一种香橼对照提取物制备工艺及其质量控制方法与流程

本发明涉及一种中药对照提取物制备工艺，尤其涉及一种香橼对照提取物制备工艺及其质量控制方法，属于中药分析、质量鉴别及控制技术领域。

背景技术：

香橼(citrusmedical.)又名枸橼或枸橼子，味辛、微苦、酸，性温；归肝、肺、脾经；气香行散，可升可降；具有疏肝理气，宽胸化痰，除湿和中；主治胸胁胀痛，咳嗽痰多，脘腹痞痛，食滞呕逆，水肿脚气。枸橼成熟果实含橙皮甙(hesperidin)、枸橼酸(citricacid)、苹果酸(malicacid)、果胶、鞣质及维生素c等。

其中，香橼对照提取物为芸香科植物香圆citruswilsoniitanaka的干燥成熟果实经炮制加工制成的冻干粉。目前，发现关于香橼的国内外研究报道极少，有研究采用气相色谱-质谱连用仪从野生香橼果皮中检出74种化学成分，鉴定出34种成分，其中1-甲基-2-异丙基苯和1-甲基-2-丙基苯为含量最多的两种成分，另见有切制香橼会灼伤皮肤等研究报道，而关于香橼以及对照提取物的质量控制等方面还缺乏研究。现有技术“一种香橼配方颗粒的薄层鉴别方法，cn110068647a”中也仅公开：采用薄层层析法对香橼配方颗粒进行鉴别。又比如，现有技术“香橼、佛手中黄酮类成分含量测定及hplc特征图谱研究，姜艳艳等，2013”中公开：采用高效液相色谱法对特征图谱进行研究，对橙皮苷和柚皮苷进行含量测定，但其色谱柱为waterssunfiretmc18(4.6mm×150mm，5μm)，流动相乙腈-0.1％磷酸梯度洗脱，检测波长284nm，流速1.0ml·min-1，柱温30℃，以及，柚皮苷线性范围为0.190～41.1424μg(r＝0.9995)，平均加样回收率为102.98％(n＝6)。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术问题的不足，而提出了一种香橼对照提取物制备工艺及其质量控制方法。在本技术方案中，根据香橼饮片的特性，提供一种香橼对照提取物制备工艺；然后，基于高效液相色谱法，进行特征图谱的构建，实现对香橼对照提取物的质量控制；此外，再进行柚皮苷对照品的标准特征图谱的建立，进行香橼对照提取物中柚皮苷含量的测定，从而对其整体质量进行控制，以及弥补了香橼中有效成分(特别是柚皮苷、异牡荆苷)定量研究空白现象等不足。

为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：

本技术方案提供一种香橼对照提取物制备工艺，包括如下步骤：

取香橼饮片100g，加水煎煮二次，一煎加16倍水，浸泡30min，煮沸，保持微沸煎煮20min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加12倍水，煮沸，保持微沸煎煮15min，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，浓缩，冷冻干燥，分装，得香橼对照提取物，即得香橼对照提取物冻干粉。

进一步的，所述香橼对照提取物为浅黄色至黄棕色粉末，气微，味酸而苦。

进一步的，所述香橼对照提取物出膏率平均值为29.6％，sd值为3.1；平均值的70～130％的范围为20.8～38.5％，平均值加减3倍sd值范围为20.2～39.1％。

进一步的，所述香橼对照提取物水分均值为11.4％，其按照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定法第二法进行测定。

本技术方案还提出一种香橼对照提取物质量控制方法，包括如下步骤：

a.对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加50％甲醇，制成每1ml含30μg柚皮苷对照品溶液；

取异牡荆苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含30μg异牡荆苷对照品溶液；

b.供试品溶液的制备：取本品粉末0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率25khz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

c.构建：分别取所得柚皮苷对照品溶液和异牡荆苷对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，建立标准特征图谱；

将所得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定，将所得特征图谱与标准特征图谱比较，检测香橼对照提取物的质量及真伪；

高效液相色谱仪内色谱条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；

色谱柱柱温：35℃；

流动相：以甲醇-乙腈(v/v＝1:1)为流动相a，以1％冰乙酸溶液为流动相b；

流动相流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

检测波长：320nm；

理论板数按柚皮苷峰计算应不低于4000；

流动相按梯度洗脱程序为：

0～15min，流动相a为17→30％，流动相b为83→70％；

15～30min，流动相a为30％，流动相b为70％；

30～60min，流动相a为30→60％，流动相b为70→40％；

60～70min，流动相a为60％，流动相b为40％。

进一步的，所述香橼对照提取物的标准特征图谱包括十个特征峰，其中，峰3为异牡荆苷，峰4为柚皮苷，以峰4为参照峰s峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.446、峰2为0.693、峰3为0.772、峰5为1.058、峰6为1.200、峰7为1.760、峰8为1.885、峰9为2.545以及峰10为2.619，相对保留时间在规定值的±8％之内。

本技术方案另还提出一种香橼对照提取物中柚皮苷含量的测定方法，包括如下步骤：

a.对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含30μg的对照品溶液，即得；

b.供试品溶液的制备：取本品粉末0.1g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率25khz)20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得；

c.检测：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

高效液相色谱仪内色谱条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；

色谱柱柱温：35℃；

流动相：以甲醇-水-冰醋酸，体积比为30:63:3；

流动相流速：1.0ml/min；

进样量：5μl；

检测波长：284nm；

理论板数按柚皮苷峰计算应不低于4000。

进一步的，所述对照提取物按干燥品计算，平均含量为9.4％，sd值为2。本品按干燥品计，含量测定平均值的70-130％限量为含柚皮苷(c27h32o14)6.6～12.2％，平均值加减3倍sd值的限量范围为含柚皮苷(c27h32o14)3.4～15.4％。

转移率：实测范围26.0～58.2％范围之内，平均值为45.1％，sd值为9，转移率平均值的70～130％的范围为31.6～58.6％，转移率平均值加减3倍sd值的限量范围为18.1～72.1％。

每1克香橼对照提取物冻干粉相当于3.4克香橼饮片。

该香橼对照提取物中柚皮苷含量的测定方法用于衡量配方颗粒与临床汤剂是否一致的基准，与中药配方颗粒进行对比研究，以及，对香橼对照提取物的质量控制，并进行定量分析等。

常温避光保存。

采用本技术方案，带来的有益技术效果为：

1)在本发明中，根据香橼饮片的特性，提供一种香橼对照提取物制备工艺，对香橼中有效成分进行有效提取，而为香橼质量控制以及后续研究(比如：香橼配方颗粒)奠定基础；

2)本发明基于高效液相法，以及特定的对照品种类、供试品溶液提取以及向匹配的色谱条件，建立特征图谱检测方法，整体控制香橼对照提取物中的特征成分，并保证色谱峰多以及理论板数、分离度、对称性均较好，特征峰信息量丰富，确保香橼对照提取物整体质量的稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高；

3)本发明进一步的对香橼对照提取物中柚皮苷含量进行测定，弥补了香橼中有效成分(特别是柚皮苷、异牡荆苷)定量研究空白现象等不足，为香橼中柚皮苷等有效成分分析提供了科学可靠的分析方法，为完善中药香橼的质量标准奠定了基础。

附图说明

图1为实施例4中提取溶剂考察结果色谱图；

图2为实施例4中提取方法考察结果色谱图；

图3为实施例4中提取时间考察结果色谱图；

图4为实施例5的波长考察中柚皮苷紫外吸收光谱图；

图5为实施例5的波长考察中异牡荆苷紫外吸收光谱图；

图6为实施例5的波长考察中香橼对照提取物3d色谱图；

图7为实施例5中香橼对照提取物不同波长色谱图；

图8为实施例5中柱温考察结果色谱图；

图9为实施例5中流速考察结果色谱图；

图10为实施例6中色谱峰指认图；

图11为实施例6的不同仪器考察中结果色谱图；

图12为实施例6的色谱柱耐用性考察中不同色谱柱考察结果色谱图；

图13为实施例7中十六批香橼对照提取物特征图谱(其中，s1～s16为：xybt180501、xybt180510、xybt180511、xybt180512、xybt180513、xybt180514、xybt180515、xybt180516、xybt180601、xybt180602、xybt180603、xybt180604、xybt180605、xybt180606、xybt180607、xybt180608)；

图14为香橼对照提取物对照特征图谱(其中，峰3：异牡荆苷，峰4(s)：柚皮苷)。

具体实施方式

下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在以下实施例中，所涉及的仪器包括：

高效液相色谱仪：waters2695-2996型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津20-ad型高效液相色谱仪；

电子天平：me204e/02、ms205du、xp26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810a(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：kq5200db型(600w，40khz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：agilentextend-c18(250×4.6mm，5μm)、kromasil100-5-c18(250×4.6mm，5μm)、phenomenexluna5umc18(2)100a(250×4.6mm，5μm)。

在以下实施例中，所涉及的试剂包括：

甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、水(超纯水)，其余试剂均为分析纯。

在以下实施例中，所涉及的供试品包括：

香橼对照提取物冻干粉批号：xybt180501、xybt180510、xybt180511、xybt180512、xybt180513、xybt180514、xybt180515、xybt180516、xybt180601、xybt180602、xybt180603、xybt180604、xybt180605、xybt180606、xybt180607、xybt180608(四川新绿色药业科技发展有限公司制备)。

在以下实施例中，所涉及的对照品包括：

柚皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110722-201714，含量以93.4％计)；

异牡荆苷(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：must-18041301，含量以99.78％计)。

实施例1

一种香橼对照提取物制备工艺，包括如下步骤：

取香橼饮片100g，加水煎煮二次，一煎加16倍水，浸泡30min，煮沸，保持微沸煎煮20min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加12倍水，煮沸，保持微沸煎煮15min，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，浓缩，冷冻干燥，分装，得香橼对照提取物，即得香橼对照提取物冻干粉。

对于香橼对照提取物，其为浅黄色至黄棕色粉末，气微，味酸而苦。

其中，香橼对照提取物出膏率平均值为29.6％，sd值为3.1；平均值的70～130％的范围为20.8～38.5％，平均值加减3倍sd值范围为20.2～39.1％。

其中，香橼对照提取物水分均值为11.4％，其按照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定法第二法进行测定。

实施例2

一种香橼对照提取物特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

a.对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含30μg的柚皮苷对照品溶液；取异牡荆苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含30μg的异牡荆苷对照品溶液；

b.供试品溶液的制备：取本品粉末0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率25khz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

c.构建：分别取所得柚皮苷对照品溶液和异牡荆苷对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，建立标准特征图谱；

将所得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定，将所得特征图谱与标准特征图谱比较，检测香橼对照提取物的质量及真伪；

高效液相色谱仪内色谱条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；

色谱柱柱温：35℃；

流动相：以甲醇-乙腈(v/v＝1:1)为流动相a，以1％冰乙酸溶液为流动相b；

流动相流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

检测波长：320nm；

理论板数按柚皮苷峰计算应不低于4000；

流动相按下表1梯度洗脱程序为：

表1流动相梯度

香橼对照提取物的标准特征图谱包括十个特征峰，其中，峰3为异牡荆苷，峰4为柚皮苷，以峰4为参照峰s峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.446、峰2为0.693、峰3为0.772、峰5为1.058、峰6为1.200、峰7为1.760、峰8为1.885、峰9为2.545以及峰10为2.619，相对保留时间在规定值的±8％之内。

实施例3

一种香橼对照提取物中柚皮苷含量的测定方法，包括如下步骤：

a.对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含30μg的对照品溶液，即得；

b.供试品溶液的制备：取本品粉末0.1g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率25khz)20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得；

c.检测：分别取所得的对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

高效液相色谱仪内色谱条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；

色谱柱柱温：35℃；

流动相：以甲醇-水-冰醋酸，体积比为30:63:3；

流动相流速：1.0ml/min；

进样量：5μl；

检测波长：284nm；

理论板数按柚皮苷峰计算应不低于4000。

所述香橼对照提取物按干燥品计算，平均含量为9.4％，sd值为2。本品按干燥品计，含量测定平均值的70-130％限量为含柚皮苷(c27h32o14)6.6～12.2％，平均值加减3倍sd值的限量范围为含柚皮苷(c27h32o14)3.4～15.4％。

转移率：实测范围26.0～58.2％范围之内，平均值为45.1％，sd值为9，转移率平均值的70～130％的范围为31.6～58.6％，转移率平均值加减3倍sd值的限量范围为18.1～72.1％。

并得：每1克香橼对照提取物冻干粉相当于3.4克香橼饮片。

该香橼对照提取物中柚皮苷含量的测定方法用于衡量配方颗粒与临床汤剂是否一致的基准，与中药配方颗粒进行对比研究，以及，对香橼对照提取物的质量控制，并进行定量分析等。

香橼对照提取物要常温避光保存。

实施例4

基于实施例2，本实施例对供试品溶液制备条件(提供溶剂、提取方法、提取时间)进行考察，以对本技术方案对进一步的说明。

一、提取溶剂考察

取香橼对照提取物(批号：xybt180501)0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，采用提取溶剂分别为甲醇40ml、30％甲醇40ml、50％甲醇40ml、80％甲醇40ml、50％乙醇40ml、乙醇40ml、水40ml对供试品进行提取，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用对应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，所得结果如图1所示。

结果表明：当提取溶剂为50％甲醇时，制备所得供试品溶液的色谱峰信息量大，故，供试品的提取溶剂确定为50％甲醇。

二、提取方法考察

取香橼对照提取物(批号：xybt180501)0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40ml，密塞，称定重量，分别进行超声处理(功率600w，频率40khz)30min、回流处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，所得结果如图2所示。

结果表明：超声提取与回流提取时，效果一致，但因超声提取操作更为简便，故，供试品的提取方法确定为超声提取。

三、提取时间考察

取香橼对照提取物(批号：xybt180501)0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40ml，密塞，称定重量，分别进行超声处理(功率600w，频率40khz)20min、30min、40min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，所得结果如图3所示。

结果表明：在提取时间为30min时，即可充分提取，故，供试品的提取时间确定为30min。

综上所述，将香橼对照提取物特征图谱的供试品溶液制备方法确定为：取本品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇40ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率25khz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施例5

基于实施例2，本实施例对色谱条件(波长、柱温、流速)进行考察，以对本技术方案对进一步的说明。

一、波长考察

利用二极管阵列检测器分别对异杜荆苷、柚皮苷、供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在260nm、300nm、320nm、350nm波长下的色谱图，其他色谱条件同实施例2，检测，结果如图4-7所示。

结果表明：在检测波长为320nm时，色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故，检测波长确定为320nm。

二、柱温考察

将柱温分别设定为25℃、30℃、35℃，其余色谱条件同实施例2，测定，结果如下表2及图8所示。

表2柱温考察—特征峰相对保留时间比值

结果表明：柱温对色谱峰的相对保留时间有一定影响，当柱温为35℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故，最终选择35℃作为香橼对照提取物特征图谱方法的柱温。

三、流速考察

将流速分别设定为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，其余色谱条件同实施例2，测定，结果如下表3及图9所示。

表3流速考察—特征峰相对保留时间

结果表明：流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时，各特征峰的相对保留时间rsd为0.00～3.81％，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中，故，流速确定为1.0ml/min。

综上所述，香橼对照提取物特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇-乙腈(v/v＝1:1)为流动相a，以1％冰乙酸溶液为流动相b；按下表4中的规定进行梯度洗脱；其中，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，检测波长为320nm，理论板数按柚皮苷峰计算应不低于4000。

表4流动相梯度

实施例6

基于实施例2，本实施例还进行了如下的方法学考察，以对本技术方案作进一步说明。

一、色谱峰指认

1、对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含30μg的柚皮苷对照品溶液；取异牡荆苷对照品，加50％甲醇制成每1ml含30μg的异牡荆苷对照品溶液；

2、供试品溶液的制备：取本品粉末0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率25khz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3、阴性对照溶液的制备：于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇40ml，称定重量，超声处理(功率600w，频率25khz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，即得；

将所得的对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液分别进样于hplc进行测定，对香橼对照提取物的特征图谱峰进行定位，结果如图10所示。

二、精密度考察

取香橼对照提取物(批号：xybt180501)的供试品溶液，连续进样六次，其他条件同实施例2，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果如下表5-6。

表5精密度考察-保留时间

表6精密度考察-峰面积

结果表明：该仪器精密度良好。

三、重复性考察

取香橼对照提取物(批号：xybt180501)的供试品溶液，共六份，其他条件同实施例2，计算各特征峰的相对保留时间比值及相对峰面积比值，结果如下表7-8。

表7重复性考察-相对保留时间比值

表8重复性考察-相对峰面积比值

结果表明：该方法重复性良好。

四、中间精密度考察

1、不同仪器考察

分别精密称取香橼对照提取物(批号：xybt180501)两份，制备供试品溶液，分别在岛津20-ad、waters2695-2996型、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定，所得结果下表9-10及图11所示。

表9仪器耐用性考察-相对保留时间比值

表10仪器耐用性考察-相对峰面积比值

结果表明：用上述三种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的rsd均小于2.64％，仪器耐用性良好。

2、不同人员和时间考察

由不同人员(a、b)在不同时间(t1、t2)分别精密称取香橼对照提取物(批号：xybt180501)各两份，制备供试品，进行测定，所得结果下表11-12所示。

表11人员和时间考察-相对保留时间比值

表12人员和时间考察-相对峰面积比值

结果表明：由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。

五、耐用性考察

1、色谱柱耐用性考察

分别在色谱柱为agilentextend-c18250×4.6mm、kromasil100-5-c184.6×250mm、phenomenexluna5umc18(2)100a4.6×250mm中进行检测，其他色谱条件同实施例2，结果如表13-14及图12所示。

表13色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值

表14色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值

结果表明：用上述三种色谱柱对供试品进行检测，特征峰相对保留时间的rsd值为2.13～7.99％，特征峰相对峰面积的rsd值为2.84～48.04％，对应色谱柱耐用性良好。

2、稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于0h、3h、6h、9h、12h及24h时测定，其他色谱条件同实施例2，结果如表15-16所示。

表15稳定性考察-保留时间

表16稳定性考察-峰面积

结果表明：相对应的特征峰保留时间rsd值为0.15～0.41％，供试品溶液在24h内较稳定。

综上所述，各特征峰相对保留时间的rsd值在上述各项考察中均符合要求，该方法良好。并将上述10个特征峰纳入后续考察。

实施例7

基于实施例2，本实施例进行特征峰的确定及对照图谱的建立，以对本技术方案作进一步的说明。

一、十六批香橼对照提取物验证结果

采用16批供试品进行特征图谱分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值，所得结果如下表17-18及图13所示。

表17十六批香橼对照提取物相对保留时间

表18十六批香橼对照提取物相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次供试品均能检出原则，共选择了10个峰重复性较好的峰作为特征峰。

二、相对保留时间规定值限度的制定

方法学各考察项目及验证结果汇总见下表19、20所示。

表19方法学中各项目结果rsd％汇总标准—相对保留时间

表20方法学中各项目结果rsd％汇总标准—相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次供试品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰，由上表可知：柱温、流速和不同色谱柱对各个相对峰面积的影响较大，故不列入正文。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，其中与柚皮苷参照物相应的峰为s峰。计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内。规定值为：0.446(峰1)、0.693(峰2)、0.772(峰3)、1.000(峰4(s))、1.058(峰5)、1.200(峰6)、1.760(峰7)、1.885(峰8)、2.545(峰9)、2.619(峰10)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对十六批香橼对照提取物进行合成，建立了香橼对照提取物特征图谱的对照图谱，如图14所示。