CXCL10+CD274+CD68+细胞群在制备慢性乙型肝炎预后预测产品中的应用的制作方法

cxcl10+cd274+cd68+细胞群在制备慢性乙型肝炎预后预测产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在制备慢性乙型肝炎预后预测产品中的应用。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒感染的自然病史是复杂多变的，受宿主免疫系统和病毒之间复杂的相互作用所影响。在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis,chb)研究领域，目前仍缺乏对chb患者肝脏微环境中的免疫抑制机制、免疫细胞和基质细胞的多样性、免疫细胞和基质细胞的相互作用机制以及诱发疾病发生发展的细胞类型和分子途径等的全面理解，从而导致新型治疗方法的研发受到阻碍。目前研究的主要不足：(1)受限实验手段等的局限性，目前多采用流式细胞术等手段进行研究，只能从少量生物标记物出发，粗粒度寻找慢乙肝肝脏中的免疫细胞变化，无法精确定位慢性乙型肝炎中对于病毒控制与疾病进展起关键作用的免疫细胞亚群与生物标志物。(2)慢性乙型肝炎病毒控制以及疾病预后存在个体差异，缺乏早期预后生物标志物，对于预后差的患者实现早期预警与干预。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何为慢性乙型肝炎预后提供早期预警。
4.为解决上述技术问题，本发明提供了检测样品中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中比例的物质在制备预测慢性乙型肝炎患者预后的产品中的应用。
5.上述应用中，所述样品是肝脏取样细胞。
6.上述应用中，所述样品是人样品。
7.上述应用中，所述检测样品中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中比例，标志物为cxcl10、cd274和cd68。
8.本发明还提供一种预测慢性乙型肝炎患者预后的产品，其包含检测样品中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中比例的物质。
9.上述产品中，所述产品还含有说明书，所述所述说明书有以下记载：
10.如果所述样品中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中所占比例高于1.4％，该患者为慢性乙型肝炎预后较差患者；如果所述检测对象的肝脏采样细胞中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中所占比例低于1.4％，该患者为慢性乙型肝炎预后较好患者(乙肝表面抗原、e抗原低)。
11.上述产品中，所述产品用于流式细胞检测。
12.上述产品中，所述样品是肝脏细胞。
13.上述产品中，所述样品是人样品。
14.上述产品中，所述检测样品中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中比例，标志物为cxcl10、cd274和cd68。
15.实验结果表明，人肝脏细胞中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中所占比例与病毒控制以及慢性乙型肝炎的预后高度相关。
附图说明
16.图1为实施例1筛选鉴定慢性乙型肝炎特异物的流程图。
17.图2为实施例1中慢乙肝与健康人肝脏免疫细胞分群结果图。
18.图3为实施例1中健康人(hc)、低病毒载量慢性乙肝患者(low)、高病毒载量慢性乙肝患者(high)的不同细胞比例变化不同的细胞分群的比例变化图。
19.图4为实施例1中乙型肝炎病毒在健康人(hbv-hc)、低病毒载量慢性乙肝患者(hbv-low)、高病毒载量慢性乙肝患者(hbv-high)各个分组细胞中的蛋白表达丰度图。
20.图5为实施例1中髓系细胞分群图。
21.图6为实施例1中cd274(pdl1)在cxcl10细胞群不同分组的表达图。
22.图7为实施例1中巨噬细胞进化分析图。
23.图8是实施例1中健康人(hc)，低病毒载量慢性乙肝患者(low)、高病毒载量慢性乙肝患者(high)的cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中所占比例统计箱式图。所示数据标记最小值、第一四分位数、中位数、第三四分位数与最大值，ns代表无显著性差异，*代表显著性分析结果为p《0.05，**代表显著性分析结果为p《0.01。
具体实施方式
24.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
25.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
26.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.实施例1
28.按照图1的流程，以6名健康人、5名低乙肝病毒载量(平均病毒载量为5
×
104u/ml)慢乙肝患者、9名高乙肝病毒载量(平均病毒载量为2
×
108u/ml)慢乙肝患者的肝活检标本作为材料进行实验，具体步骤如下：
29.研磨、组织消化与单细胞建库测序
30.肝活检标本先通过剪刀剪成小块(每块约0.5mm2)进行均质化，然后肝组织采用0.3毫克/毫升的iv型胶原酶(sigma,c9891)和脱氧核糖核酸酶i(sigma,d5025)混合酶在37℃消化1小时。之后加入5毫升杜尔贝科磷酸盐缓冲液(dpbs,thermo,14190250)和5％fbs中断消化，随后解离的上层悬浮液离心5分钟。红细胞使用氯化铵-钾(ack,thermo a1049201)进行裂解，排除后续干扰。
31.细胞处理完毕，采用10x建库试剂盒(10x genomics chromium single cell v(d)j reagent kits(v1 chemistry),1000006)进行单细胞捕获建库。乙型肝炎病毒带ploya尾，因此可以被10x建库试剂盒捕获。
32.序列比对人/病毒基因组
33.为了分析乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)在不同的细胞(健康、低病毒载量、高病毒载量)中的感染状态，同时构建了人参考基因组grch38和hbv pgrna混合参考基
因组。
34.hbv参考基因组的核苷酸序列如序列表的序列1所示。如下是hbv基因注释gtf文件：
35.hbv_b_pgrna refseq exon 1 3227.+.transcript_id"hbv_brna"；gene_id"hbv_bgene"；gene_name"hbv_b"。
36.使用cellranger mkref命令生成人和hbv的混合参考基因组。然后将下机的数据进行质控、去低质量序列片段之后，采用cellranger count生成细胞-基因表达矩阵。
37.细胞聚类分群与差异表达分析
38.对于每一个样本产生的细胞-基因表达矩阵，使用cellbender去除潜在游离rna，设置如下阈值对最终数据进行过滤：每个细胞基因数不少于200，不多于6000；每个细胞umi不低于1000，线粒体基因比例不高于15％。预处理之后，使用seurat v3的findintegrationanchors和integratedata对不同样本数据进行整合，去除潜在批次效应。findneighbors和findclusters用于细胞聚类与分群，umap分析采用uwot算法。细胞差异表达分析采用mast算法，根据差异表达结果与不同细胞群的典型maker，对细胞群进行鉴定。在获得不同细胞在不同分组(健康、低病毒载量、高病毒载量)的细胞之后，采用t检验对不同分组的细胞群的比例差异进行统计检验。
39.图2是慢乙肝与健康人肝脏免疫细胞分群结果图，图3是健康人(hc)、低病毒载量慢性乙肝患者(low)、高病毒载量慢性乙肝患者(high)的不同细胞比例变化不同的细胞分群的比例变化，可以看到nk&t细胞(nk细胞与t细胞混合亚群)在慢性乙型肝炎组显著升高，免疫细胞浸润显著。
40.单细胞跟踪乙型肝炎病毒感染状态
41.通过改进的数据分析方法，可以从单细胞层面跟踪乙型肝炎病毒感染情况。图4是乙型肝炎病毒在健康人(hbv-hc)、低病毒载量慢性乙肝患者(hbv-low)、高病毒载量慢性乙肝患者(hbv-high)各个分组细胞中的表达丰度，可以看到病毒序列在高病毒载量组富集在肝细胞以及巨噬细胞。
42.进化分析
43.细胞进化分析采用velocyto run10x生成剪切与非剪切rna的比例，umap降维结果以及细胞分群结果采用原始基因表达的结果，通过seurat createdimreducobject添加到rna剪切/非剪切seurat对象中。然后使用python scvelo生成不同细胞的rna速率。通过rna速率分析可以对慢性乙肝特异的细胞群cxcl10-mo的来源进行鉴定。
44.通过基因表达分析以及进化分析，我们发现一群高表达cxcl10的细胞群，这群细胞在慢性乙型肝炎组中丰度上升，并且高表达pdl1，提示其对慢乙肝肝脏杀伤性t细胞的杀伤作用起到一定抑制作用，引起t细胞耗竭加剧，造成肝脏乙肝病毒控制能力下降，与疾病进展高度相关，具体见图5和图6。进化分析发现该群细胞来自肝巨噬细胞，具体见图7。
45.进一步比较流式细胞检测得到的健康人、低高病毒载量组、高病毒载量组中cxcl10+cd274+cd68+在所有cd68+免疫细胞中所占的比例(标志物为cxcl10、cd274和cd68)，结果见图8，发现，高病毒载量组显著高于健康对照与低病毒载量组(1.4％)，提示与病毒控制以及慢性乙型肝炎的预后高度相关：
46.如果所述检测对象的肝细胞中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞
中所占比例高于1.4％，该检测对象为慢性乙型肝炎预后较差患者；如果所述检测对象的肝细胞中cxcl10+cd274+cd68+细胞群在所有cd68+免疫细胞中所占比例低于1.4％，该检测对象为慢性乙型肝炎预后较好患者。