一种羟氯喹中羟氯喹侧链的检测方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种羟氯喹侧链的检测方法。

背景技术：

羟氯喹，化学名为7-氯-4-[5-(n-乙基-n-2-羟乙基-2-戊基]氨基喹啉，是一种4-氨基喹啉类药物，临床最早用于抗疟原虫的治疗，是治疗类风湿性关节炎的联合首选用药。

羟氯喹是由4,7-二氯喹啉和5（n-乙基-n-2-羟乙基胺）-2-戊胺经费歇尔合成反应制得，其中，5（n-乙基-n-2-羟乙基胺）-2-戊胺，又名羟氯喹侧链，结构式为：，是羟氯喹的起始原料，可能存在于羟氯喹中。

目前，少有报道羟氯喹中羟氯喹侧链的检测方法，本发明首次公开了羟氯喹中羟氯喹侧链的检测方法，本发明为解决羟氯喹中羟氯喹侧链的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确的检测方法，该方法能检测羟氯喹中羟氯喹侧链的含量，从而有效保障用药安全。

技术实现要素：

本发明提供一种羟氯喹中羟氯喹侧链的检测方法，羟氯喹侧链是含氨基的化合物，本发明选择cp-volamine柱，针对含氨基化合物具有较好选择性，有较好灵敏度及峰型的柱子，羟氯喹侧链是高沸点化合物，选择高温等度，能让羟氯喹侧链快速出峰，峰型更好，灵敏度更高，有利于检测，该方法便捷、高效、准确，在系统适用性、重复性、专属性、准确度方面完全符合中国药典方法验证的指导原则，可用于羟氯喹的质量控制。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种羟氯喹中羟氯喹侧链的检测方法，采用气相色谱法进行检测，所述检测方法包括以下步骤：

（1）配制溶液，分别配制空白溶液、灵敏度溶液、参比溶液和测试溶液。

（2）测定方法：采用气相色谱法测定羟氯喹中羟氯喹侧链的含量，待系统稳定后，分别进空白溶液，灵敏度溶液，参比溶液和测试溶液，记录色谱图；

ⅰ：色谱条件如下:色谱柱：涂有碱钝化的非极性硅氧烷型固定相的熔融硅胶色谱柱，柱温：200℃保持16min，进样口温度：300℃，检测器温度：300℃，能满足检测，温度过高样品易分解，不利于样品检测，分流比：5:1，分流大小，会影响到灵敏度问题及定量限和检测限水平，选择5:1能满足定量限水平，载气：n2，空气流速：300ml/min，氢气流速：30ml/min，补给流量（氮气）：40ml/min，流速：4ml/min，进样体积：2μl。

进一步的，所述空白溶液为二氯甲烷，所述参比溶液：取适量羟氯喹侧链对照品置于容量瓶中，加入适量空白液溶解并稀释至刻度，摇匀，所述灵敏度溶液：量取适量参比溶液，置于容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得，所述测试溶液：取适量样品，置于容量瓶中，加空白溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，所述色谱柱为agilentcp-volamine30m×0.32mm。

进一步的，气象色谱仪带fid检测器、自动进样器。

（1）配制溶液：空白溶液：二氯甲烷；

羟氯喹侧链储备液：取羟氯喹侧链对照品约250mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；精密量取5.0ml，置100ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：125μg/ml）

参比溶液：精密量取羟氯喹侧链储备液2.0ml，置20ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：12.5μg/ml）

灵敏度溶液：精密量取参比溶液5.0ml，置20ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：3.12μg/ml）

测试溶液：取样品约250mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。（浓度：12.5mg/ml）

色谱条件：

色谱柱：涂有碱钝化的非极性硅氧烷型固定相的熔融硅胶色谱柱（如agilentcp-volamine30m×0.32mm或极性相当的色谱柱）进样量：0.5µl

柱温：200℃保持16min；

进样口温度：300℃；检测器温度：300℃；

分流比：5:1；载气：n2；

空气流速：300ml/min；氢气流速：30ml/min；

补给流量（氮气）：40ml/min；

流速：4ml/min；进样体积：2μl；

（2）测定方法：

待系统稳定后，进空白溶液1针，灵敏度溶液1针，参比溶液6针，测试溶液1针，记录色谱图。

结果（ppm）=（ru/rs）×（cs/cu）

其中：ru：测试溶液中羟氯喹侧链的峰面积；

rs：6针参比溶液中羟氯喹侧链的平均峰面积；

cs：参比溶液中羟氯喹侧链的浓度（μg/ml）；

cu：测试溶液的浓度（g/ml）。

限度：

所述的羟氯喹侧链的检测方法还包括在检测之前的方法验证，该方法验证为按照正式检测的色谱条件，测定结果为：

本发明首次公开了羟氯喹侧链的检测方法，本发明为解决羟氯喹中羟氯喹侧链的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确的检测方法，该方法能检测羟氯喹中羟氯喹侧链的含量，从而有效保障用药安全。

附图说明

图1为羟氯喹侧链空白溶液图谱

图2为羟氯喹侧链灵敏度溶液图谱

图3为羟氯喹侧链参比溶液图谱

图4为羟氯喹侧链样品溶液图谱

图5为羟氯喹侧链线性关系图

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1：

1、色谱条件

仪器：气相色谱仪带fid检测器、自动进样器，电子分析天平。

色谱柱：涂有碱钝化的非极性硅氧烷型固定相的熔融硅胶色谱柱（如agilentcp-volamine30m×0.32mm或极性相当的色谱柱）

柱温：200℃保持16min。

进样口温度：300℃；检测器温度：300℃；

分流比：5:1；载气：n2；

空气流速：300ml/min；氢气流速：30ml/min；

补给流量（氮气）：40ml/min；

2、溶液配制

稀释液：二氯甲烷；

空白溶液：稀释液；

羟氯喹侧链储备液：取羟氯喹侧链对照品约250mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；精密量取5.0ml，置100ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：125μg/ml）

参比溶液：精密量取羟氯喹侧链储备液2.0ml，置20ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：12.5μg/ml）

灵敏度溶液：精密量取参比溶液5.0ml，置20ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：3.12μg/ml）

测试溶液：取样品约250mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。（浓度：12.5mg/ml）

选择性溶液：取样品约250mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加适量稀释液溶解，精密量取羟氯喹侧链储备液2.0ml，同置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（羟氯喹侧链浓度：12.5μg/ml、羟氯喹浓度：12.5mg/ml）

测试溶液（加标）：取样品约250mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加适量稀释液溶解，精密量取羟氯喹侧链储备液2.0ml，同置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；同法配制6份。（羟氯喹侧链浓度：12.5μg/ml、羟氯喹浓度：12.5mg/ml）

loq溶液：根据灵敏度溶液所得羟氯喹侧链的s/n值，调节稀释比例至羟氯喹侧链的s/n值≥10；同法配制6份。

lod溶液：精密量取loq溶液3.0ml，置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

线性-50%溶液：精密量取储备液1.0ml，置20ml容量瓶，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：6.25μg/ml）

线性-80%溶液：精密量取储备液2.0ml，置25ml容量瓶，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：10.0μg/ml）

线性-100%溶液：精密量取储备液2.0ml，置20ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：12.5μg/ml）

线性-120%溶液：精密量取储备液3.0ml，置25ml容量瓶，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：15.0μg/ml）

线性-150%溶液：精密量取储备液3.0ml，置20ml容量瓶，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：18.75μg/ml）

准确度loq溶液：根据定量限和检测限项下loq溶液浓度配制准确度loq稀释液。取样品适量，用该溶液溶解并稀释成浓度为12.5mg/ml的溶液；同法配制3份。

准确度100%溶液：取样品约250mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加适量稀释液溶解，精密量取羟氯喹侧链储备液2.0ml，同置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；同法配制3份。（羟氯喹侧链浓度：12.5μg/ml、羟氯喹浓度：12.5mg/ml）

准确度150%溶液：取样品约250mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加适量稀释液溶解，精密量取羟氯喹侧链储备液3.0ml，同置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；同法配制3份。（羟氯喹侧链浓度：18.75μg/ml、羟氯喹浓度：12.5mg/ml）

3、步骤

待系统稳定后，进空白溶液1针，灵敏度溶液1针，参比溶液6针，测试溶液1针，记录色谱图。

4、要求

灵敏度溶液中羟氯喹侧链的s/n值应≥10，6针参比溶液中羟氯喹侧链峰面积的rsd应≤10.0%。

5、计算

结果（ppm）=（ru/rs）×（cs/cu）

其中：ru：测试溶液中羟氯喹侧链的峰面积；

rs：6针参比溶液中羟氯喹侧链的平均峰面积；

cs：参比溶液中羟氯喹侧链的浓度（μg/ml）；

cu：测试溶液的浓度（g/ml）。

6、限度

备注：为确认序列运行过程中系统稳定性，按以下方式和要求进行：

（1）当日常检测时，建议待参比溶液完成进样后，每隔10针或序列的最后，进参比溶液1针，要求后连续6针参比溶液中羟氯喹侧链峰面积的rsd应≤10.0%。

（2）当进行分析方法验证时，待参比溶液完成进样后，每隔8小时或序列的最后，进参比溶液1针，要求后连续6针参比溶液中羟氯喹侧链峰面积的rsd应≤10.0%。

实施例2：系统适用性

系统适用性是通过测定灵敏度溶液中羟氯喹侧链的s/n值和6针参比溶液中羟氯喹侧链峰面积的rsd而实现的，要求灵敏度溶液中羟氯喹侧链的s/n值应≥10，6针参比溶液中羟氯喹侧链峰面积的rsd应≤10.0%。

实施例3：专属性

专属性是通过测定空白溶液对羟氯喹侧链检测有无干扰以及选择性溶液中羟氯喹侧链与相邻组分峰之间的分离度而实现的；要求空白溶液对羟氯喹侧链检测应无干扰，选择性溶液中羟氯喹侧链与相邻组分峰之间的分离度应≥1.5。

实施例4：重复性

重复性是通过测定6份测试溶液（加标）中羟氯喹侧链测定结果的rsd而实现的，要求6份测试溶液（加标）中羟氯喹侧链测定结果的rsd应≤10.0%。

实施例5：定量限和检测限

检测限是通过检测其响应信号与噪声之比（s/n）≥3而得到的，定量限由信噪比（s/n）≥10而得到的。在定量限浓度水平重复考察6份定量限溶液，6份loq溶液中羟氯喹侧链单位浓度峰面积的rsd应≤10.0%；loq应≤300ppm，s/n≥10；lod＜loq，s/n≥3。

实施例6：线性和范围

在loq~150%限度浓度范围内选6个浓度点，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标画曲线，要求羟氯喹侧链在loq～150%限度浓度范围内应呈线性，线性相关系数的平方（r2）应≥0.99，y轴截距的绝对值应在100%浓度响应值的25%以内。

实施例7：准确度

准确度是通过测定被测组分实测浓度和理论浓度之间的回收率和回收率的总rsd（n=9）而实现的，要求加入loq浓度、100%限度浓度、150%限度浓度下的准确度溶液中羟氯喹侧链在各浓度的回收率应在80.0%~120.0%之间，回收率的总rsd（n=9）应≤10.0%。

备注：（1）测试溶液引用6.2专属性项下测试溶液，参比溶液引用6.1系统适用性项下参比溶液前6针；

（2）样品带入峰面积=测试溶液测得峰面积×准确度溶液样品称取量÷测试溶液样品称取量；

（3）测得浓度=计算峰面积÷参比溶液平均峰面积×参比溶液投入浓度；

（4）回收率（%）=测得浓度÷投入浓度×100。

实施例8：耐用性

考察参比溶液、测试溶液和选择性溶液在室温下放置一定时间后进样，检测结果随时间变化的规律，为检测时参比溶液和测试溶液的放置时间提供依据。

要求：（1）与0时相比较，参比溶液在室温下放置一定时间内，羟氯喹侧链的回收率应在90.0%~110.0%之间，且无明显的变化趋势，则参比溶液在室温下考察期间内稳定；

（2）若测试溶液0时有检出羟氯喹侧链，测试溶液在室温下放置一定时间内，测定结果变化值在限度的20%以内，且无明显的变化趋势，则测试溶液在室温下考察期间内稳定；

若测试溶液0时未检出羟氯喹侧链，测试溶液在室温下放置一定时间内，仍无羟氯喹侧链检出，则测试溶液在室温下考察期间内稳定；

（3）选择性溶液在室温下放置一定时间内，羟氯喹侧链的回收率应在80.0%~120.0%之间，且无明显的变化趋势，则选择性溶液在室温下考察期间内稳定。

备注：稳定性考察时长应不少于24小时。