一种旋毛虫竞争ELISA抗体检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于血清学免疫检测技术领域，具体涉及一种旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

旋毛虫病是一种危害非常严重的人兽共患病，其不但可给畜牧业生产造成巨大的经济损失，而且对人类身体健康也构成巨大威胁，人或动物主要通过生食或半生食含有旋毛虫的肉类(主要为猪肉)而发病。

对于屠宰动物旋毛虫病的检验，国际动物卫生组织(oie)的法规检验方法为镜检法及集样消化法，目前我国也在延用这两种方法。然而以上两方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，其敏感性为肉中虫体密度达到每克3条虫体时方可检出。集样消化法虽可大大提高检出率，将虫体检出率提高至每克肉1条虫体，但该方法仍十分繁琐，在发现阳性样品时仍需对阳性组采用消化法进行逐头检测。从敏感性的角度来看，由镜检法和集样消化法所造成漏检的肉类均存在安全隐患并可引起人类的感染(摄入75条虫体即可引起人的感染)。国内外学者对旋毛虫血清学检测的方法进行了大量的研究。目前，旋毛虫肌幼虫排泄分泌物es抗原是oie及国际旋毛虫委员会推荐的用于血清学抗体检测的标准抗原。基于es抗原的间接elisa检测方法的灵敏度达到每克肉0.01条虫体，可以用于旋毛虫感染的诊断。然而es抗原成分复杂，制备繁琐并严格依赖于活体动物，生产周期长、批内和批间的质控十分困难，而且存在交叉反应等问题，因而阻碍了其实际应用。

人类感染旋毛虫主要是通过生食或半生食含有感染性幼虫的圈养动物(主要是猪)的肉类，因此监控畜群的旋毛虫感染水平对于防控人类感染十分重要。旋毛虫在圈养动物内的循环感染主要由肉类残渣的饲喂活动和偶然地啮齿类的捕食活动造成。因此，对于啮齿类-猪群-人类食物链上各个宿主的感染防控都显得十分重要。然而，基于es抗原的间接elisa试剂盒需要根据宿主的不同制备不同的试剂盒组分，无法实现一个方法通用型地检测多个宿主。目前也尚未有多宿主通用型的旋毛虫抗体检测试剂盒。

除es抗原，已有研究表明对感染后6h的旋毛虫cdna表达文库中进行免疫学筛选，获得了一个高丰度强反应原性的抗原蛋白，并将其命名为wn10，该蛋白编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂。wn10基因注册号：eu263325，wn10蛋白注册号：aby60755。此外，研究者发现进一步免疫印记和间接elsia表明原核表达的重组ts-wn10抗原可以被猪感染旋毛虫感染17天、25天和60天血清所识别，表明ts-wn10是旋毛虫血清学检测的理想候选抗原，可以用来改进血清学检测方法。

固相竞争elisa检测技术(celisa)是在单克隆抗体技术基础上发展起来的一种免疫学检测技术。常规固相竞争elisa是在96孔微孔板上包被抗原，待检血清与单克隆抗体竞争结合微孔板底的抗原，再用hrp标记的抗单抗的二抗进行信号检测，但由于单克隆抗体在物种来源上的限制(主要是小鼠和兔)，只能用于非单抗物种来源的宿主检测项目中。近年来，抗体标记技术取得了较大发展，已经能够将单抗标记上生物素，采用生物素-亲和素系统进行信号检测，可以摆脱单抗物种的限制。目前已报道的旋毛虫病抗体检测elisa方法中，包括有间接elisa和一个竞争elisa方法，且均采用肌幼虫排泄分泌物es抗原。

技术实现要素：

为了更稳定、准确检测多宿主旋毛虫感染，本发明提供了一种旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒，所述旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒含有：

底板包被有旋毛虫ts-wn10重组抗原的96孔反应板，

用0.9％nacl溶液稀释到2μg/ml的生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9溶液，

辣根过氧化氢酶hrp标记的亲和素溶液，

洗涤液，

tmb显色底物，

终止液，

和阴性质控；

其中，所述阴性质控为浓度为1μg/ml的生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9溶液。

进一步地限定，所述单克隆抗体ts-wn10-1h9是由杂交瘤细胞株wn10-1h9制备的，所述杂交瘤细胞株wn10-1h9的微生物保藏编号为cgmccno.18316。

进一步地限定，所述辣根过氧化氢酶hrp标记的亲和素溶液为ebioscencetmavidin-hrp。

进一步地限定，所述tmb显色底物为tmb单组分显色液。

进一步地限定，所述终止液为浓度为2m的h2so4溶液。

在本发明的一个实施例中，所述旋毛虫ts-wn10重组抗原的制备步骤为：

①将重组菌bl21(de3)-pet28a-ts-wn10加入到lb培养基中37℃震荡培养至od600nm为0.5-1时，加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃诱导6-8h；

②诱导后菌液离心后用30ml20mm的tris-hcl重悬缓冲液重悬，冰上超声破碎，离心后取沉淀；

③用30ml预冷的包涵体洗涤液重悬，冰上超声破碎，离心收获沉淀；

④重复步骤③操作至少2次；

⑤离心收获的沉淀用30ml预冷的含尿素的pbs洗涤液重悬，冰上超声破碎，离心收获沉淀；

⑥重复步骤⑤操作至少1次；

⑦离心收获沉淀用5mlbindingbuffer重悬，4℃溶解过夜，离心收上清，上清过滤后准备上样；

⑧akta蛋白纯化仪柱上复性流程参考gehealthcaare手册purifyingchallengingproteins77-79内容，纯化柱采用histraphp1ml，注射上样后柱上复性时间为2h，100％置换至refoldingbuffer溶液后，更换至elutionbuffer洗脱目的蛋白。

在本发明的一个实施例中，所述生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9的制备步骤为：

步骤1、取12周龄健康的balb/c小鼠腹腔，向其注射石蜡油，0.5ml/只；

步骤2、1周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞wn10-1h9，7～10天后当小鼠腹腔极度膨胀时抽取腹水，隔2天抽取一次，所述杂交瘤细胞wn10-1h9的微生物保藏号为cgmccno.18316；

步骤3、将抽取的腹水于10000rpm离心10min去除上层油脂和沉淀，上清液经纯化后得到单克隆抗体ts-wn10-1h9，akta蛋白纯化仪抗体纯化流程参考gehealthcaare手册antibodypurification125内容，纯化柱采用hitrapproteinghp1ml。

步骤4、采用蛋白质ε-氨基与酰化的生物素共价结合的方法，对步骤3获得的单克隆抗体ts-wn10-1h9进行生物素标记的标记。

在本发明的一个实施例中，板底包被有旋毛虫ts-wn10重组抗原的96孔反应板的制备步骤为：

步骤一、将旋毛虫ts-wn10重组抗原用cbs缓冲液稀释至3μg/ml，96孔反应板中每孔包被100μl稀释后的重组抗原，于4℃包被16h；

步骤二、包被后的反应板弃去多余的包被液，每孔加入300μlpbst洗涤液，洗涤3次，每次1min；

步骤三、每孔加入300μl含1％bsa的pbst封闭液，于37℃封闭1h；

步骤四、弃去封闭液，每孔加入300μlpbst洗涤液，洗涤3次，每次1min。

本发明还提供了上述旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒检测的方法：

取50ul待测血清和50ul浓度为2μg/ml的单克隆抗体ts-wn10-1h9溶液，混匀，加入到板底包被有旋毛虫ts-wn10重组抗原的96孔反应板中，于37℃反应1h，在板内平行设立阴性质控对照；

用pbst洗涤液洗涤3次后，每孔加入100ul经含1％bsa的pbst溶液稀释的hrp标记的亲和素，于37℃反应30min；

再用pbst洗涤液洗涤3次；

每孔加入100ultmb显色底物，于37℃显色8min后终止，读取阴性质控450nm处吸光度值odnc以及待检血清450nm处吸光度值odsample；

然后计算抑制率pi％＝(1-odsample/odnc)％。

进一步地限定，旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒检测的方法为：

对于猪血清样品，当待测样品pi％≥52％时，则判定为阳性；

当待测样品pi％＜52％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立；

对于小鼠血清样品，当待测样品pi％≥39％时，则判定为阳性；

当待测样品pi％＜39％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立；

对于人血清样品，当待测样品pi％≥41.12％时，则判定为阳性；

当待测样品pi％＜41.12％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。

有益效果

原核表达的重组ts-wn10抗原以及相应的单克隆抗体ts-wn10-1h9两者结合的特异性强、纯度好、重复性强、便于质量控制、且可大量的生产。因此，本发明建立一种基于重组ts-wn10抗原和单克隆抗体的旋毛虫病抗体诊断elisa，同时采用生物素-亲和素系统和竞争elisa的方法，针对不同宿主的血清划定不同的临界值，组装成一个多宿主通用型的检测试剂盒。

本发明制备的elisa试剂盒具有质量可控、操作简单、结果易判读、多宿主通用等优点，同时在检测时不与其他寄生虫阳性血清发生交叉反应，特异性高；且具有长期稳定的特点，实用性较强、容易保存、具有市场开发价值。具有广泛推广空间，极具市场前景。

附图说明

图1.旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒检测原理示意图；

图2.cut-off值测定结果：a为270份健康猪血清的pi％统计学分析结果；b为30份健康小鼠血清的pi％统计学分析结果；c为100份健康人血清和47份旋毛虫病人血清的pi％统计学分析结果；d为将100份健康人血清和47份旋毛虫病人血清的pi％进行roc统计学分析的结果；

图3.猪不同感染剂量及时间抗体水平检测；

图4.竞争elisa试剂盒特异性检测(人血清)；

图5.不同种/基因型旋毛虫感染200ml/只剂量60dpi的小鼠血清检测。

具体实施方式

在旋毛虫检测方面还没有利用单克隆抗体和单一重组抗原作为诊断抗原检测抗旋毛虫抗体的固相竞争elisa试剂盒，本发明对此进行了探究。本发明采用生物素标记单克隆抗体ts-wn10-1h9，通过对各种固相材料的选择和反应体系及反应条件的优化，建立了一种基于单克隆抗体ts-wn10-1h9和ts-wn10重组抗原的固相竞争elisa试剂盒。将重组抗原ts-wn10包被到96孔反应板底部，单克隆抗体ts-wn10-1h9标记生物素，连同辣根过氧化氢酶hrp标记的亲和素、pbst洗涤液、tmb底物、终止液和阴性质控进行旋毛虫病竞争elisa检测试剂盒的组装。所述试剂盒的检测原理如图1所示，生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9，与待检血清中的抗体竞争结合96孔反应板中的ts-wn10重组抗原，在反应板底被包被原截留；单抗上标记的生物素可以与hrp标记的亲和素发生特异性地结合；亲和素上标记的hrp催化tmb底物显色。终止显色后，读取450nm处吸光度值。读取阴性质控450nm处吸光度值odnc，待检血清450nm处吸光度值odsample，计算抑制率pi％＝(1-odsample/odnc)％。对于猪血清样品，当待测样品pi％≥52％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜52％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。对于小鼠血清样品，当待测样品pi％≥39％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜39％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。对于人血清样品，当待测样品pi％≥41.12％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜41.12％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

主要实验材料及来源：

ni纯化柱histraphp购自美国ge公司；solubletmbsubstratesolution购自tiangen公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记的亲和素购自赛默飞世尔科技公司。

实验动物：

12周龄balb/c小鼠由长春亿斯实验动物技术有限公司提供。新西兰兔由长春亿斯实验动物技术有限公司提供。其他试剂或仪器设备如无特殊说明均可通过商业化途径购买获得。

实施例1、旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒。

本实施例所述一种旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒含有：底板包被有旋毛虫ts-wn10重组抗原的96孔反应板，用0.9％nacl溶液稀释到2μg/ml的生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9溶液，辣根过氧化氢酶hrp标记的亲和素溶液，洗涤液，tmb显色底物，终止液，和阴性质控；其中，所述阴性质控为浓度为1μg/ml的生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9溶液；所述单克隆抗体ts-wn10-1h9是由杂交瘤细胞株wn10-1h9制备的，所述杂交瘤细胞株wn10-1h9的微生物保藏编号为cgmccno.18316，该细胞株于2019年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述辣根过氧化氢酶hrp标记的亲和素溶液为ebioscencetmavidin-hrp；所述tmb显色底物为tmb单组分显色液；所述终止液为浓度为2m的h2so4溶液。

1)旋毛虫ts-wn10重组抗原的制备步骤为：

①取1ml重组菌bl21(de3)-pet28a-ts-wn10加入到100mllb培养基中37℃震荡培养至od600nm为0.5-1时，加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃诱导6-8h；

②诱导后菌液离心后用30ml重悬缓冲液(20mm的tris-hclph8.0)重悬，冰上超声破碎，离心后取沉淀；

③用30ml预冷的包涵体洗涤液(2m尿素、20mmtris-hcl、0.3mnaclph8.0)重悬，冰上超声破碎，离心收获沉淀；

④重复步骤③操作至少2次；

⑤离心收获的沉淀用30ml预冷的含尿素的pbs洗涤液(含4m尿素的0.01mpbs)重悬，冰上超声破碎，离心收获沉淀；

⑥重复步骤⑤操作至少1次；

⑦离心收获沉淀用5mlbindingbuffer(8m尿素、20mmtris-hcl、0.3mnacl、5mm咪唑ph8.0)重悬，4℃溶解过夜，离心收上清，上清过滤后准备上样；

⑧akta蛋白纯化仪柱上复性流程参考gehealthcaare手册purifyingchallengingproteins77-79内容，纯化柱采用histraphp1ml，注射上样后柱上复性时间为2h，100％置换至refoldingbuffer(20mmtris-hcl、0.3mnacl、5mm咪唑、1mm2-巯基乙醇ph8.0)溶液后，更换至elutionbuffer(20mmtris-hcl、0.3mnacl、500mm咪唑ph8.0)洗脱目的蛋白。

2)生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9的制备步骤为：

步骤1、取12周龄健康的balb/c小鼠腹腔，向其注射石蜡油，0.5ml/只；

步骤2、1周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞wn10-1h9，7～10天后当小鼠腹腔极度膨胀时抽取腹水，隔2天抽取一次，所述杂交瘤细胞wn10-1h9的微生物保藏号为cgmccno.18316；

步骤3、将抽取的腹水于10000rpm离心10min去除上层油脂和沉淀，上清液经纯化后得到单克隆抗体ts-wn10-1h9，akta蛋白纯化仪抗体纯化流程参考gehealthcaare手册antibodypurification125内容，纯化柱采用hitrapproteinghp1ml。

步骤4、采用蛋白质ε-氨基与酰化的生物素共价结合的方法，对步骤3获得的单克隆抗体ts-wn10-1h9进行生物素标记的标记，所用生物素为常规商品化试剂。

3)板底包被有旋毛虫ts-wn10重组抗原的96孔反应板的制备步骤为：

步骤一、将旋毛虫ts-wn10重组抗原用cbs缓冲液稀释至3μg/ml，96孔反应板中每孔包被100μl稀释后的重组抗原，于4℃包被16h；

步骤二、包被后的反应板弃去多余的包被液，每孔加入300μlpbst洗涤液，洗涤3次，每次1min；

步骤三、每孔加入300μl含1％bsa的pbst封闭液，于37℃封闭1h；

步骤四、弃去封闭液，每孔加入300μlpbst洗涤液，洗涤3次，每次1min。

实施例2、旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒的检测方法。

1)血清样品的检测方法：

取50μl生物素标记的单克隆抗体ts-wn10-1h9溶液与50μl待检血清在ep管中混匀，加入到预先包被有ts-wn10重组抗原的96孔反应板中，于37℃竞争反应1h，在板内设立阴性质控对照(1μg/ml，100μl)；

弃去反应液后，每孔加入300μlpbst洗涤液，洗涤3次，每次1min；

将hrp标记的亲和素用含1％bsa的pbst溶液按照1:400稀释，向每个反应孔中加入100μl，于37℃孵育30min；

弃去反应液，每孔加入300μlpbst洗涤液，洗涤3次，每次1min；

每孔加入100μltmb底物，于37℃显色8min，之后每孔加入50μl终止液终止显色反应，读取450nm处吸光度值。

结果判定应在30min内进行，读取阴性质控450nm处吸光度值odnc，待检血清450nm处吸光度值odsample，计算抑制率pi％＝(1-odsample/odnc)％，对于猪血清样品，当待测样品pi％≥52％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜52％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立；对于小鼠血清样品，当待测样品pi％≥39％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜39％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立；对于人血清样品，当待测样品pi％≥41.12％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜41.12％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。

2)cut-off值的测定。

用本发明试剂盒分别测定270份健康猪血清、30份健康小鼠血清、100份健康人血清和47份旋毛虫病病人血清，读取阴性质控450nm处吸光度值odnc，待检血清450nm处吸光度值odsample，计算抑制率pi％＝(1-odsample/odnc)％。对于猪血清样品，将270份健康猪血清的pi％进行统计学分析，计算平均值和标准差，以平均值加2倍标准差为cut-off值，经计算得到cut-off值为52％，如图2中a所示，当待测样品pi％≥52％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜52％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。对于小鼠血清样品，将30份健康小鼠血清的pi％进行统计学分析，计算平均值和标准差，以平均值加2倍标准差为cut-off值，经计算得到cut-off值为39％，如图2中的b所示，当待测样品pi％≥39％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜39％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。对于人血清样品，将100份健康人血清和47份旋毛虫病人血清的pi％进行roc统计学分析，如图2中的c和d所示，经计算得到该试纸条的cut-off值为41.12％。当待测样品pi％≥41.12％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜41.12％时，则判定为阴性；同时odnc≥1.00，则判定为实验成立。

3)考察旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒的灵敏性、特异性以及稳定性

①灵敏性试验：

对于猪血清样本：用旋毛虫竞争elisa试剂盒检测不同感染条件下的猪血清中抗旋毛虫抗体，将检测结果和商品化的酶联免疫吸附抗体检测方法eselisa(qiagen,swine)进行对比。确保检测中应用的试剂盒来自同一批次。商品化的eselisa试剂盒为同一批次产品，检测步骤和结果判定标准按照试剂盒说明书进行。

本发明竞争elisa试剂盒与eselisa分别检测50份猪感染旋毛虫血清，结果显示eselisa检测48份血清为阳性，竞争elisa检测47份血清为阳性，其中eselisa2份血清为阴性，旋毛虫也为阴性，而1份血清eselisa为阳性，竞争elisa为阴性。60份阴性血清，eselisa全为阴性，竞争elisa60份为阴性。说明两种方法在检测动物旋毛虫病方面一致率和吻合度较强；竞争elisa试剂盒和eselisa在敏感性和特异性上的差异均无统计学意义。说明本发明的敏感性和特异性与oie推荐的猪旋毛虫病抗体检测方法(eselisa)相当，同时又具备多宿主通用型、质量可控等eselisa不具备的优点，具有广泛推广空间，极具市场前景。

对于人血清样本：用旋毛虫竞争elisa试剂盒检测47份来自云南的旋毛虫病人血清和100份健康人血清，将检测结果和商品化的酶联免疫吸附抗体检测方法eselisa(abcam,human)进行对比。确保检测中应用的试剂盒来自同一批次。商品化的eselisa试剂盒为同一批次产品，检测步骤和结果判定标准按照试剂盒说明书进行。

本发明竞争elisa试剂盒与eselisa分别检测47份人感染旋毛虫血清，结果显示eselisa检测47份血清为阳性，竞争elisa检测47份血清为阳性。100份阴性血清，eselisa全为阴性，竞争elisa100份为阴性。经roc分析，所建立的竞争elisa方法阈值为41.12％时，对于这些样本的特异性为100％，灵敏度为100％，auc为1.000，说明竞争elisa能够很好地区分人旋毛虫阴/阳性血清。eselisa和竞争elisa在检测人旋毛虫病方面一致率和吻合度较强，在敏感性和特异性上的差异均无统计学意义。说明本发明的敏感性和特异性与oie推荐的人旋毛虫病抗体检测方法(eselisa)相当，同时又具备多宿主通用型、质量可控等eselisa不具备的优点，具有广泛推广空间，极具市场前景。

②旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒的特异性：

对于猪血清样本，检测其他寄生虫感染的猪阳性血清和常规疫苗免疫的猪血清。有猪亚洲带绦虫、弓形虫、猪带绦虫和华支睾吸虫阳性猪血清，以及6头份规模化养殖场内经过常规疫苗免疫(包括伪狂犬疫苗、兰耳疫苗、圆环病毒疫苗、猪瘟疫苗和口蹄疫疫苗)的猪血清(6头猪的旋毛虫集样消化法检测结果为阴性)，对其进行特异性分析。本发明中旋毛虫竞争elisa试剂盒检测以上猪血清均为阴性，但商品化的eselisa试剂盒检测结果显示与华支睾吸虫猪阳性血清有交叉反应，即本发明中旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒不与其他寄生虫发生交叉反应，且比oie推荐的eselisa具有更高的特异性。

对于人血清样本，检测其他寄生虫感染的人阳性血清和肠道病毒感染的人血清。实验结果如图4所示，有2份人脑囊虫虫和8份华支睾吸虫阳性人血清，3份手足口病人血清，3份柯萨奇病毒感染的病人血清和20份其他肠道病毒感染的病人血清。本发明中旋毛虫竞争elisa试剂盒检测以上人血清均为阴性，但商品化的eselisa试剂盒(abcam)检测结果显示与2份华支睾吸虫人阳性血清有交叉反应，且经western-bolt鉴定，发生交叉反应的2份人血清均与es抗原有交叉反应条带。即本发明中旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒不与其他寄生虫和肠道病毒感染样本发生交叉反应，且比oie推荐的eselisa具有更高的特异性。

③猪感染不同剂量及时间点旋毛虫抗体水平的检测：

对感染旋毛虫后不同时间点猪血清的抗旋毛虫抗体检测，实验结果如图3所示，在中度感染时(600条/只)消化法检测为每克膈肌幼虫数8.7-11.6lpg,商品化的eselisa试剂盒(qiagen,swine)30天可以检测到旋毛虫感染，而竞争elisa试剂盒可以在35天检测到旋毛虫感染。在轻度感染时(400条/只)消化法检测为每克膈肌幼虫数0.96-0.45lpg,商品化的eselisa试剂盒(qiagen,swine)45天可以检测到旋毛虫感染，而竞争elisa试剂盒可以在45-60天检测到旋毛虫感染。在低量感染时(200条/只)消化法检测为每克膈肌幼虫数0.07-0.44lpg,eselisa60-90天可以检测到旋毛虫感染，而竞争elisa试剂盒也可以在60-90天检测到旋毛虫感染。与eselisa相比，基于ts-wn10重组抗原和ts-wn10-1h9单克隆抗体的竞争elisa检测灵敏度与商品化的eselisa试剂盒相当。

④小鼠感染不同种/基因型的旋毛虫的抗体检测：

采用17个分离株的旋毛虫感染小鼠，每只小鼠感染200条肌幼虫，感染第60天检测血清抗体。17个分离株包括：t1(iss534)、t1(iss4)、t1(iss533)、t2(iss70)、t3(iss235)、t4(iss141)、t4(iss13)、t4(iss470)、t5(iss35)、t5(iss415)、t6(iss34)、t7(iss37)、t8(iss124)、t9(iss408)、t10(iss572)、t11(iss1029)和t12(iss1826)。实验结果如图5中的a所示，表明经竞争elisa试剂盒检测，t1(iss534)、t1(iss4)、t1(iss33)、t7(iss37)和t8(iss124)为强阳性，t6(iss34)和t12(iss1826)也是阳性，但接近临界值39％。同时，经过与17个分离株粗虫体蛋白的western-blot鉴定，结果如图5中的b所示，单克隆抗体ts-wn10-1h9可以与以上阳性血清对应的分离株粗虫体蛋白发生特异性的反应。因此，基于ts-wn10重组抗原和ts-wn10-1h9单克隆抗体的竞争elisa可以应用于多个种/基因型旋毛虫感染的抗体检测，具有广泛推广空间，极具市场前景。