一种检测灵芝多糖含量的高通量方法

本发明公开了一种检测灵芝多糖含量的高通量方法。该方法使用酶标仪，利用苯酚-硫酸法或者蒽酮-硫酸法对灵芝多糖进行高通量检测，属于生物分析技术领域。

背景技术：

灵芝多糖是灵芝中重要有效成分，由三股单糖链构成的、具有螺旋状立体构形(三级结构)的葡聚糖，其立体构型与脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)相似，是一种大分子化合物。具有降血糖、降血脂、抗血栓、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、促进血流循环、调节人体免疫功能等生物活性。由于灵芝多糖具有特有的生理活性和医用价值，且安全无毒，被广泛应用于医药、食品和化妆品行业。

目前，对灵芝多糖的含量分析主要用比色法和色谱法，也有报道，采用色谱与质谱联用分析灵芝多糖的相对分子质量、化学式及结构。上述方法都有自己的特点和不足。特别是，大多数研究者采用比色法，无论是苯酚还是蒽酮都需要使用大量的浓硫酸作为检测溶剂，并且测试样品多，需要沸水浴煮样品，准备和测试花费较长时间，测试后，产生大量酸性废液，给环境或者废弃物处理带来较大压力。

酶标仪是生物实验室中常备的设备，一般可以使用96孔板等盛装样品进行检测，并且具有温度调节的功能，能够对样品进行恒温加热。在采用普通的分光光度计检测多糖的教学和科研实验中，我们设计了新检测实验方案，使用酶标仪来测量灵芝多糖的含量，可以一次测量多个样品(由孔板上孔数量决定)，同时可以对样品进行加热，避免了在沸水浴中加热的安全隐患，实现了灵芝多糖的高通量检测。也节约了大量苯酚、蒽酮和硫酸等试剂，避免了大量酸性废液的产生。

技术实现要素：

本发明目的在于使用实验室常用仪器——酶标仪，经过实践检验，设计并提供了一种高通量检测灵芝多糖含量的方法。为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

使用酶标仪，利用苯酚-硫酸法或者蒽酮-硫酸法对灵芝多糖含量进行检测，包括以下步骤：

(1)分别将葡萄糖标准溶液和灵芝多糖样品溶液与显色试剂混合，置于96孔板中；

(2)在一定温度放置一定时间，在固定波长检测；

(3)绘制葡萄糖溶液标准曲线，计算灵芝多糖样品溶液中总糖含量。

上述步骤中，配制5个以上浓度在10-100μg/ml范围的葡萄糖标准溶液；通常葡萄糖标准溶液的浓度可以采用20、40、60、80、和100μg/ml的五个浓度点来进行检测。

上述方法中，显色试剂可以用苯酚-硫酸溶液或者蒽酮-硫酸溶液。

当显色试剂用苯酚-硫酸溶液时，采用糖溶液与5％苯酚溶液混合比例为1/1-1/2，优选为2/3。采用糖溶液与浓硫酸的体积比为1/4-1/5，优选为2/9。反应温度为25℃，显色时间为10-30分钟，优选为20分钟，检测波长为490nm。

当显色试剂用蒽酮-硫酸溶液时，糖溶液和蒽酮溶液的体积比为为1/2-1/4，优选为1/3。反应温度为100℃，显色时间为5-20分钟，优选为10分钟，检测波长为620nm。

在检测过程中，可以利用酶标仪的动力学检测功能，获得在不同时间点的吸光值来确认每个样品的最高吸光值。通过对两种显色试剂反应的动力学调查，优化试剂混合比例和温度等参数，获得了该检测方法的稳定使用条件。

本发明方法具有如下优点：1、在酶标仪上，10-100μg/ml范围内的葡萄糖标准溶液，利用苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法检测均呈良好的线性关系(r²>0.995)；2、比使用一般分光光度计检查所用时间大幅缩短，单次检测样品数达96个(由孔板上孔数量决定)，实现了高通量检测，提高了实验效率；3、减少了样品和强酸试剂——浓硫酸的使用量，降低了实验操作危险性，减少了废弃物排放，节约了实验资源。

附图说明

图1是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的葡萄糖标准曲线

图2是苯酚-硫酸法中不同苯酚溶液量对吸光度的影响

图3是苯酚-硫酸法中不同浓硫酸量对吸光度的影响

图4是苯酚-硫酸法中不同反应时间对吸光度的影响

图5是蒽酮-硫酸法中不同蒽酮试剂对吸光度的影响

图6是蒽酮-硫酸法中不同加热时间对吸光度的影响

图7是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的稳定性

具体实施方式

为了进一步说明本发明的详细情况，下面列举优选实施例，实施例中均使用市场上常见的酶标仪设备，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。

实施例1

分别移取标准葡萄糖溶液(20、40、60、80、100μg/ml)与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1：5,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度，酶标仪检测波长设置在490nm，并使用蒸馏水作为试剂空白。绘制标准曲线，见附图1，用直线回归方程拟合，获得相关参数。然后，使用该方程计算多糖样品溶液中总糖浓度，为55.59μg/ml。

实施例2

分别移取标准葡萄糖溶液(20、40、60、80、100μg/ml)与1％蒽酮浓硫酸溶液在96孔板中混合，体积比为1：3，总体积为180ul，反应温度为100℃，显色时间10min，酶标仪检测波长设置在620nm，并使用蒸馏水作为试剂空白。绘制标准曲线，见附图1，用直线回归方程拟合，获得相关参数。然后，使用该方程计算多糖样品溶液中总糖浓度，为55.27μg/ml。

实施例3

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1.25：5,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度，结果见附图2。

实施例4

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1.5：5,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度。由附图2知，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液体积比为1：1.5时最佳。

实施例5

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1.75：5,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度，结果见附图2。

实施例6

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：2：5,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度，结果见附图2。

实施例7

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1：4,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度，结果见附图3。

实施例8

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1：4.25,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度，结果见附图3。

实施例9

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1：4.5,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度。由附图3知，葡萄糖标准溶液与浓硫酸体积比为1：4.5时最佳。

实施例10

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1：4.75,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度，结果见附图3。

实施例11

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液及硫酸溶液按照1：1：5体积比混合于96孔板，总体积为180μl，反应温度为25℃，显色时间取20min，测定吸光度，结果见附图4。

实施例12

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液及硫酸溶液按照1：1：5体积比混合于96孔板，总体积为180μl，反应温度为25℃，显色时间取25min，测定吸光度，结果见附图4。

实施例13

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1：1：5,总体积为180μl，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25℃，显色时间30min，测定吸光度。由附图4知，显色时间取30min时最佳。

实施例14

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液及硫酸溶液按照1：1：5体积比混合于96孔板，总体积为180μl，反应温度为25℃，显色时间取35min，测定吸光度，结果见附图4。

实施例15

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在490nm波长条件下，葡萄糖标准溶液与5％苯酚溶液及硫酸溶液按照1：1：5体积比混合于96孔板，总体积为180μl，反应温度为25℃，显色时间取40min，测定吸光度，结果见附图4。

实施例16

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，葡萄糖标准溶液和蒽酮溶液的体积比为1：2，总体积为180ul，反应温度为100℃，显色时间10min，测定吸光度，结果见附图5。

实施例17

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，葡萄糖标准溶液和蒽酮溶液的体积比为1：2.5，总体积为180ul，反应温度为100℃，显色时间10min，测定吸光度，结果见附图5。

实施例18

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，葡萄糖标准溶液和蒽酮溶液的体积比为1：3，总体积为180ul，反应温度为100℃，显色时间10min，测定吸光度。由附图5知，葡萄糖标准溶液和蒽酮溶液的体积比为1：3时最佳。

实施例19

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，葡萄糖标准溶液和蒽酮溶液的体积比为1：3.5，总体积为180ul，反应温度为100℃，显色时间10min，测定吸光度，测定吸光度，结果见附图5。

实施例20

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，葡萄糖标准溶液和蒽酮溶液的体积比为1：4，总体积为180ul，反应温度为100℃，显色时间10min，测定吸光度，测定吸光度，结果见附图5。

实施例21

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，将葡萄糖标准溶液与蒽酮试剂体积比为1：3,混合于96孔板中，反应的总体积为180μl，反应温度为100℃，显色时间取1min,测定吸光度，结果见附图6。

实施例22

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，将葡萄糖标准溶液与蒽酮试剂体积比为1：3,混合于96孔板中，反应的总体积为180μl，反应温度为100℃，显色时间取3min,测定吸光度，结果见附图6。

实施例23

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，将葡萄糖标准溶液与蒽酮试剂体积比为1：3,混合于96孔板中，反应的总体积为180μl，反应温度为100℃，显色时间取5min,测定吸光度，结果见附图6。

实施例24

以葡萄糖标准溶液为研究对象，以吸光度为响应值，在620nm波长条件下，将葡萄糖标准溶液与蒽酮试剂体积比为1：3,混合于96孔板中，反应的总体积为180μl，反应温度为100℃，显色时间取15min,测定吸光度，结果见附图6。

实施例25

取灵芝多糖溶液于96孔板中，分别采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法进行显色反应，酶标仪进行动力学监视，每隔5min进行一次检测，测定两种方法的稳定性。结果见附图7，得出苯酚-硫酸法稳定性优于蒽酮-硫酸法。