一种分离测定沙库巴曲钙盐及其异构体的方法与流程

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种分离测定沙库巴曲钙盐及其异构体的方法。
背景技术：
：沙库巴曲钙盐为诺华开发的nep抑制剂前体药物，也是实验性药物。其作用机制可阻断威胁负责降低血压的2种多肽，主要用于开发成治疗高血压、心衰的药物。沙库巴曲钙与缬沙坦结合成的lcz696为首个2型血管紧张素受体(atⅱ)和脑啡肽酶双重抑制剂，临床疗效显著，并于2015年7月获fda批准上市，沙库巴曲钙盐作为lcz696片分子结构中的一个结构片段，也可作为一个单独的药物来看待，因此，对其有关物质建立控制指标，也是质量标准中非常关键的控制项目。沙库巴曲钙盐化学名称为：(2r,4s)-5-联苯-4-基-4-(3-羧基丙酰基氨基)-2-甲基-戊酸乙酯钙盐，化学结构式如式(a)所示。本品具有2个手性中心，故具有1个对映异构体，简称为杂质ahua，2个非对映异构体，简称为杂质ahub、杂质ahuc，其结构式分别如式(b)、(c)、(d)所示。对于异构体的分离检测，特别是对映异构体，一般采用常规手性柱，利用正向色谱法对其进行分离检测，这种检测方法形成的基线较差，峰形不好，很难达到检测要求。为了准确地控制沙库巴曲钙的质量，有必要寻找一种能将沙库巴曲钙与其异构体有效分离的hplc测定方法。这对实现沙库巴曲钙与其异构体的分离在沙库巴曲钙合成和制剂的质量控制中具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种分离测定沙库巴曲钙盐及其异构体的方法，其操作简单、方便，可有效实现沙库巴曲钙盐及其异构体、异构体与异构体之间的分离和测定，从而实现控制沙库巴曲钙盐及其产品质量的目的。本发明的技术方案是：一种分离测定沙库巴曲钙盐及其异构体的方法，包括以下步骤：1)制备试样溶液取沙库巴曲钙盐，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1-10mg/ml的试样溶液；2)制备对照溶液取步骤1)得到的试样溶液，加稀释剂稀释50-1000倍，得到对照溶液；3)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)的试样溶液、步骤2)的对照溶液，进样量为5μl-100μl，采用流动相a和流动相b作为流动相进行梯度洗脱，流动相的流速为0.4-0.8ml/min，利用200nm至280nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中异构体的分离测定，其中，高效液相色谱仪采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱或者纤维素衍生物反相涂敷型手性色谱柱，所述流动相a为体积浓度是0.0001-1.0％的缓冲溶液，流动相b为乙腈-甲醇混合液，乙腈、甲醇的体积比为75-85：25-15，100体积份的流动相b中添加有0-1体积份的磷酸，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为65％-75％，流动相b的体积百分数为35％-25％；0分钟至50分钟，流动相a的体积百分数线性减少至55％-45％，流动相b的体积分数线性增加至45％-55％；50分钟至50.1分钟，流动相a的体积分数线性增加至65％-75％，流动相b的体积分数线性减少至35％-25％；50.1分钟至60分钟，流动相a的体积分数为65％-75％，流动相b为35％-25％。具体的，步骤1)、步骤2)所述稀释剂，为甲醇和水的混合溶液，甲醇和水的体积比为75-95：25-5。优选的，甲醇和水的体积比为80：20。优选的，步骤3)所述缓冲溶液的体积浓度为0.001-0.2％。具体的，所述缓冲溶液为磷酸溶液和/或磷酸盐溶液，所述磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵中的任一种或几种混合。具体的，步骤3)所述多糖衍生物为直链淀粉；所述纤维素衍生物为纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)。优选的，步骤3)流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相a的体积百分数为70％，流动相b的体积百分数为30％；0分钟至50分钟，流动相a的体积百分数线性减少至50％，流动相b的体积百分数线性增加至50％；50分钟至50.1分钟，流动相a的体积百分数线性增加至70％，流动相b的体积百分数线性减少至30％；50.1分钟至60分钟，流动相a的体积百分数为70％，流动相b的体积百分数为30％。优选的，步骤3)所述进样量为10μl，利用255nm波长检测，色谱柱的柱温为15-40℃。优选的，色谱柱的柱温为30℃。采用上述技术方案具有以下有益效果：1、本发明分离测定方法采用高效液相色谱法，以多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱或纤维素衍生物反相涂敷型手性色谱柱作为色谱柱，以缓冲溶液为流动相a，乙腈-甲醇混合液为流动相b，可以有效分离测定沙库巴曲钙盐及其异构体，异构体与异构体，且主峰与异构体杂质峰的分离度及异构体杂质间分离度均符合要求(主峰与异构体杂质峰分离度为3.17，相邻异构体杂质间分离度为1.84)，专属性强。2、本发明分离测定方法采用加校正因子的自身对照法计算试品中各异构体作为杂质的含量，准确度高，各异构体的最小相对检测限为0.001％，表明含量大于0.001％的异构体均能被检出，是一种精度较高的分离测定方法。3、本发明分离测定方法使用的流动相a及流动相b配制简单、方便，所用试剂均为常见试剂，经济实惠。选用水与甲醇的混合液作为稀释剂溶解样品，可避免样品在流动相中析出；采用梯度洗脱方式调整流动相a、流动相b的体积比，确保能够使沙库巴曲钙盐与异构体之间得到有效分离；配合流动相a，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效。本品及各杂质的理论板数大于15000，各已知杂质峰的拖尾因子均在0.95～1.05之间。若流动相a、流动相b的体积比不以梯度调整，或流动相b乙腈、甲醇组分比例不为75-85：25-15，则会导致主峰与异构体杂质峰分离度差甚至无法分离。本发明分离测定方法有效解决了沙库巴曲钙盐及其异构体难分离的问题，可以准确测定沙库巴曲钙盐及其异构体杂质的含量，从而保证了沙库巴曲钙盐及其制剂的质量可控。下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。附图说明图1为实施例1中甲醇-水混合溶液的液相色谱图；图2为实施例1中混合对照溶液的液相色谱图；图3为实施例2中试样溶液的液相色谱图；图4为实施例2中对照溶液的液相色谱图。具体实施方式仪器与条件高效液相色谱仪选用安捷伦液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以chiralceloj-rh柱(5μm，150×4.6mm)为色谱柱。紫外检测器波长：255nm。流动相：以体积浓度为0.01％的磷酸溶液为流动相a，以乙腈-甲醇-磷酸(体积比为800：200：1)为流动相b。梯度洗脱方式：0分钟，流动相a的体积百分数为70％，流动相b的体积百分数为30％；0分钟至50分钟，流动相a的体积百分数线性减少至50％，流动相b的体积百分数线性增加至50％；50分钟至50.1分钟，流动相a的体积百分数线性增加至70％，流动相b的体积百分数线性减少至30％；50.1分钟至60分钟，流动相a的体积百分数为70％，流动相b的体积百分数为30％。柱温为35℃，流速：0.6ml/min。进样体积为10μl。实施例1分别取杂质ahua、杂质ahub、杂质ahuc各25mg(ahua、ahub、ahuc的纯度均在99％以上)，精密称量，置于50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液；取沙库巴曲钙盐25mg，精密称定，置于50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液0.1ml，加甲醇-水(体积比为80：20)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液，混合对照溶的溶质中，沙库巴曲钙浓度为0.5mg/ml，各已知杂质浓度均为1μg/ml。分别取甲醇-水(体积比为80：20)、混合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果如图1、图2所示。图1表明，甲醇-水的混合液及色谱系统不干扰测定。图2中依次出峰的顺序是沙库巴曲钙盐、杂质ahuc、杂质ahua、杂质ahub。图2表明，本发明分离测定方法可以有效分离沙库巴曲钙盐及其异构体，可以用于沙库巴曲钙盐中异构体的测定。实施例2沙库巴曲钙盐原料药(由重庆三圣实业股份有限公司提供)的测定取沙库巴曲钙盐原料药25mg，精密称定，置于50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，作为试样溶液；精密量取试样溶液0.5ml，置于200ml量瓶，用甲醇-水(体积比为80：20)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；按实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果如图3、图4所示。采用校正因子的自身对照法计算试品中各异构体杂质的含量。检测结果如表1：表1杂质含量(wt％)ahuc0.02ahub0.1ahua0.004当前第1页12