经过磁分离，溶液中未反应的绝缘微球浓度与目标物浓度相关。将该溶液置于导电池内，施加恒定的电压或电流，电渗流驱动绝缘微球流经微通道，检测仪表读取电流值或电压值，与空白对照组进行对比，可得到电流差值，该差值大小取决于绝缘微球浓度，从而与目标物浓度相关，可进行定量分析。
[0008]
以毛细管微通道为例，其内壁表面带有负电荷，在高电压的作用下，溶液中的正电荷与毛细管内壁表面的负电荷相互作用，形成双电层，由于这些正电荷是溶剂化的，故将引起管中的溶液整体向负极移动。若溶液中存在绝缘颗粒，则会被电渗流驱动通过毛细管微通道，由于绝缘微球和毛细管内径的尺寸差别较小，故毛细管中的绝缘颗粒会引起显著的阻塞效应，从而导致电阻的增大，如下所示。
[0009]
无绝缘颗粒存在时，微通道的电阻：
[0010][0011]
有绝缘颗粒存在时，微通道的电阻：
[0012]
r
↑
′
＝(2arctan(((d/2))/(|((s/π)|(d/2)
↑
2))))/(σπ|((s/π)|(d/2)
↑
2)))+(l|d)/σs
[0013]
其中，l表示微通道长度，s表示微通道横截面积，d表示绝缘颗粒直径，σ表示溶液的电导率。
[0014]
为了实现第一个目的，本发明提供一种基于绝缘微球浓度变化导致微通道电阻改变的生物传感检测方法，该方法包括以下步骤：
[0015]
(1)将生物识别分子分别修饰在磁珠和绝缘微球的表面，然后加入待测目标物进行生物反应；
[0016]
(2)将反应后的溶液进行磁分离，取分离后的溶液，溶液中未反应的绝缘微球浓度与待测目标物浓度相关；
[0017]
(3)在微通道两端置入正极电极和负极电极并施加恒定的电压或电流，形成闭环电路，混合液在电渗流驱动下流经设在正极电极和负极电极之间的微通道，绝缘微球在流经微通道时产生阻塞效应，导致闭环电路的电阻上升，并且上升幅度与绝缘微球的浓度呈正相关，通过检测闭环电路的电流或电压的变化值可计算绝缘微球的浓度并间接得到待测目标物含量；
[0018]
其中，所述微通道的内径为10～500μm，长度为0.1～5mm。
[0019]
所述生物识别分子为能够与待测目标物发生免疫竞争反应的抗体及其抗原；或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生双抗夹心免疫反应的包被抗体及其标记抗体；或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生dna分子杂交反应的一对探针。
[0020]
优选地，所述微通道的内径为75μm，长度为2mm。
[0021]
优选地，所述绝缘微球为聚苯乙烯微球或聚丁二烯微球或聚异戊二烯微球。
[0022]
优选地，所述绝缘微球的粒径为0.1～50μm，其中，当绝缘微球的粒径为1μm时，绝
缘微球与磁珠的质量比为1:1；当绝缘微球的粒径为3μm时，绝缘微球与磁珠的质量比为1:3。
[0023]
优选地，所述闭环电路上施加的电压为1～1000v，优选为200v。
[0024]
为实现第二个目的，本发明提供一种基于绝缘微球浓度变化导致微通道电阻改变的生物传感检测装置，该装置包括通过管道连通的反应装置和导电池，所述反应装置外设有磁分离器，所述管道上设有阀门，所述导电池由第一导电池与第二导电池两部分组成，所述第一导电池与第二导电池之间设有微通道，所述微通道的内径为10～500μm，长度为0.1～5mm，所述第一导电池和第二导电池的内部分别设有正极电极和负极电极，所述正极电极和负极电极分别通过导线与直流电源的正、负极连接，形成闭环电路，所述闭环电路上设有检测仪表和电源输出控制器。
[0025]
优选地，所述反应装置上设有活塞。
[0026]
本发明还提供另一种用于生物传感检测的微流控芯片，包括芯片本体，所述芯片本体上设有反应通道和微通道，所述微通道的内径为10～500μm，长度为0.1～5mm，所述反应通道和微通道之间设有分离池，所述分离池外设有磁分离器，所述微通道的两端设有第一导电池和第二导电池，所述分离池与第一导电池连通，所述第一导电池和第二导电池内分别设有正极电极和负极电极，所述正极电极与负极电极通过导线与设在芯片本体外部的直流电源的正、负极连接，形成闭环电路，所述闭环电路上还设有检测仪表和电源输出控制器，所述反应通道的末端设有两个进样口，所述两个进样口与设在芯片本体外部的蠕动泵连通。
[0027]
本发明的有益效果是：
[0028]
1)操作简便、设备成本低：以电流或者电压为读出信号，测量方便，抗干扰能力强，无需复杂昂贵的仪器，成本极低(300～500元)；
[0029]
2)传感原理高效、准确性好：上述电流或者电压的变化由绝缘微球的浓度决定，而非化学反应所导致，因而检测结果准确、稳定；
[0030]
3)分析速度快：检测过程仅涉及一步生物化学反应，即目标物的识别结合，大大缩短了检测时间；
[0031]
4)高通量检测：因为电极不需要修饰，可以测完一个样品之后立刻测下一个样品，检测效率极高，适合大批量样本的快速分析；
[0032]
5)平台高度集成，电池供电，可实现现场快速检测。
附图说明
[0033]
图1：基于微通道的电化学生物传感装置的结构示意图。
[0034]
图2：用于电化学生物传感检测的微流控芯片的结构示意图。
[0035]
图3：微通道内径分别为75μm、100μm、150μm，长度为2mm；ps微球直径为1μm；施加电压为200v，测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间的相关性。
[0036]
图4：微通道内径分别为75μm、100μm、150μm，长度为2mm；ps微球直径为3μm；施加电压为200v，测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间的相关性。
[0037]
图5：微通道内径为75μm，长度分别为2、3、4mm；ps微球直径为1μm；施加电压为200v，测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间的相关性。
[0038]
图6：微通道内径为75μm，长度分别为2、3、4mm；ps微球直径为3μm；施加电压为200v，测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间的相关性。
[0039]
图7：微通道内径为75μm，长度为2mm；ps微球直径为1μm；施加电压分别为0、60、80、100、120、140、160、180、200v，测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间的相关性。
[0040]
图8：微通道内径为75μm，长度为2mm；ps微球直径为3μm；施加电压分别为0、60、80、100、120、140、160、180、200v，测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间的相关性。
[0041]
图9：微通道内径为75μm，长度为2mm；ps微球直径分别为1μm、3μm时测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间的线性关系。
[0042]
图10：不同磁珠与ps微球比例下测得的电流差值(δi)和毒死蜱浓度对数值之间的相关性。
[0043]
图11：检测毒死蜱的工作曲线。
[0044]
图12：检测降钙素原的工作曲线。
[0045]
图13：检测沙门氏菌dna的工作曲线。
具体实施方式
[0046]
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0047]
试验材料及相关术语说明
[0048]
羧基磁珠：粒径1μm，10mg/ml，购自ocean nanotech,usa。
[0049]
羧基化聚苯乙烯(ps)微球：粒径1μm、3μm，50mg/ml购自bangs laboratories,inc.。
[0050]
毒死蜱抗体(3.5mg/ml)、毒死蜱-bsa偶联物(5.7mg/ml)：购自山东蓝都生物科技有限公司。
[0051]
毒死蜱标准品：购自百灵威科技公司。
[0052]
降钙素原(1.4mg/ml)、降钙素原捕获抗体、降钙素原检测抗体：购自abcam公司。
[0053]
沙门氏菌dna检测探针和捕获探针：由生工生物工程(上海)有限公司设计合成。
[0054]
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(edc)、n-羟基硫代琥珀酰亚胺活泼酯(sulfo-nhs)：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
[0055]
mes、mest：分别为2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、2-(n-吗啡啉)乙磺酸-tween20缓冲液。
[0056]
实施例1利用生物识别分子修饰磁珠和ps微球
[0057]
磁珠与ps微球的活化及其与生物识别分子的偶联均使用本领域所熟知的常规方法，具体如下：
[0058]
1、磁珠的活化
[0059]
1)取2mg磁珠(平均直径1μm)于离心管中，用500μl mest(10mm mes,0.05％tween 20,ph 6.0)洗涤2次，磁分离移除上清液；
[0060]
2)用10mm mes(ph 6.0)配制5mg/ml edc溶液和5mg/ml nhs溶液；
[0061]
3)向装有磁珠的离心管中分别加入100μl edc(5mg/ml)和50μl nhs(5mg/ml)，使用涡旋器混匀使磁珠充分悬浮，用mes稀释至500μl，放置于旋转混匀仪上，37℃活化30min；
[0062]
4)磁分离，除去上层清液，加入500μl mest，并将磁珠转移至新的离心管中；
[0063]
5)磁分离，除去上层清液，用500μl mest洗涤2次，磁分离，除去上层清液。
[0064]
经上述步骤，磁珠表面的羧基已被活化。
[0065]
2、ps微球的活化
[0066]
1)取2mg ps微球(平均直径为1～10μm)于离心管中，用500μl mest(10mm mes，0.05％tween 20，ph 6.0)洗涤2次，离心(10000rpm，6min)，除去上层清液；
[0067]
2)用10mm mes(ph 6.0)配制5mg/ml edc溶液和5mg/ml nhs溶液；
[0068]
3)向装有ps微球的离心管中分别加入100μl edc(5mg/ml)和50μl nhs(5mg/ml)，使用涡旋器混匀使ps微球充分悬浮，用mes稀释至500μl，放置于旋转混匀仪上，37℃活化30min；
[0069]
4)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，用500μl mest洗涤3次；
[0070]
5)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液。
[0071]
经上述步骤，ps微球表面的羧基已被活化。
[0072]
3、磁珠与生物识别分子的偶联
[0073]
以毒死蜱抗体为例，对偶联过程进行说明，其余生物识别分子包括降钙素原抗体、氨基修饰的dna探针等也能采用类似的方法。
[0074]
1)将100μg毒死蜱抗体加入到上述装有磁珠的离心管中，用pbst调节总体积至500μl，轻摇混匀磁珠和抗体；
[0075]
2)将上述混合物置于旋转混匀仪上，37℃反应3h；
[0076]
3)磁分离，除去上层清液，加入含1％bsa的pbst(ph 7.4)500μl，重新悬浮磁珠，置于旋转混匀仪上，37℃封闭30min；
[0077]
4)磁分离，除去上层清液，500μl pbst洗涤3次；
[0078]
5)磁分离，除去上层清液，所得到的毒死蜱抗体修饰的磁珠用1ml pbst(ph 7.4，含0.02％nan3，0.5％bsa)重新悬浮，置于4℃保存。
[0079]
4、ps微球与生物识别分子的偶联
[0080]
以bsa-毒死蜱偶联物为例，对偶联过程进行说明，其余生物识别分子包括降钙素原抗体，氨基修饰的dna探针等也能采用类似的方法。
[0081]
1)将100μg bsa-毒死蜱加入到上述装有ps微球的离心管中，用pbst调节总体积至500μl，轻摇混匀ps微球和bsa-毒死蜱；
[0082]
2)将上述混合物置于旋转混匀仪上，37℃反应3h；
[0083]
3)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，加入含1％bsa的pbst(ph 7.4)500μl，重新悬浮ps微球，置于旋转混匀仪上，37℃封闭30min；
[0084]
4)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，500μl pbst洗涤3次；
[0085]
5)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，所得到的bsa-毒死蜱修饰的ps微球用1ml pbst(ph 7.4，含0.02％nan3，0.5％bsa)重新悬浮，置于4℃保存。
[0086]
实施例2生物传感检测装置和微流控芯片的组建
[0087]
参考图1，该装置包括反应装置1和导电池2。
[0088]
所述反应装置1是用于进行生物反应的场所，可设有保温、搅拌装置，所述反应装置1外设有磁分离器5，用于分离反应后的磁珠，为了加速反应溶液的流出，在反应装置1上
还设有活塞6。
[0089]
所述导电池2用于容纳反应后分离的溶液并进行电信号检测，它与反应装置1通过设在底部的管道7相连通，所述管道7上设有阀门8。
[0090]
所述导电池2由第一导电池3与第二导电池4两部分组成，所述第一导电池3与第二导电池4通过设在底部的微通道9相连通，所述微通道9的内径为10～500μm，长度为0.1～5mm，所述第一导电池3和第二导电池4的内部分别设有正极电极10和负极电极11，所述第一导电池3和第二导电池4的外部设有直流电源12，所述正极电极10和负极电极11分别通过导线与直流电源12的正、负极连接，形成闭环电路，所述闭环电路上设有检测仪表14，用于检测并显示电路上的电压、电流、或电阻。所述闭环电路上还设有电源输出控制器13，用于控制直流电源的电压或电流输出。
[0091]
上述装置也可以通过微流控芯片予以实现，其结构如图2所示，图中虚线内是芯片本体示意图，所述芯片本体上设有反应通道16和微通道9，所述反应通道16和微通道9之间设有分离池15，所述分离池15外设有磁分离器5，所述微通道9的两端设有第一导电池3和第二导电池4，所述分离池15与第一导电池3连通，所述第一导电池3和第二导电池4内分别设有正极电极10和负极电极11，所述正极电极10与负极电极11通过导线与设在微流控芯片外部的直流电源12的正、负极连接，形成闭环电路，所述闭环电路上还设有检测仪表14和电源输出控制器13。所述反应通道16的末端设有两个进样口17，所述两个进样口17与设在微流控芯片外部的蠕动泵18连通。即芯片上的反应通道16、分离池15、磁分离器5和蠕动泵18共同构成反应装置。
[0092]
实施例3 ps微球浓度与电阻的定量关系探究
[0093]
向第一导电池中加入不同浓度和直径的ps微球溶液，接通电源，使溶液在电渗流驱动下流经第一导电池和第二导电池之间不同内径的微通道，检测不同电压下闭环电路的电流，考察ps微球浓度与电阻的关系。
[0094]
试验1)：微通道内径分别为75μm、100μm、150μm，长度为2mm；ps微球直径为1μm，浓度为103、104、105、106、107、108pg/ml；所施加电压为200v下测得的电流值。从图3的结果可以看出，三种内径的微通道下测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间均存在明显的正相关性，其中当微通道内径为75μm时效果最佳。
[0095]
试验2)：微通道内径分别为75μm、100μm、150μm，长度为2mm；ps微球直径为3μm，浓度为103、104、105、106、107、108pg/ml；所施加电压为200v下测得的电流值。从图4的结果可以看出，三种内径的微通道下测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间均存在明显的正相关性，其中当微通道内径为75μm时效果最佳。
[0096]
试验3)：微通道内径为75μm，长度分别为2、3、4mm；ps微球直径为1μm，浓度为103、104、105、106、107、108pg/ml；所施加电压为200v下测得的电流值。从图5的结果可以看出，三种长度的微通道下测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间均存在明显的正相关性，其中当微通道长度为2mm时效果最佳。
[0097]
试验4)：微通道内径为75μm，长度分别为2、3、4mm；ps微球直径为3μm，浓度为103、104、105、106、107、108pg/ml；所施加电压为200v下测得的电流值。从图6的结果可以看出，三种长度的微通道下测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间均存在明显的正相关性，其中当微通道长度为2mm时效果最佳。
[0098]
试验5)：微通道内径为75μm，长度为2mm；ps微球直径为1μm，浓度为103、104、105、106、107、108pg/ml；所施加电压分别为0、60、80、100、120、140、160、180、200v下测得的电流值。从图7的结果可以看出，施加不同电压时微通道下测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间均存在明显的正相关性，其中当施加电压为200v时效果最佳。
[0099]
试验6)：微通道内径为75μm，长度为2mm；ps微球直径为3μm，浓度为103、104、105、106、107、108pg/ml；所施加电压分别为0、60、80、100、120、140、160、180、200v下测得的电流值。从图8的结果可以看出，施加不同电压时微通道下测得的电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间均存在明显的正相关性，其中当施加电压为200v时效果最佳。
[0100]
根据以上试验结果，ps微球浓度与微通道的电阻具有良好的相关性，能够通过检测电路的电信号(包括电流和电压)得到ps微球浓度，从而为本发明的应用奠定了理论基础。其中当微通道内径为75μm、长度为2mm，所施加电压为200v时效果最佳，如图9所示，在此条件下，电流差值(δi)与ps微球浓度对数值之间具有良好的线性关系。此外，相对于1μm的ps微球(y＝3.86x-10.40，r2＝0.99)，使用3μm的ps微球时(y＝5.61x-16.22，r2＝0.99)，灵敏度更高。
[0101]
实施例4毒死蜱的检测
[0102]
检测毒死蜱之前，对毒死蜱-bsa偶联物修饰的ps微球和毒死蜱抗体修饰的磁珠的浓度进行了优化。具体如下，微通道内径为75μm，长度为2mm；ps微球直径分别为1、3μm；所施加电压为200v；磁珠：ps微球质量比例分别为1:2、1:1、2:1、3:1(ps微球直径1μm)和1:1、2:1、3:1、4:1(ps微球直径3μm)时测得的电流值。从图10的结果可以看出，采用不同的ps微球和磁珠的比例，对电流差值(δi)和毒死蜱浓度的相关性有明显影响，其中当ps微球的直径为1μm时，磁珠：ps微球为1:1时效果最佳；而ps微球直径为3μm时，磁珠：ps微球为3:1时效果最佳。
[0103]
对柑橘中的毒死蜱进行了检测，具体过程如下：
[0104]
1)将毒死蜱抗体修饰的磁珠用pbs稀释至300μg/ml；
[0105]
2)用乙醇配制1mg/ml的毒死蜱标准储备液，并配制成浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/ml的标准工作溶液；
[0106]
3)分别向反应装置内中加入100μl磁珠稀释液(300μg/ml)和100μl毒死蜱标准品溶液(0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/ml)，孵育5～20min；
[0107]
4)将bsa-毒死蜱修饰的ps微球用pbs稀释至100μg/ml；
[0108]
5)向反应装置中加入100μl ps微球(直径3μm)稀释液(100μg/ml)，孵育5～20min；
[0109]
6)在反应装置外施加磁场以吸附反应后的磁珠，同时压动活塞并开启阀门，使未结合的ps微球-bsa-毒死蜱进入第一导电池；
[0110]
7)向第二导电池内加入300μl pbs溶液，控制直流电源的输出，使其向电极施加200v直流电压，此时，在电渗流的作用下，溶液通过微通道(内径75μm、长度2mm)整体向负极移动，由于ps微球与微通道的尺寸在同一个数量级上，当其经过时将产生明显的阻塞效应，导致电阻增大，此时，可用检测仪表记录电流，与空白组对照，可得电流差值；
[0111]
8)以毒死蜱浓度的对数值为横坐标，电流差值为纵坐标，作标准曲线，如图11所示；
[0112]
9)采用标准加入法对柑橘样品中的毒死蜱残留进行检测，过程同上，结果如表1所
示。
[0113]
该毒死蜱检测方法的原理如下：反应装置内，毒死蜱抗体修饰的磁珠、毒死蜱抗原修饰的ps微球、样品中的毒死蜱三者发生免疫竞争反应，当样品中无毒死蜱时，毒死蜱抗体修饰的磁珠与毒死蜱抗原修饰的ps微球结合生成复合物，从而使溶液中未反应的毒死蜱抗原修饰的ps微球减少；当样品中有毒死蜱时，毒死蜱抗体修饰的磁珠与毒死蜱抗原修饰的ps微球、样品中的毒死蜱竞争性结合生成复合物，从而使溶液中未反应的毒死蜱抗原-ps微球增加。因此，样品中的毒死蜱浓度与未反应的毒死蜱抗原-ps微球浓度正相关。将复合物进行磁分离，通过检测未反应的毒死蜱抗原-ps微球浓度从而间接得到样品中的毒死蜱浓度。
[0114]
表1.采用标准加入法对柑橘中的毒死蜱进行检测的结果
[0115][0116]
此外，从分析性能方面，包括灵敏度、稳定性、分析时间等，对该检测方法与传统的elisa方法进行了对比，结果如表2所示，表明该方法不仅具有较高的灵敏度，而且稳定性更好，分析时间也从2～3小时缩短到0.5小时之内。
[0117]
表2.本方法和elisa对毒死蜱的分析性能对比
[0118]
分析性能检出限(pg/ml)rsd(％)分析时间(min)本方法2.85＜8.0＜30elisa250＜12.0＞120
[0119]
实施例5降钙素原的检测
[0120]
为了验证该方法同样适用于大分子，对人血清中的炎症标志物降钙素原(pct)进行了检测，具体如下：
[0121]
1)将pct包被抗体修饰的磁珠(2mg/ml)用pbs稀释至300μg/ml；
[0122]
2)使用pbs配制1mg/ml的pct标准品储备液，配制成浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100ng/ml的pct标准品溶液；
[0123]
3)分别向反应装置内加入100μl磁珠稀释液(300μg/ml)和100μl pct标准品溶液(0、0.01、0.1、1、10、100ng/ml)，孵育5～20min；
[0124]
4)磁分离，移去上层清液，加入100μl pct标记抗体修饰的ps微球(直径3μm，100μg/ml)，孵育5～20min；
[0125]
5)磁分离，同时压动活塞，使未结合的ps微球进入第一导电池；
[0126]
6)向第二导电池内加入100μl pbs溶液，向第一导电池和第二导电池施加200v直流电压，同时记录电流；
[0127]
7)以pct浓度的对数值为横坐标，电流差值为纵坐标，作标准曲线，如图12所示；
[0128]
8)采用标准加入法对人血清样品中的pct进行检测，过程同上，结果如表3所示。
[0129]
该降钙素原检测方法的原理如下：反应装置内，pct包被抗体修饰的磁珠、pct标记
抗体修饰的ps微球、样品中的pct三者发生双抗夹心免疫反应，生成磁珠-包被抗体-降钙素原-标记抗体-ps微球复合物。反应后溶液中未反应的pct标记抗体-ps微球与样品中降钙素原的浓度负相关，将复合物进行磁分离，通过检测未反应的pct标记抗体-ps微球浓度从而可间接得到样品中的降钙素原浓度。
[0130]
表3.采用标准加入法对人血清中的pct进行检测的结果
[0131][0132]
实施例6用于dna的检测
[0133]
以沙门氏菌检测为例，说明本方法在检测dna方面的可行性。
[0134]
采用微流控芯片，对沙门氏菌进行检测，具体过程如下：
[0135]
1)设计和待测沙门氏菌dna对应的两条dna的探针(探针1和2)，并且将这两条探针分别偶联在磁颗粒和ps微球的表面。
[0136]
2)按照试剂盒方法对沙门氏菌基因组dna进行提取，并按下述体系进行扩增：10
×
pcr缓冲液5.0μl，5.0μl上述基因组dna清液，上、下游引物各1.0μl(10μm)，1.0μl dna聚合酶(5u/μl)，1.0μl dntp(10mm)，3.0μl mgcl2和33μl超纯水。反应条件如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃延伸10min。
[0137]
3)将探针1修饰的磁珠(2mg/ml)用pbs稀释至300μg/ml；
[0138]
4)将100μl磁珠-探针1(300μg/ml)、100μl ps微球-探针2(100μg/ml)、10μl柠檬酸钠溶液、40μl无菌水混合；将100μl沙门氏菌dna样品、10μl柠檬酸钠溶液、40μl无菌水混合；两种混合液分别置于100℃水浴中10min，然后迅速置于冰浴中10min；
[0139]
5)将上述两种混合液分别通过微流控芯片上的两个进样口注入反应通道，50℃下反应30min；
[0140]
6)当反应液经过磁分离后，未结合的ps微球-探针2进入第一导电池，向第二导电池中加pbs，向第一导电池和第二导电池施加200v直流电压，同时记录电流；
[0141]
7)以沙门氏菌浓度的对数值为横坐标，以电流差值为横坐标，作标准曲线，如图13所示；
[0142]
8)采用标准加入法对火腿肠中的沙门氏菌进行检测，过程同上，结果如表4所示。
[0143]
该沙门氏菌检测方法的原理如下：反应装置内，探针1修饰的磁珠、探针2修饰的ps微球、样品中的沙门氏菌dna三者发生dna分子杂交反应，生成复合物。反应后溶液中未反应的探针2修饰的ps微球与样品中沙门氏菌dna的浓度呈负相关，将复合物进行磁分离，通过检测未反应的探针2修饰的ps微球浓度从而可间接得到样品中的沙门氏菌dna浓度。
[0144]
表4.采用标准加入法对火腿肠中的沙门氏菌进行检测的结果
[0145][0146]
上述的电流型传感分析方法也可以是电压型传感方法，具体原理如下：微米尺寸的通道内，当绝缘颗粒穿过时，会产生明显的阻塞效应。若在通道两端施以恒定的电流，则绝缘颗粒的存在会导致电阻的上升，并且上升幅度与绝缘颗粒的浓度呈正相关。根据这一原理，我们首先将生物识别分子分别修饰在磁珠和聚苯乙烯(ps)微球表面，然后加入待测目标物进行孵育，经过磁分离，溶液中剩余的ps微球浓度与目标物浓度相关。取一定量的该溶液置于导电池内，施加电流，电渗流驱动溶液流经微通道，电压表读取电压值，与空白对照组进行对比，可得到电压差值，该差值大小取决于ps微球浓度，从而与目标物浓度相关，可进行定量分析。
[0147]
申请人声明，通过上述实施例来解释本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述具体实施例才能实施。所属领域的技术人员在本发明基础上进行的任何改进，或者对本发明所选用的材料的等效替换等，均落在专利的保护范围之内。