一种温经汤对照提取物及其制备方法与流程

1.本发明涉及中成药生产技术领域，具体涉及一种温经汤对照提取物及其制备方法。


背景技术：

2.温经汤始见于宋代陈自明的《妇人大全良方》，全方由九味药组成，是一种临床常用的中药汤剂，该汤剂主要用于治疗妇科疾病，多见于月经不调、痛经及不孕等病。记载的煎法为:“当归、川芎、芍药、桂心、牡丹皮、莪术各半两，人参、甘草、牛膝各一两。右咀，每服五钱。水一盏半，煎至八分，去滓温服”。
3.按照《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)、《古代经典名方关键信息表(7首方剂)》(征求意见稿)中苓桂术甘汤剂量、制法等考证，通过考证的结果可知温经汤现代的煎法为：“取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术各20.6g，人参、牛膝、甘草(甘草)各41.3g。粉碎成粗末，每服20g，加水450毫升，煎至360毫升，去滓温服”。
4.经典名方是由多味药组成的复方，由于自身成分的复杂性和影响因素的多样性，如何客观评价经典名方中质量控制也一直是中药现代化道路上的一个难题。并且化学对照品研制困难，分离难度大，单体不稳定，相应的生产成本及技术要求高，检测成本昂贵，对于一些不易获得的化学对照品供应数量更是有限，在实际应用中有诸多限制，难以推广，而目前中国食品药品检定研究院没有经典名方的对照提取物。
5.中药对照提取物是近年来行业中提出的新概念，中药对照提取物是一类非单体成分对照物，对照提取物于单一对照品而言易制备，价格低，稳定性好，配制操作相对简单，作为标准物质可以大大减少单体对照品的使用，从而节约中药稀有资源，降低检验成本；利用对照提取物的定性作用，可以鉴别出经典名方中药材的不同的基原以及对药材的真伪性做出评价。从而能客观的评价经典名方中药物的质量控制。
6.中药对照提取物已经成为我们国家中药材对照品发展的一个潮流，对对照提取物的研究已成了一种必要性和迫切性。目前急需对温经汤对照提取物进行研究，而加水量、煎煮时间、加水倍数和冻干工艺等关键的参数影响温经汤对照提取物制备工艺。


技术实现要素：

7.本发明是基于上述问题，目的在于提供建立温经汤对照提取物及制备工艺研究，对照提取物后期用于对温经汤特征图谱的研究做对照参照，作为一种定性的作用，有效的控制中药材的质量，为温经汤复方制剂的质量控制提供技术支持。
8.本发明通过下述技术方案实现：
9.一种温经汤对照提取物的制备方法，包括以下步骤：
10.a、药材前处理：取药用当归、川芎、白芍、牡丹皮、莪术、人参、牛膝、甘草、肉桂，去泥沙、杂质、非药用部位，再经润制、切制、干燥，再将当归、莪术、甘草炮炙，得炒当归、川芎、
白芍、牡丹皮、醋莪术、人参、牛膝、炒甘草、肉桂饮片；
11.b、煎煮：按温经汤的配方称取步骤a中的各饮片，加6-8倍量水，浸泡20-40min，煎煮20-30min，煎煮2-3次，合并药液，过滤，收集滤液；
12.c、浓缩：将步骤b中的滤液在温度50
±
2℃、负压0.080mpa的真空度下，浓缩至相对密度为1.02-1.06，得浓缩液；
13.d、冷冻干燥：将步骤c中的浓缩液，先在常压下预冻，再在压力为0.0pa条件下升华干燥，再进行解析干燥后，在温度10-26℃、相对湿度40-60％环境下收粉、称重、分装于棕色西林瓶，并封口，得温经汤对照提取物冻干粉。
14.进一步地，所述步骤a中，药材前处理方法为：
15.取药用当归、川芎、白芍、牡丹皮、莪术、人参、牛膝、甘草，去泥沙、除去非药用部位，取药用肉桂，去杂质及粗皮；再将当归、川芎、白芍、人参、牛膝、甘草喷淋清水2-3次，回润1-2小时，将牡丹皮迅速洗净，将莪术略泡，用清水洗净；再将当归、白芍、牡丹皮、人参切成1-2mm薄片，将川芎、莪术、甘草切成2-4mm厚片，肉桂捣碎，牛膝切成5-10mm短段；再将当归、牡丹皮在50
±
5℃下干燥，川芎、白芍、人参、牛膝、甘草在75
±
5℃干燥至符合水分要求，再将当归、莪术、甘草炮炙成炒当归、醋莪术、炒甘草后待用。
16.进一步地，所述步骤d中，升华干燥的条件是：
17.温度-40℃，维持1h；
18.温度-30℃，维持1h；
19.温度-20℃，维持2h；
20.温度-10℃，维持3h；
21.温度0℃，维持3h。
22.进一步地，所述步骤d中，解析干燥的条件是：
23.温度10℃，维持3h，压力0.0pa；
24.温度20℃，维持2h，压力0.0pa；
25.温度30℃，维持2h，压力0.0pa；
26.温度45℃，维持22h，压力0.0pa。
27.进一步地，所述步骤a中，
28.所述炒当归的炮炙方法为：取净当归片，置炒制容器内用文火炒至黄色，取出，摊凉；
29.所述醋莪术的炮炙方法为：取净莪术，按每100kg莪术20kg米醋的比例加入醋，拌匀，煮至透心，取出，稍凉，切2-4mm厚片，干燥；
30.所述炒甘草的炮炙方法为：取净甘草片，置炒制容器内用文火炒至黄色，取出，摊凉。
31.进一步地，所述步骤b中，按温经汤的配方称取步骤a中的各饮片，一煎，加入8倍量水，浸泡30min，煎煮30min；二煎加入6倍量水，煎煮20min，合并药液，过滤，收集滤液。
32.进一步地，所述步骤b中，过滤的条件是采用200目过滤的过滤器进行过滤，再收集滤液。
33.进一步地，所述温经汤的配方为，按质量份数计：当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术各20.6份，人参、牛膝、甘草各41.3份。
34.一种根据上述的温经汤对照提取物的制备方法制得的温经汤对照提取物，所述温经汤对照提取物的冻干粉水分为5.2％-6.8％，黄色至棕黄色粉末，气微，味先苦，后甜。
35.本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
36.(1)、本发明中，以传统中药经典名方-温经汤为基准，在传统煎药方法的基础上，对提取溶媒、煎煮次数、煎煮时间、加水量进行考察后，制备出相应的温经汤对照提取物，并对其进行了特征图谱研究，可用于相应汤剂的定性鉴别。
37.(2)、本发明中，该对照提取物的制备具有重要意义：首先为中国食品药品检定研究院申报对照提取物和复方制剂的质量控制提供技术支持，具有较强的创造性；其次在响应了中药多指标整体质量控制的号召的同时，避免了前处理、处方、提取、成分指认等工序的重复发生，使实验操作更为简便，并减少了资源的消耗。可为中药经典名方汤剂的质量控制提供保障，为其国际推广奠定一定的基础。
38.(3)、本发明中，温经汤对照提取物，以整体对照物质为对照进行质量控制，实现了真正意义上的整体质量控制，使可检测的范围和数量无限大，几乎不增加检测成本，检测方法的重复性显著提高。
39.(4)、本发明中，温经汤对照提取物代表了制剂的整体内在质量，可以为后续经典名方温经汤的相关制剂提供参考依据。
附图说明
40.图1为实施例4中的温经汤的吸水率曲线。
41.图2为实施例9中温经汤的对照特征图谱。
42.图3是实施例10中10批温经汤提取物特征图谱。
具体实施方式
43.下本发明提供一种温经汤对照提取物及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用以理解本发明，并不用于限定本发明。
44.实施例中所涉及的实验仪器及材料如下：
45.电子天平：上海方瑞仪器有限公司jy系列百分之一天平；
46.煎药壶：美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶4升；
47.筛网：九峰筛网200目；
48.真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司lgj-100f；
49.西林瓶压盖机：sz20a；
50.2000ml不锈钢量杯若干；西林瓶：10ml，30ml，50ml若干；
51.高效液相色谱仪：waters 2695-2996型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津20-ad型高效液相色谱仪；
52.超声波清洗器：kq5200db型(600w，40khz；昆山市超声仪器有限公司)；
53.电子天平：上海方瑞仪器有限公司jy系列百分之一天平、me204e/02、ms205du、
54.xp26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
55.超纯水机：细胞型1810a(上海摩勒科学仪器有限公司)；
56.色谱柱：agilent zorbax sb-c18 250
×
4.6mm、kromasil c18 5μm 4.6
×
250mm、
57.phenomenex luna 5um c18(2)100a 4.6
×
250mm。
58.试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；
59.试药：没食子酸、芍药苷、甘草酸对照品；
60.当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术(蓬莪术)、牛膝、甘草(甘草)(四川新绿色药业科技发展有限公司提供)；
61.温经汤对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备：wjt200901、wjt200902、wjt200903、wjt200904、wjt200905、wjt200906、wjt200907、wjt200908、wjt200909、wjt200910)。
62.实施例1
63.本实施例涉及温经汤对照提取物的具体制备方法，包括以下步骤：
64.a、药材前处理：取药用当归、川芎、白芍、牡丹皮、莪术、人参、牛膝、甘草、肉桂，去泥沙、杂质、非药用部位，再经润制、切制、干燥，再将当归、莪术、甘草炮炙，得炒当归、川芎、白芍、牡丹皮、醋莪术、人参、牛膝、炒甘草、肉桂饮片；
65.b、煎煮：按温经汤的配方称取步骤a中的各饮片，加6-8倍量水，浸泡20-40min，煎煮20-30min，煎煮2-3次，合并药液，过滤，收集滤液；
66.c、浓缩：将步骤b中的滤液在温度50
±
2℃、负压0.080mpa的真空度下，浓缩至相对密度为1.02-1.06，得浓缩液；
67.d、冷冻干燥：将步骤c中的浓缩液，先在常压下预冻，再在压力为0.0pa条件下升华干燥，再进行解析干燥后，在温度10-26℃、相对湿度40-60％环境下收粉、称重、分装于棕色西林瓶，并封口，得温经汤对照提取物冻干粉。
68.实施例2
69.本实施例是在实施例1上的进一步优化，所述步骤a中，取药用当归、川芎、白芍、牡丹皮、莪术、人参、牛膝、甘草、肉桂后，具体的前处理方法为：
70.当归：除去杂质，洗净，润透，切1-2mm薄片，低温干燥。取净当归，置炒制容器内用文火炒至黄色，取出，摊凉。
71.川芎：除去杂质，分开大小，洗净，润透，切2-4mm的厚片，干燥。
72.白芍：洗净，润透，切1-2mm的薄片，干燥。
73.牡丹皮：迅速洗净，润后切1-2mm的薄片，晒干。
74.莪术：除去杂质，略泡，洗净，加醋(每100kg莪术需20kg米醋)拌匀，煮至透心，取出，稍凉，切2-4mm厚片，干燥。
75.人参：润透，切1-2mm薄片，干燥。
76.牛膝：除去杂质，洗净，润透，除去残留芦头，切5-10mm短段，干燥。
77.甘草(甘草)：除去杂质，洗净，润透，切2-4mm厚片，干燥。取净甘草片，置炒制容器内用文火炒至黄色，取出，摊凉。
78.肉桂：除去杂质及粗皮。用时捣碎。
79.上述饮片在润制时，一般至手握法检查润至内芯润透即可；切制后的饮片，饮片长度检查，异形片不得超过10％。再将上述合格饮片，送入煎药壶中，进行下一步煎煮步骤。
80.实施例3
81.本实施例是对温经汤对照提取物性状的考察。
82.温经汤对照提取物经工艺制备得到一种固体粉末。10批次温经汤对照提取物性状、水分分别见表1和表2。
83.表1：10批次温经汤对照提取物性状
[0084][0085][0086]
表2：10批次温经汤对照提取物的水分检查
[0087][0088]
从多批次的温经汤对照提取物的检测结果看，温经汤对照提取物为黄色至棕黄色粉末，气微，味先苦，后甜；温经汤对照提取物水分在5.2％-6.8％范围之内，平均值为5.9％。
[0089]
实施例4
[0090]
在中药制药技术领域中，不同饮片吸水率有差异，因此需考察温经汤的吸水率，进而为加水量做参考。本实施例主要考察温经汤对照提取物制备时，吸水率的变化情况。
[0091]
称取处方量的饮片100g(按当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术各20.6份，人参、牛膝、甘草各41.3份的比例计)，两份，分别加入8倍量(水体积：处方量饮片的重量)的水，分别在浸泡10min，20min，30min，50min，1h，1.5h，2h，4h，6h，8h，16h，24h测定，计算吸水率，结果见表3，吸水率曲线见图1。
[0092]
表3：温经汤吸水率数据
[0093][0094][0095]
从表3与图1可知，温经汤饮片其在前1.5h急剧吸水，2h后逐渐减小，12h吸水接近饱和，平均吸水率为268.8％。吸水率约为2.5倍。
[0096]
再参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)的“加水量”部分的意见：由于中药饮片的质地和吸水率相差较大，应根据不同的饮片确定加水量。加水量一般以浸过药面2～5厘米为宜，花、草类饮片或煎煮时间较长的饮片可酌量加水，再结合之前的试验，确定温经汤制备步骤中首次加水量为饮片的8倍量，二煎加水量为6倍量。
[0097]
实施例5
[0098]
在实施例4的基础上，对温经汤的加水量及提取次数进行考察，参考其吸水率，可将一煎加水倍数调整为8倍，二煎加水量定为6倍，提取2次；或将一煎加水倍数调整为7倍，二煎加水量定为6倍，提取2次，发现每次加水量控制在6-8倍量水最终的结果差距不大，但是加水量调整至9倍时，后面的浓缩工艺时长明显增长，所以定为，一煎加水倍数调整为8倍，二煎加水量定为6倍，提取2次，效率较高。
[0099]
实施例6
[0100]
本实施例是对温经汤对照提取物制备工艺中，浸泡时间的考察。
[0101]
取温经汤处方量的饮片100g，两份，均加8倍水，每隔10min观察饮片的浸泡情况，直至饮片泡至内芯湿润。
[0102]
结果表明：取温经汤处方量的饮片，加8倍水，每隔10min观察饮片的浸泡情况，直至饮片泡至内芯湿润。浸泡至10min时，大部分饮片未浸泡透；浸泡至20min时大部分内芯湿
润，少量较长饮片内芯未湿润；浸泡至30min时所有饮片内芯湿润，确定浸泡时间为30min。
[0103]
实施例7
[0104]
本实施例是对温经汤对照提取物制备工艺中冷冻工艺的考察。
[0105]
根据《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)中要求，对其中提取物干燥过程推荐采用冷冻干燥方法制备为宜，可保证其质量的稳定、易于保存。对冷冻干燥工艺参数考察，列举了两种冻干工艺的控制条件，见表4-1、4-2所示。
[0106]
表4-1：温经汤对照提取物冻干工艺(一)
[0107][0108]
表4-2：温经汤对照提取物冻干工艺(二)
[0109][0110]
通过上述冻干工艺，配合上述表中的控制参数，得到的两种冻干粉。两种冻干粉通过检测发现，表4-1工艺参数得到的冻干粉更疏松、干燥，更利于存放。所以最后选择表4-1的控制参数对应的工艺条件。
[0111]
再将经上述工艺后得到的冻干粉，在温度10-26℃、相对湿度40-60％环境下，快速收粉、称重、分装于棕色西林瓶，并封口、贴标签。
[0112]
实施例8
[0113]
本实施例是对温经汤对照提取物煎煮验证，根据前述实施中，对温经汤对照提取物制备工艺的考察，最后确定的较优工艺为：取温经汤处方量的饮片，加水煎煮两次，一煎加8倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，200目筛网过滤，立即冷却至室温；合并水煎液，冷冻干燥，分装，即得。
[0114]
采用本制备工艺，进行了10批温经汤对照提取物煎煮，结果见表5。
[0115]
表5：10批温经汤对照提取物数据汇总
[0116][0117]
由表5可得，10批温经汤对照提取物收粉率，平均值为27.37％。sd为1.17。平均值的70％-130％的范围为19.16％-35.58％。平均值加减3倍sd范围为23.86％-30.88％。本数据在正常范围内，可作为生产工艺的参考。
[0118]
实施例9
[0119]
本实施例是将本技术方案中得到的温经汤对照提取物的冻干粉用于温经汤对照提取物的一种特征图谱构建方法，再将得到的图谱用于温经汤复方制剂定性检测。
[0120]
a.对照品溶液的制备：取没食子酸、芍药苷、甘草酸对照品分别加70％甲醇制成每1ml含40μg的混合溶液，即得。
[0121]
b.供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率25khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0122]
c.检测：将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，以对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建温经汤对照提取物的特征图谱。
[0123]
所述高效液相色谱检测条件满足：
[0124]
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；
[0125]
柱温：30℃；
[0126]
流速：1.0ml/min；
[0127]
进样量：10μl；
[0128]
检测波长：254nm；
[0129]
流动相a为乙腈，流动相b为0.1％磷酸水溶液，梯度脱洗。
[0130]
所述梯度洗脱过程为：
[0131]
0～3min，流动相a为2％，流动相b为98％，
[0132]
3～35min，流动相a为2～28％，流动相b为98～72％，
[0133]
35～45min，流动相a为28～40％，流动相b为72～60％，
[0134]
45～60min，流动相a为40～60％，流动相b为60～40％，
[0135]
60～75min，流动相a为60～95％，流动相b为40～5％，
[0136]
75～80min，流动相a为95％，流动相b为5％。
[0137]
d.以步骤c中对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建温经汤对照提取物的特征图谱。
[0138]
供试品特征图谱中应呈现16个特征峰，其中峰1、峰6、峰13应分别与没食子酸、芍药苷、甘草酸对照品参照物峰保留时间相对应。与芍药苷参照物峰相应的峰作为s1峰，计算峰2～峰10与s1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
8％范围之内。规定值为0.577(峰2)、0.602(峰3)、0.890(峰4)、0.959(峰5)、1.233(峰7)、1.254(峰8)、1.278(峰9)、1.419(峰10)。与甘草酸参照物峰相应的峰作为s2峰，计算峰11～峰16与s2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
8％范围之内。规定值为0.862(峰11)、0.961(峰12)、1.148(峰14)、1.178(峰15)、1.229(峰16)。如图2所示。其中，峰1：没食子酸，峰2：l-色氨酸，峰3：原儿茶酸，峰4：绿原酸，峰5：芍药内酯苷，峰6(s1)：芍药苷，峰8：甘草苷；峰13(s2)：甘草酸。
[0139]
实施例10
[0140]
温经汤对照提取物特征图谱验证
[0141]
根据上述温经汤对照提取物特征图谱检测方法对10批(s1～s10为：wjt200901、wjt200902、wjt200903、wjt200904、wjt200905、wjt200906、wjt200907、wjt200908、wjt200909、wjt200910)温经汤对照提取物进行特征图谱验证，结果见图3所示。
[0142]
采用特征图谱，可以从整体上对温经汤对照提取物进行质量控制，以保证质量均一性和稳定性；结果表明10批温经汤对照提取物的质量均一、稳定。
[0143]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。