一种CSFV的IFA中和抗体检测方法与流程

一种csfv的ifa中和抗体检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种csfv的ifa中和抗体检测方法。


背景技术：

2.猪瘟(classical swine fever)，早期称猪霍乱(hog cholera,hc)，是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus,csfv)引起猪的一种急性、热性和高度接触性传染病，其特征为高热稽留和全身广泛性出血。猪瘟的发病率和死亡率都很高，主要分为急性型、亚急性型、慢性型、非典型猪瘟或温和型猪瘟，给全世界养猪产业造成巨大的经济损失。其在世界各地均有不同程度的流行，我国将此病列为一类动物疾病，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须报告的动物疫病。猪瘟病毒(csfv)属于黄病毒科(flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)，是rna病毒，具有感染性。在自然条件下，猪还可能感染与猪瘟病毒(csfv)同属的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，bvdv)和绵羊边界病病毒(borderdisease virus，bdv)，但是csfv却只对猪有致病性。虽然csfv对其他动物没有致病性，但是它可以在小鼠、牛和山羊等动物体内进行增殖。目前，猪瘟防治的主要措施是疫苗免疫，我国学者周泰冲等研究的c株猪瘟兔化弱毒疫苗、法国的thiverval株弱毒疫苗和日本的细胞弱毒疫苗等弱毒疫苗成功问世，并在猪瘟防治中起着重要作用。现在我国使用的疫苗主要有猪瘟兔化弱毒疫苗，脾淋苗及牛睾丸疫苗。这些疫苗已经能够很好的控制猪瘟的流行，但是由于疫苗的长期使用，致使猪瘟在流行上发生了较大的改变，主要变为非典型性猪瘟和温和性猪瘟。这造成了猪瘟诊断及防治的困难，也使得猪瘟一直流行，困扰着中国养猪业。基于此，建立快速准确的诊断方法和研究其感染机制对csfv的综合防控具有重要意义。
3.因此，提供一种csfv的ifa中和抗体检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种csfv的ifa(间接免疫荧光)中和抗体检测方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种csfv的ifa中和抗体检测方法，具体步骤如下：
7.(1)将pk15细胞消化离心后制备成含1.0
×
105cells/ml的细胞悬液，每孔100μl铺到96孔板上，置于37℃5％co2培养箱中培养12h，待细胞完全贴壁，将等体积的csfv病毒液和临床血清37℃孵育1h，然后接种到96孔板内的pk15细胞上，培养48h待细胞长满后取出96孔板；同时设立正常接毒细胞对照孔；
8.(2)用预冷的无水乙醇固定，加入预冷的无水乙醇，每孔50μl，
‑
20℃放置30min；弃去无水乙醇，pbst清洗，拍干；
9.(3)加入5％的脱脂奶粉进行封闭，每孔200μl，37℃温箱放置2h；pbst清洗，拍干；
10.(4)加入csfv阳性抗体，用pbs按照1:400稀释，每孔加入50μl，37℃温箱放置1h；pbst清洗，拍干；
11.(5)加入羊抗猪igg
‑
fitc，用pbs按照1:100稀释，每孔加入50μl，37℃温箱放置1h，pbst清洗；最后每孔加入pbst 50μl，在倒置荧光显微镜进行观察。
12.进一步，所述csfv病毒液的制备方法如下：将临床采集的病料组织进行研磨，按照1mg组织样品加入1ml pbs溶解，反复冻融3次，取上清；12000rpm离心5min，用0.22μm滤器过滤，获得csfv病毒液。
13.进一步，所述临床血清的制备方法如下：将采集的血液进行离心，收集血清，用于后期临床血清检测。
14.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种csfv的ifa中和抗体检测方法，细胞反应板可提前制备，可在
‑
20℃长期保存；反应结果可用荧光显微镜进行观察。ifa检测具有特异性强、敏感性高、操作简单的特点；且ifa方法利用活病毒接种，使用的是全病毒，抗原结构更加完整，结果更具有准确性和代表性。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
16.图1附图为本发明pcr扩增结果；
17.其中，m，dl2000；1，csfv扩增产物；
18.图2附图为本发明ifa检测csfv的结果；
19.其中，a为中和抗体试验，b为正常接毒细胞对照。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.采集可疑感染猪瘟病毒血液样品和病料组织，将采集的血液进行离心，收集血清，用于后期临床血清检测。病料组织进行研磨，检测csfv病毒并分离病毒。细胞株为pk15细胞，csfv阳性血清由实验室保存。
22.实施例1 csfv病毒分离及鉴定
23.将疑似csfv病毒的病料组织(淋巴、肝脏、脾脏、肺脏)用pbs冲洗几次之后，按照1mg组织样品加入1ml pbs溶解，反复冻融3次，取上清，然后12000rpm离心5min，用0.22μm滤器过滤，获得csfv病毒液。使用dna提取试剂盒，提取csfv病毒的rna，然后把rna反转录为cdna。利用dnaman软件设计猪瘟病毒目的基因引物，扩增片段为531bp，具体引物序列如下：
24.csfv
‑
f：5
’‑
cggctagcctgcaaggaagattac
‑3’
；seq id no.1；
25.csfv
‑
r：5
’‑
tcatagatcttcattttccactgtggtgg
‑3’
；seq id no.2。
26.利用设计好的引物，以上述提取的cdna为模板进行pcr扩增，反应体系如下：模板1μl，csfv
‑
f 0.5μl，csfv
‑
r 0.5μl，ex taq酶12.5μl，双蒸水10.5μl。反应条件为：94℃预变
性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；之后72℃延伸10min，结束后4℃保存。并进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。
27.图1结果显示，目的片段大小约为531bp，测序结果与预期结果一致；说明病料中含有csfv。
28.实施例2临床抗体检测方法的建立
29.将pk15细胞消化离心后制备成含1.0
×
105cells/ml的细胞悬液，每孔100μl铺到96孔板上，置于37℃5％co2培养箱中培养12h，待细胞完全贴壁，将等体积的csfv病毒液(50μl)和临床血清37℃孵育1h，然后接种到96孔板内的pk15细胞上，培养48h待细胞长满后取出96孔板；同时设立正常接毒细胞对照孔；用预冷的无水乙醇固定，加入预冷的无水乙醇，每孔50μl，
‑
20℃放置30min。然后取出，弃去无水乙醇，pbst清洗5遍，拍干，加入5％的脱脂奶粉进行封闭，每孔200μl，37℃温箱放置2h。pbst清洗5遍，拍干，加入csfv阳性抗体(按照idexx试剂盒检测方法，临床分离获得的csfv阳性抗体)，用pbs按照1:400稀释，每孔加入50μl，37℃温箱放置1h。pbst清洗5遍，拍干，加入羊抗猪igg
‑
fitc，用pbs按照1:100稀释，每孔加入50μl，37℃温箱放置1h，pbst清洗5遍，最后每孔加入pbst 50μl，在倒置荧光显微镜进行观察。
30.ifa结果判定：csfv未被血清中和而感染的细胞核或胞浆有特异性绿色荧光，即为阴性(如图2b)，而被中和未感染的没有特异性绿色荧光，即为阳性(如图2a)。
31.实施例3 ifa反应条件
32.1)csfv tcid
50
测定
33.(1)将pk15细胞悬液铺到96孔板上，每孔100μl，使细胞量达到2
‑3×
105个/ml，培养12h，直至细胞完全贴壁；
34.(2)在青霉素瓶或离心管中将csfv病毒液作连续10倍的稀释，从10
‑1‑
10
‑
10
；
35.(3)将稀释好的病毒接种到细胞长成单层的96孔板上，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μl；
36.(4)剩下两纵排不接毒，设正常细胞对照(每孔100μl维持液，维持液为含2％胎牛血清的dmem培养基)；
37.(5)培养48h待细胞长满后取出固定，置于
‑
20℃备用；
38.(6)利用上述建立的ifa抗体检测方法进行检测，观察记录是否发生病变(cpe)的孔数；
39.(7)tcid
50
的计算，按reed
‑
muench两氏法计算。
40.表1 tcid
50
测定结果统计
41.42.按reed
‑
muench两氏法计算tcid
50
，计算方法如下:
43.距离比＝(高于50％病变率的百分数－50％)/(高于50％病变率的百分数－低于50％病变率的百分数)＝(70
‑
50)/(70
‑
18.2)＝0.38
44.lg tcid
50
＝距离比
×
稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝0.38
×
(
‑
1)+(
‑
4)＝
‑
4.38。
45.根据上述数据可得tcid
50
＝10
‑
4.38
/0.1ml＝10
‑
5.38
/ml
46.含义：将该病毒稀释10
4.38
接种100μl可使50％的细胞发生病变。
47.2)病毒接种量和固定时间
48.分别用1000个tcid
50
、100个tcid
50
、10个tcid
50
、1个tcid
50
、0.1个tcid
50
的病毒接种pk15细胞，并设置未接毒对照。利用ifa检测方法分别以阳性和阴性血清作为一抗进行检测，观察结果确定最佳病毒接种量。将csfv病毒(最佳病毒接种量)接种到长至60％
‑
70％左右的pk15细胞瓶内，待细胞长满后将其分别铺到4个96孔板上，在37℃5％co2培养箱培养12、24、36、48h后，逐一取出固定。然后利用ifa检测方法分别以阳性和阴性血清作为一抗进行检测，观察结果确定固定时间。
49.结果发现，以100个tcid
50
的病毒接种pk15细胞培养48h后固定制备ifa细胞反应板最佳。
50.3)血清稀释浓度、羊抗猪igg
‑
fitc工作浓度
51.将感染csfv的猪血清分别按1：50、1:100、1:200、1:400等进行连续倍比稀释，然后分别作为一抗加入制备好的细胞反应板内，利用ifa抗体检测方法分别进行检测，观察结果确定最佳血清稀释浓度。
52.将制备好细胞反应板取出，加入1：400倍稀释的阳性和阴性血清，然后分别加入1:100、1：200、1:400、1:800等2倍稀释的羊抗猪igg
‑
fitc，观察实验结果确定最佳二抗稀释浓度。
53.结果发现，待检血清以1:50开始，可根据抗体强弱情况在此基础上进行连续2倍稀释检测抗体效价，羊抗猪igg
‑
fitc工作浓度1:100最佳，倒置荧光显微镜观察。
54.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。