一种基于过氧草酸酯类化学发光体系的生物标志物联合检测方法及试剂盒与流程

本发明属于化学发光免疫分析生物标志物诊断
技术领域：
，尤其涉及一种基于过氧草酸酯类化学发光体系的生物标志物联合检测方法及试剂盒。
背景技术：
：化学发光免疫分析既具备化学发光反应的高灵敏性，又具有免疫体系的高特异性。该技术因具有分析速度快、线性范围宽、无散射光干扰、无放射性污染、仪器设备简单等优势，在临床诊断、生命分析、环境科学等领域得到了广泛应用。化学发光免疫分析技术主要用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术，是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的最为常用的免疫测定技术。化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上，或酶作用于发光底物。过氧草酸酯类化学发光系统是一类以草酸酯、过氧化氢和荧光剂以及一些增强发光效率的催化剂为主要组成的化学发光体系，属于以化学反应功能的化学发光分析方法。这种体系除了具有发光效率高、强度大、寿命长的特点外，还可以通过选择不同的荧光剂来调节发光的波长，获得不同的波长信号。基于目前应用于临床检测的化学发光免疫分析检测产品反应原理，使用同样的发光标记物导致单个反应仅能检测一项指标，不能同时在单个反应中完成多项指标的检测。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于过氧草酸酯类化学发光体系的生物标志物联合检测方法及试剂盒，该方法利用多种荧光剂标记，在一个反应中能够产生多个波长信号，以达到同时检测多个生物标志物的目的，同时该方法具有灵敏度高、结果准确、操作简易、反应时间短的特点。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种基于过氧草酸酯类化学发光体系的生物标志物联合检测方法，包括如下步骤：(1)将样品与组份1、组份2混合，充分反应；其中，所述组份1为含有标记不同荧光基团的特异性抗体溶液，所述组份2为包被特异性抗体的磁珠悬浊液；(2)利用磁场固定反复漂洗，去除未发生反应的组份1；(3)加入组份3和组份4，充分反应，检测并记录反应溶液在不同波长下的发光强度数值，计算得到样品中生物标志物的浓度值；其中，所述组份3为含有双草酸酯的溶液，所述组份4为含有过氧化氢的溶液。优选的，所述样品为含有一种或多种生物标志物的样品，所述生物标志物包括蛋白质、核酸、小分子。优选的，所述抗体为ctni、nt-probnp和d-dimer中的任意两种或三种所对应的特异性抗体。优选的，所述抗体标记的不同荧光基团为fam、cy3和cy5中的任意两种或三种。优选的，所述荧光基团fam、cy3、cy5的发射波长分别为520nm、563nm、662nm。优选的，步骤(1)所述反应条件为35℃～39℃孵育3～8min。优选的，步骤(3)所述反应条件为35℃～39℃孵育1～3min。本发明还提供了上述检测方法所使用的的试剂盒，包括组份1、组份2、组份3、组份4；其中组份1为含有标记不同荧光基团的特异性抗体溶液，组份2为包被特异性抗体的磁珠悬浊液，组份3为含有双草酸酯的溶液，组份4为含有过氧化氢的溶液。优选的，所述抗体为ctni、nt-probnp和d-dimer中的任意两种或三种所对应的特异性抗体，所述抗体标记的不同荧光基团为fam、cy3和cy5中的任意两种或三种。优选的，所述双草酸酯的溶液优选为1.0～5.0mm的双草酸酯乙腈溶液，所述过氧化氢的溶液优选为0.1～0.5mm的过氧化氢乙腈溶液。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明检测方法可利用多种荧光标记，在一个反应中能够产生多个波长信号，达到同时检测多种生物标志物的目的。(2)本发明基于过氧草酸酯类化学发光体系的生物标志物联合检测方法，属于直接发光类型，相对于较常见的吖啶酯发光体系(闪光类型，发光时间几毫秒钟)，发光时间可以持续数分钟，具有灵敏度高、结果准确、操作简易、反应时间短的特点。(3)经本发明检测方法检测血浆样品，可同时检测出ctni、nt-probnp、d-dimer，且该检测方法的最低检测限、重复性、线性范围均优于现有试剂盒。附图说明书图1为本发明所述检测方法的测定原理图；图2为ctni定标曲线图；图3为nt-probnp定标曲线图；图4为d-dimer定标曲线图；图5为本发明所述检测方法检测ctni线性范围图；图6为本发明所述检测方法检测nt-probnp线性范围图；图7为本发明所述检测方法检测d-dimer线性范围图。具体实施方式本发明提供了一种基于过氧草酸酯类化学发光体系的生物标志物联合检测方法，包括如下步骤：(1)将样品与组份1、组份2混合，充分反应；其中，所述组份1为含有标记不同荧光基团的特异性抗体溶液，所述组份2为包被特异性抗体的磁珠悬浊液；(2)利用磁场固定反复漂洗，去除未发生反应的组份1；(3)加入组份3和组份4，充分反应，检测并记录反应溶液在不同波长下的发光强度数值，计算得到样品中生物标志物的浓度值；其中，所述组份3为含有双草酸酯的溶液，所述组份4为含有过氧化氢的溶液。在本发明中，所述样品为含有一种或多种生物标志物的样品，所述生物标志物包括蛋白质、核酸、小分子。本发明所述的生物标志物是用于疾病诊断的生物标志物，且所述生物标志物均能被特异性抗体识别和结合。在本发明中，所述抗体优选为ctni、nt-probnp和d-dimer中的任意两种或三种所对应的特异性抗体；所述抗体标记的不同荧光基团优选为fam、cy3和cy5中的任意两种或三种。本发明中以ctni、nt-probnp和d-dimer为例，作为检测心血管疾病的生物标志物。在本发明中，所述荧光基团可以为fam、cy3或cy5，其发射波长分别为520nm、563nm、662nm。在本发明中，所述含有标记不同荧光基团的特异性抗体溶液可以为fam-ctniab1、cy3-nt-probnpab1、cy5-d-dimerab1，所述包被特异性抗体的磁珠悬浊液可以为mb-ctniab2、mb-nt-probnpab2、mb-d-dimerab2。本发明中ctni、nt-probnp和cy5-d-dimer对应的ab1和ab2为配对抗体。本发明对fam-ctniab1、cy3-nt-probnpab1、cy5-d-dimerab1、mb-ctniab2、mb-nt-probnpab2、mb-d-dimerab2的制备没有特殊限定，选用常规制备方法即可。本发明将特定的荧光基团对应特定的生物标志物，通过不同的荧光基团对应的不同波长原理，可同时精准快速的同时检测出ctni、nt-probnp和d-dimer。在本发明中，步骤(1)所述反应条件优选为35℃～39℃孵育3～8min，更优选为37℃孵育5min，步骤(3)所述反应条件优选为35℃～39℃孵育1～3min，更优选为37℃孵育2min。本发明设定的温度和时间可保证在最短的时间使各组份充分混合反应，达到快速检测的目的。本发明还提供了上述检测方法所使用的试剂盒，优选包括组份1、组份2、组份3、组份4；所述组份1优选为含有标记不同荧光基团的特异性抗体溶液，所述组份2优选为包被特异性抗体的磁珠悬浊液，所述组份3优选为含有双草酸酯的溶液，所述组份4优选为含有过氧化氢的溶液。本发明中所述抗体优选为ctni、nt-probnp和d-dimer中的任意两种或三种所对应的特异性抗体，所述抗体标记的不同荧光基团优选为fam、cy3和cy5中的任意两种或三种。本发明中所述组份3为含有双草酸酯的溶液，其中还含有乙腈、乙醚、甲醇、甲醛等有机溶剂，所述组份4为含有过氧化氢的溶液，其中还含有水、乙腈、乙醇、甲醇等。在本发明中，所述试剂盒中含有标记不同荧光基团的特异性抗体溶液优选包含fam-ctniab1、cy3-nt-probnpab1、cy5-d-dimerab1，所述试剂盒中包被特异性抗体的磁珠悬浊液优选包含mb-ctniab2、mb-nt-probnpab2、mb-d-dimerab2，所述试剂盒中组分3为含有双草酸酯乙腈溶液，所述试剂盒组分4为含有过氧化氢乙腈溶液；所述双草酸酯乙腈溶液浓度优选为1.0～5.0mm，所述过氧化氢乙腈溶液优选为0.1～0.5mm。本发明中ctni、nt-probnp和d-dimer对应的ab1和ab2为配对抗体。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1一种检测ctni、nt-probnp和d-dimer的生物标志物联合检测试剂盒，包括组份1、组份2、组份3和组份4。各组份的制备方法如下：1、组份1的制备1)fam-ctniab1的标记方法①合成5’端修饰dibo基团和3’端修饰fam的单链5’-dibo-dna-fam-3’；②使用thermofisher公司的siteclicktmantibodyazidomodificationkit对ctniab1进行处理，使该抗体fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；③将5’-dibo-dna-fam-3’与重氮化后的ctniab1(n3-ctniab1)进行反应偶联生成fam-ctniab1；④反应结束后，使用分子筛纯化得到fam-ctniab1。2)cy3-nt-probnpab1的标记方法①合成5’端修饰dibo基团和3’端修饰cy3的单链5’-dibo-dna-cy3-3’；②使用thermofisher公司的siteclicktmantibodyazidomodificationkit对nt-probnpab1进行处理，使该抗体fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；③将5’-dibo-dna-cy3-3’与重氮化后的nt-probnpab1(n3-nt-probnpab1)进行反应偶联生成cy3-nt-probnpab1；④反应结束后，使用分子筛纯化得到cy3-nt-probnpab1。3)cy5-d-dimerab1的标记方法①合成5’端修饰dibo基团和3’端修饰cy5的单链5’-dibo-dna-cy5-3’；②使用thermofisher公司的siteclicktmantibodyazidomodificationkit对d-dimerab1进行处理，使该抗体fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；③将5’-dibo-dna-cy5-3’与重氮化后的d-dimerab1(n3-d-dimerab1)进行反应偶联生成cy5-d-dimerab1；④反应结束后，使用分子筛纯化得到cy5-d-dimerab1。4)组份1的配制方法：组份1的配制方法按下表配方进行配制：成分浓度磷酸盐缓冲液，ph7.420mmfam-ctniab1溶液8μg/mlcy3-nt-probnpab1溶液8μg/mlcy5-d-dimerab1溶液2μg/ml甘油30％proclin3000.1％按上述方法配制后保存在2～8℃条件下保存备用。2、组份2的制备方法1)mb-ctniab2的偶联方法①取200μl的羧基磁珠(thermofisherdynabeadstmm-270carboxylicacid)加入1个2ml的离心管中，磁分离3min，然后去上清；②向离心管中加入2倍体积的sds清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；③向离心管中同时加入100μl的50mg/mledc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，和100μl的50mg/mlnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)震荡混匀；④将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02mmes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)清洗两次，去上清；⑤在离心管中加入120ug的ctniab2抗体，300μl的0.02mmes，偶联2-3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30ml的磁珠保存液中保存待用。2)mb-nt-probnpab2的偶联方法①取200μl的羧基磁珠(thermofisherdynabeadstmm-270carboxylicacid)加入1个2ml的离心管中，磁分离3min，然后去上清；②向离心管中加入2倍体积的sds清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；③向离心管中同时加入100μl的50mg/mledc，和100μl的50mg/mlnhs震荡混匀；④将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02mmes清洗两次，去上清；⑤在离心管中加入80ug的nt-probnpab2抗体，300μl的0.02mmes，偶联2-3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30ml的磁珠保存液中保存待用。3)mb-d-dimerab2的偶联方法①取200μl的羧基磁珠(thermofisherdynabeadstmm-270carboxylicacid)加入1个2ml的离心管中，磁分离3min，然后去上清；②向离心管中加入2倍体积的sds清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；③向离心管中同时加入100μl的50mg/mledc，和100μl的50mg/mlnhs震荡混匀；④将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02mmes清洗两次，去上清；⑤在离心管中加入80ug的d-dimerab2抗体，300μl的0.02mmes，偶联2-3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30ml的磁珠保存液中保存待用。4)组份2的配制方法：组份2的配制方法按下表配方进行配制：成分浓度磷酸盐缓冲液，ph7.420mmmb-ctniab22％mb-nt-probnpab22％mb-d-dimerab21％小牛血清30％甘油10％吐温200.05％proclin3000.1％按上述方法配制后保存在2～8℃条件下保存备用。3、组份3的制备方法取双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯溶于乙腈，浓度为1.0～5.0mm，配制好后，置于2～8℃保存待用。4、组份4的制备方法取过氧化氢溶于乙腈，浓度为0.1～0.5mm，配制好后，置于2～8℃保存待用。实施例21、样品检测1)从湖南省人民医院检验科获取20例血浆样本，该血浆样本是经静脉抽血至edta(乙二胺四乙酸)抗凝管中，经过离心获得的上层透明液体，不含血细胞。2)采用高敏肌钙蛋白-i测定试剂盒、脑利钠肽前体检测试剂盒、d-二聚体(d-dimer)测定试剂盒分别检测上述20例样本，检测步骤根据各试剂盒说明书操作即可。检测结果见表4。高敏肌钙蛋白-i测定试剂盒采用化学发光微粒子免疫检测法，生产厂家：雅培，国械注进20172400287，批号17517ui01，效期至2020-12-24；脑利钠肽前体检测试剂盒采用电化学发光法，生产厂家：罗氏，国械注进20152402658，批号46625403，效期至2021-08-31；d-二聚体(d-dimer)测定试剂盒采用化学发光法，生产厂家：新产业，粤械注准20162400315，批号20200401，效期至2021-04-30。3)采用实施例1配制的组份1、组份2、组份3、组份4按照如下步骤检测上述20例血浆样品：①将10μl样品与50μl组份1、50μl组份2混合均匀，使目标抗原能够与配对抗体充分发生“夹心”反应，37℃孵育5min；②加入pbst(磷酸缓冲溶液，含有0.1mpbs，0.1％tween-20，ph7.4)洗液200μl，利用磁场固定反复清洗3次，去除未发生反应的组份1；③加入50μl组份3和50μl组份4，混合均匀，37℃孵育1～3min，使组份3中的双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯(阿拉丁，b121486)与组份4中的过氧化氢发生反应后生成高能量的双氧基环状中间体二氧杂环丁二酮，该中间体迅速分解后将能力传递给不同荧光基团使之处于激发状态，不同荧光基团从激发单重态回到基态，并释放不同波长(fam、cy3、cy5的发射波长分别为520nm、563nm、662nm)的光子。最后使用spark10m多功能酶标仪平台化学发光模块(瑞士tecan)进行读数分别记录不同波长下的发光强度数值，采用步骤4)中的定标曲线分别计算得到ctni、nt-probnp、d-dimer的浓度值。检测结果见表5。4)定标曲线的制备①ctni定标曲线制备取不同浓度的ctni校准品进行测试定标，其定标数据如下表1，得到的ctni定标曲线见图2，结果显示，ctni定标方程为y＝61086x–31450，r2＝0.9989。表1ctni校准品定标数据校准品浓度(ng/ml)rluc00503c10.206734c20.6723286.8c36.23286194c438.302251493.2c553.063257900.8②nt-probnp定标曲线制备取不同浓度的nt-probnp校准品进行测试定标，其定标数据如下表2，得到nt-probnp定标曲线见图3，结果显示，nt-probnp定标方程为y＝96.888x–34871，r2＝0.9995。表2nt-probnp校准品定标数据校准品浓度(pg/ml)rluc00609c1201.144268c2402.289525c34022.87291570c49696.97900162c540228.73870064③d-dimer定标曲线制备取不同浓度的d-dimer校准品进行测试定标，其定标数据如下表3，得到d-dimer定标曲线见图4，结果显示，d-dimer定标方程为y＝190902x–100793，相关系数r2＝0.9933。表3d-dimer定标数据校准品浓度(μg/ml)rluc002584c10.3044823c20.7595670c37.45947690c414.912818047c529.815644860表4市售试剂盒分别对20血浆样品的检测结果表5本发明方法同时对20例血浆样品的检测结果*：代表绝对偏差由表4和5结果显示，本发明检测方法与目前市售的雅培、罗氏、新产业试剂盒检测临床样本结果相比，差异较小，且能够同时在一个反应杯中完成三项指标的检测，且互相不干扰。2、基于过氧草酸酯类化学发光体系的生物标志物联合检测方法的性能测试①最低检测限用零浓度校准品或生理盐水作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的rlu值(相对发光值)，计算其平均值和标准差(sd)，得出根据零浓度校准品和相邻校准品的浓度-化学发光(rlu)值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将所对应的rlu值带入方程式中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。采用实施例1配制的组份1、组份2、组份3、组份4以及实施例2步骤3)的检测方法，获得该检测方法的最低检测限，结果见表6。由表6结果显示，ctni的最低检测限为0.0051ng/ml，nt-probnp的最低检测限为5.56pg/ml，d-dimer的最低检测限为0.062μg/ml，与雅培高敏肌钙蛋白i检测试剂盒(最低检测限要求为不大于0.01ng/ml)、罗氏脑利钠肽前体检测试剂盒(最低检测限要求为不大于15pg/ml)，新产业d-二聚体检测试剂盒(最低检测限要求为不大于0.25μg/ml)检测结果相比，本发明检测方法符合检测要求。表6最低检测限试验检测结果②重复性用高、低2个不同浓度的血浆样本重复测定20次，计算20次测定结果的平均值和标准差sd，根据公式进行计算变异系数(cv)，采用实施例1配制的组份1、组份2、组份3、组份4以及实施例2步骤3)的检测方法，获得该检测方法的重复性结果见表7。由表7结果显示，高低样本测试后cv值均小于10％，与市售检测试剂盒(cv值应小于等于10％)相比，满足检测水平。表7重复性试验检测结果③线性范围将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。采用实施例1配制的组份1、组份2、组份3、组份4以及实施例2步骤3)的检测方法，对每一浓度的样本重复检测3次，计算其平均值。将结果平均值和理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r。结果见表8～10和图5～7。由表8～10和图5～7结果显示，ctni线性范围为0.00～66.11ng/ml，r＝0.9994，nt-probnp线性范围为11.54～36208.75pg/ml，r＝0.9996，d-dimer线性范围为0.2～24.57μg/ml，r＝0.9965，与雅培高敏肌钙蛋白i检测试剂盒(线性范围0.01ng/ml～50ng/ml，r≥0.990)、罗氏脑利钠肽前体检测试剂盒(线性范围15pg/ml～35000pg/ml，r≥0.9900)、新产业d-二聚体检测试剂盒(线性范围0.25μg/ml(feu)～20μg/ml(feu)，r≥0.9900)检测结果相比，本发明检测方法符合要求。表8ctni线性范围：表9nt-probnp线性范围表10d-dimer线性范围理论浓度(μg/ml)稀释比例测试均值(μg/ml)24.571.024.5719.650.820.0914.740.615.3012.280.514.139.830.411.534.910.25.790.160.0070.200.000.00.00以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12