一种当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法与流程

1.本发明涉及中成药质量检测技术领域，尤其涉及一种当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法。


背景技术：

2.当归六黄汤出自金元四大家李东垣编纂的《兰室秘藏》，被后世誉为“治盗汗之圣方也”,该方组成为：当归、生地黄、熟地黄、黄连、黄芩、黄柏、黄芪共七味药，其中当归、生地和熟地共为君药，当归味甘辛温，具有养血作用，生地味甘苦凉，熟地味甘微温，具有滋阴之效；黄芩味苦寒，清上焦火，黄连味苦寒清中焦火，黄柏味苦寒泻下焦火，是为臣药；黄芪为佐药，可益气固表。主治阴虚火旺所致的盗汗证，证见发热盗汗，面赤口干，心烦唇燥，大便干结，小便黄赤，舌红苔黄。该方属于2018年国家中医药管理局会同国家药品监督管理局制订《古代经典名方目录(第一批)》中的100首经典名方之一。经典名方是以古代医籍记载的制备方法为依据采用现代工业化生产的中药复方制剂，除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致。经典名方临床疗效确切，运用现代分析技术对其质量进行控制，不仅保障了复方制剂的质量稳定，也能更好的促进经典名方的临床应用。
3.中药指纹图谱是控制中药材和中药复方制剂的重要质量分析手段，在中药质量标准控制被广泛应用。目前关于当归六黄汤的指纹图谱研究并不多，关于该方的成分分析以及质量控制方面也尚无报道。因此，该方具有较大的开发价值。为了更全面、更有效地控制当归六黄汤临床用药的质量，使其安全性和疗效更加有所保障，需要对本中药组合物采用更为先进的质量检测手段。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提出一种当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法，能够有效的控制当归六黄汤制剂产品质量。
5.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：
7.(1)取5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱为对照品，分别制成各参照物溶液；
8.(2)取当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏和黄芪，制成当归六黄汤组合物，将当归六黄汤组合物制成供试品溶液；
9.(3)精密吸取供试品溶液和各参照物溶液，注入液相色谱仪进行色谱分析，检测波长为280nm～320nm，得到供试品指纹图谱和参照物色谱图谱，制定当归六黄汤组合物的标准指纹图谱。
10.进一步的，所述步骤(3)中，液相色谱仪进行色谱分析的条件为：
11.采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温20℃～30℃；
12.以流动相为乙腈
‑
0.1％磷酸溶液进行洗脱，流速为0.2ml/min～0.3ml/min；
13.理论板数按黄芩苷峰计算≥10000。
14.进一步的，所述乙腈
‑
0.1％磷酸溶液以梯度洗脱，洗脱顺序为：
15.0～18min，乙腈5％
→
20％，0.1％磷酸溶液95％
→
80％；
16.18～35min，乙腈20％
→
25％，0.1％磷酸溶液80％
→
75％；
17.35～44min，乙腈25％
→
95％，0.1％磷酸溶液75％
→
5％；
18.44～44.1min，乙腈95％
→
5％，0.1％磷酸溶液5％
→
95％；
19.44.1～50min，乙腈5％，0.1％磷酸溶液95％。
20.进一步的，所述标准指纹图谱包含20个特征峰，按照出现的时间顺序依次编号为1
‑
20，所述标准指纹图谱中2、4、5、9、13和15号峰分别与5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱的色谱峰保留时间相对应，其中13号峰为s峰。
21.进一步的，所述标准指纹图谱中20个特征峰的保留时间由编号1
‑
20依次为：0.071、0.159、0.357、0.379、0.437、0.482、0.512、0.520、0.626、0.824、0.830、0.852、1.000、1.035、1.064、1.154、1.235、1.278、1.324和1.374。
22.进一步的，所述步骤(1)中，所述5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱，分别精度称定后各加70％甲醇制成每1ml含10～100μg溶质的溶液，为参照物溶液。
23.进一步的，所述步骤(2)中，精密称定当归六黄汤组合物0.1g，精密加入70％浓度甲醇50ml，进行超声处理，以70％浓度甲醇补足减失的重量，即得到所述的供试品溶液。
24.进一步的，所述当归六黄汤组合物的制备方法如下：
25.a、按重量份计称取如下饮片：当归4g，生地黄4g，熟地黄4g，黄芩4g，黄连4g，黄柏4g，黄芪8g；
26.b、将称取的饮片共同置于2l砂锅中，加600ml水，浸泡30分钟，加盖并煮沸，保持微沸至煎液300
‑
400ml，趁热用200目滤布过滤，得滤液；
27.c、滤液减压浓缩后，依次进行冷冻干燥、粉碎和混匀步骤，即得当归六黄汤组合物。
28.或者，所述当归六黄汤组合物的制备方法如下：
29.a、按重量份计称取如下饮片：当归250g，生地黄250g，熟地黄250g，黄芩250g，黄连250g，黄柏250g，黄芪500g；
30.b、将称取的饮片加20倍量的水，煎煮60分钟，滤除药渣，得滤液；
31.c、减压浓缩至相对密度为1.0
‑
1.20的清膏，依次进行加入麦芽糊精、干燥、混匀、加硬脂酸镁和干压制粒步骤，即得当归六黄汤组合物。
32.一种当归六黄汤组合物的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
33.将待测当归六黄汤组合物制成待测样品溶液；
34.将待测样品溶液注入液相色谱仪进行色谱分析，生成待测样品图谱；
35.以上所述的当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法中的标准指纹图谱作为对照图谱，计算待测样品图谱和标准指纹图谱的相似度，相似度大于0.9即为质量合格。
36.进一步的，所述将待测样品溶液注入液相色谱仪进行色谱分析的条件为：
37.采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温20℃～30℃；
38.以流动相为乙腈
‑
0.1％磷酸溶液进行洗脱，流速为0.2ml/min～0.3ml/min；
39.检测波长为280nm～320nm，理论板数按黄芩苷峰计算≥10000；
40.所述乙腈
‑
0.1％磷酸溶液以梯度洗脱，洗脱顺序为：
41.0～18min，乙腈5％
→
20％，0.1％磷酸溶液95％
→
80％；
42.18～35min，乙腈20％
→
25％，0.1％磷酸溶液80％
→
75％；
43.35～44min，乙腈25％
→
95％，0.1％磷酸溶液75％
→
5％；
44.44～44.1min，乙腈95％
→
5％，0.1％磷酸溶液5％
→
95％；
45.44.1～50min，乙腈5％，0.1％磷酸溶液95％。
46.本发明的有益效果为：
47.本发明的当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法中，以5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱为对照品，对应组合物中各味药的特有成分，以280nm～320nm检测波长，满足组合物中各化学组分灵敏度以及检测信号，使得能同时达到较高水平且被同时测定。
48.该方法以乙腈
‑
0.1％磷酸溶液为流动相使组合物中各成分达到很好的分离效果，以70％甲醇为溶剂提取组合物中的成分生成的色谱峰最多。
49.综上，本发明的当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法可准确检测当归六黄汤组合物品质的标准指纹图谱，获得能有效的控制当归六黄汤制剂产品质量。
附图说明
50.图1是实施例3的指纹图谱测定中200～400nm扫描光谱3d图；
51.图2是实施例3中检测波长为280nm～320nm色谱图；
52.图3是实施例3中各参照物溶液的色谱图；
53.图4是实施例4中不同流动相洗脱系统考察色谱图；
54.图5是实施例4中不同提取溶剂考察色谱图；
55.图6是实施例6中10份第一当归六黄汤组合物的色谱图的拟合图；
56.图7是实施例6中当归六黄汤标准指纹图谱；
57.图8是实施例7中3批第二当归六黄汤组合物的色谱图的拟合图。
具体实施方式
58.下面结合具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
59.本发明的当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法是用于对当归六黄汤制剂产品的。
60.当归六黄汤在临床上主要用于甲状腺功能亢进、结核病、糖尿病等阴虚火旺症。七味药各具药效，黄芪中的活性成分三萜皂苷类成分，其主要的药理活性有调节免疫功能，有强心、抗炎、抑制胶原合成等作用；地黄中的环烯醚萜苷能够有效防治糖尿病和降血脂，对免疫系统、血液系统、中枢神经系统，抗衰老作用等多种方面；当归中的阿魏酸具有抗炎作用，黄连中的黄连碱以及黄连黄柏中的小檗碱都属于生物碱，具有改善葡萄糖代谢降低血糖并改善糖耐量异常的功能。黄芩中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素均具有抗脂质过氧化、抑制醛糖还原酶、防治糖尿病周围神经病变和糖尿病肾病等慢性并发症的作用。因此，基于当归六黄汤中的特有成分，本发明的当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法中采
用5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱为对照品。
61.具体的，本发明提供一种当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：
62.(1)取5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱为对照品，分别制成各参照物溶液；
63.(2)取当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏和黄芪，制成当归六黄汤组合物，将当归六黄汤组合物制成供试品溶液；
64.(3)精密吸取供试品溶液和各参照物溶液，注入液相色谱仪进行色谱分析，检测波长为280nm～320nm，得到供试品指纹图谱和参照物色谱图谱，制定当归六黄汤组合物的标准指纹图谱。
65.由于当归六黄汤组合物中含有七味药,每味药所含成分也较多，化学成分复杂。各味药中的特有成分的最大吸收波长不同，当归中的阿魏酸最大吸收波长在316nm，黄芩中的黄芩苷最大吸收波长在280nm，黄柏中的黄柏碱最大吸收波长在284nm，黄连中的盐酸小檗碱最大吸收波长在265nm。各味药中的特有成分属于生物碱类、皂苷类等，最大吸收波长不同，为了满足各组分的灵敏度以及检测信号，使得能同时达到较高水平且被同时测定，将检测波长设定为280nm～320nm。优选的，选用290nm的检测测长，检测时各组分分离度良好，基线平稳，峰形对称。
66.进一步的，所述步骤(3)中，液相色谱仪进行色谱分析的条件为：
67.采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温20℃～30℃；
68.以流动相为乙腈
‑
0.1％磷酸溶液进行洗脱，流速为0.2ml/min～0.3ml/min；
69.理论板数按黄芩苷峰计算≥10000。
70.采用流动相为乙腈
‑
0.1％磷酸溶液进行洗脱，色谱分析的基线平稳，色谱峰峰型对称和各成分有较好的分离效果。具体的，以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b。同时，结合柱温20℃～30℃和流速0.2ml/min～0.3ml/min，使组合物中各成分达到很好的分离效果。优选的，柱温20℃和流速0.2ml/min。
71.其中，0.1％磷酸溶液是指体积分数为0.1％的磷酸水溶液。
72.进一步的，所述乙腈
‑
0.1％磷酸溶液以梯度洗脱，洗脱顺序为：
73.0～18min，乙腈5％
→
20％，0.1％磷酸溶液95％
→
80％；
74.18～35min，乙腈20％
→
25％，0.1％磷酸溶液80％
→
75％；
75.35～44min，乙腈25％
→
95％，0.1％磷酸溶液75％
→
5％；
76.44～44.1min，乙腈95％
→
5％，0.1％磷酸溶液5％
→
95％；
77.44.1～50min，乙腈5％，0.1％磷酸溶液95％。
78.当归六黄汤组合物中含有当归、生地黄、熟地黄、黄连、黄芩、黄柏、黄芪共七味药，每味药所含成分较多，使得色谱分离难度较大，本发明采用梯度洗脱的方式，使各药味的主要指标成分达到分离的目标。同时，本发明设置较多个洗脱梯度，提高柱效，所得图谱中各个色谱峰之间具有一定的间距，能够很好的识别，且色谱峰的峰形对称宽度适宜。
79.进一步的，所述标准指纹图谱包含20个特征峰，按照出现的时间顺序依次编号为1
‑
20，所述标准指纹图谱中2、4、5、9、13和15号峰分别与5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱的色谱峰保留时间相对应，其中13号峰为s峰。所述标准指纹图谱中20个特征峰的保留时间由编号1
‑
20依次为：0.071、0.159、0.357、0.379、0.437、
0.482、0.512、0.520、0.626、0.824、0.830、0.852、1.000、1.035、1.064、1.154、1.235、1.278、1.324和1.374。
80.具体的，本发明中采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)作为本当归六黄汤组合物指纹图谱相似度计算软件。基于10批供试品的指纹色谱图导入相似度评价系统，选择其中相对保留时间稳定且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，且经多次试验研究，通过与计算相对保留时间及相对峰面积的方法相比较，最终确定20个特征峰，同时用软件自动生成当归六黄汤的标准指纹图谱。
81.进一步的，所述步骤(1)中，所述5
‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱，分别精度称定后各加70％甲醇制成每1ml含10～100μg溶质的溶液，为参照物溶液。
[0082]5‑
羟甲基糠醛、绿原酸、盐酸黄柏碱、阿魏酸、黄芩苷和盐酸小檗碱对应当归六黄汤组合物中药材的特有成分，生成的色谱峰能够更好的作为参照。其中的，70％甲醇是指体积分数70％的甲醇水溶液。将参照物溶液的浓度限定为每1ml含10～100μg溶质，该浓度更接近当归六黄汤组合物中相应成分的浓度。
[0083]
进一步的，所述步骤(2)中，精密称定当归六黄汤组合物0.1g，精密加入70％浓度甲醇50ml，进行超声处理，以70％浓度甲醇补足减失的重量，即得到所述的供试品溶液。采用70％浓度甲醇溶解当归六黄汤组合物，当归六黄汤组合物的色谱峰最多，色谱峰基本没有缺失。
[0084]
进一步的，所述当归六黄汤组合物的制备方法如下：
[0085]
a、按重量份计称取如下饮片：当归4g，生地黄4g，熟地黄4g，黄芩4g，黄连4g，黄柏4g，黄芪8g；
[0086]
b、将称取的饮片共同置于2l砂锅中，加600ml水，浸泡30分钟，加盖并煮沸，保持微沸至煎液300
‑
400ml，趁热用200目滤布过滤，得滤液；
[0087]
c、滤液减压浓缩后，依次进行冷冻干燥、粉碎和混匀步骤，即得当归六黄汤组合物。
[0088]
或者，所述当归六黄汤组合物的制备方法如下：
[0089]
a、按重量份计称取如下饮片：当归250g，生地黄250g，熟地黄250g，黄芩250g，黄连250g，黄柏250g，黄芪500g；
[0090]
b、将称取的饮片加20倍量的水，煎煮60分钟，滤除药渣，得滤液；
[0091]
c、减压浓缩至相对密度为1.0
‑
1.20的清膏，依次进行加入麦芽糊精、干燥、混匀、加硬脂酸镁和干压制粒步骤，即得当归六黄汤组合物。
[0092]
上述两种当归六黄汤组合物的制备方法对应两种当归六黄汤组合物制剂的生产工艺。两种制备方法所得的当归六黄汤组合物均能够被作为供试品使用。可以理解的，其他生产工艺所得的当归六黄汤组合物可作为被检测品。
[0093]
相应的，本发明提供一种当归六黄汤组合物的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
[0094]
将待测当归六黄汤组合物制成待测样品溶液；
[0095]
将待测样品溶液注入液相色谱仪进行色谱分析，生成待测样品图谱；
[0096]
以上所述的当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法中的标准指纹图谱作为对照图谱，计算待测样品图谱和标准指纹图谱的相似度，相似度大于0.9即为质量合格。
[0097]
色谱指纹图谱相似度是判断样品与标准图谱之间的相似程度，常用的相似度计算方法有三种，分别是夹角余弦法、相关系数法和欧式距离法，目前相似度的评价通常采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)进行夹角余弦法计算，一般相以度大于0.9以上即可视为该样品为合格。
[0098]
进一步的，所述将待测样品溶液注入液相色谱仪进行色谱分析的条件为：
[0099]
采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温20℃～30℃；
[0100]
以流动相为乙腈
‑
0.1％磷酸溶液进行洗脱，流速为0.2ml/min～0.3ml/min；
[0101]
检测波长为280nm～320nm，理论板数按黄芩苷峰计算≥10000；
[0102]
所述乙腈
‑
0.1％磷酸溶液以梯度洗脱，洗脱顺序为：
[0103]
0～18min，乙腈5％
→
20％，0.1％磷酸溶液95％
→
80％；
[0104]
18～35min，乙腈20％
→
25％，0.1％磷酸溶液80％
→
75％；
[0105]
35～44min，乙腈25％
→
95％，0.1％磷酸溶液75％
→
5％；
[0106]
44～44.1min，乙腈95％
→
5％，0.1％磷酸溶液5％
→
95％；
[0107]
44.1～50min，乙腈5％，0.1％磷酸溶液95％。
[0108]
该色谱条件能够将待测样品溶液中的各成分有效进行分离，以保证准确的检测效果。
[0109]
优选地，检测波长为290nm。
[0110]
优选地，将待测当归六黄汤组合物制成待测样品溶液的方法为：精密称定待测当归六黄汤组合物0.1g，精密加入70％浓度甲醇50ml，进行超声处理，以70％浓度甲醇补足减失的重量，即得到所述的待测样品溶液。
[0111]
优选的，待测当归六黄汤组合物的制备方法与供试品溶液中的当归六黄汤组合物的制备方法相同。可以理解的，其他生产工艺所得的当归六黄汤组合物可作为被检测品。
[0112]
以下通过实施例进一步阐述本发明。
[0113]
下述实施例涉及的试剂和仪器如下。
[0114]
试剂：
[0115]
阿魏酸对照品(批号：110773
‑
201614，中国药品生物制品检定研究院)；
[0116]
黄芩苷对照品(批号：110715
‑
201720，中国药品生物制品检定研究院)；
[0117]
绿原酸对照品(批号：112002
‑
201702，中国药品生物制品检定研究院)；
[0118]
盐酸小檗碱对照品(批号：110713
‑
201813，中国药品生物制品检定研究院)；
[0119]
盐酸黄柏碱对照品(批号：111895
‑
201504，中国药品生物制品检定研究院)；
[0120]5‑
羟甲基糠醛对照品(批号：111626
‑
201610，中国药品生物制品检定研究院)；
[0121]
当归六黄汤组合物(自制)，甲醇(美国bcr公司，色谱纯)、乙睛(美国bcr公司，色谱纯)试剂为分析纯，水为超纯水。
[0122]
仪器：
[0123]
waters h
‑
class超高效液相色谱仪；waters pda检测器；empower工作站；
[0124]
waters acquity uplc cortects t3(150
×
2.1mm，1.6μm)色谱柱；
[0125]
万分之一分析天平(al104，梅特勒
‑
托利多公司)；
[0126]
十万分之一分析天平(ms105du，梅特勒
‑
托利多公司)；
[0127]
超声清洗机(kq
‑
500de昆山市超声仪器有限公司)；
[0128]
超纯水系统(默克股份有限公司，millipore synergy uv)；
[0129]
trl
‑
05型冷冻干燥机(大连双瑞科技有限公司)。
[0130]
实施例1参照物溶液的制备
[0131]
阿魏酸对照品溶液：取阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含50μg的阿魏酸溶液。
[0132]
黄芩苷对照品溶液：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含50μg的黄芩苷溶液。
[0133]
盐酸小檗碱对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含50μg的盐酸小檗碱溶液。
[0134]
盐酸黄柏碱对照品溶液：取盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含50μg的盐酸黄柏碱溶液。
[0135]5‑
羟甲基糠醛对照品溶液：取在5
‑
羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含50μg的5
‑
羟甲基糠醛溶液。
[0136]
绿原酸对照品溶液：取绿原酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含50μg的绿原酸溶液。
[0137]
实施例2供试品溶液的制备
[0138]
当归六黄汤组合物的制备方法有两种，采用两种制备方法制成第一当归六黄汤组合物和第二当归六黄汤组合物。
[0139]
第一当归六黄汤组合物的制备方法如下：
[0140]
a、按重量份计称取如下饮片：当归4g，生地黄4g，熟地黄4g，黄芩4g，黄连4g，黄柏4g，黄芪8g；
[0141]
b、将称取的饮片共同置于2l砂锅中，加600ml水，浸泡30分钟，加盖并煮沸，保持微沸至煎液300
‑
400ml，趁热用200目滤布过滤，得滤液；
[0142]
c、滤液减压浓缩后，依次进行冷冻干燥、粉碎和混匀步骤，得第一当归六黄汤组合物。
[0143]
第二当归六黄汤组合物的制备方法如下：
[0144]
a、按重量份计称取如下饮片：当归250g，生地黄250g，熟地黄250g，黄芩250g，黄连250g，黄柏250g，黄芪500g；
[0145]
b、将称取的饮片加20倍量的水，煎煮60分钟，滤除药渣，得滤液；
[0146]
c、减压浓缩至相对密度为1.0
‑
1.20的清膏，依次进行加入麦芽糊精、干燥、混匀、加硬脂酸镁和干压制粒步骤，得第二当归六黄汤组合物。
[0147]
将第一当归六黄汤组合物和第二当归六黄汤组合物分别制成供试品溶液，制备方法如下：
[0148]
精密称定当归六黄汤组合物0.1g，精密加入70％浓度甲醇50ml，进行超声处理，以70％浓度甲醇补足减失的重量，即得到所述的供试品溶液。
[0149]
实施例3指纹图谱色谱条件的考察
[0150]
(1)检测波长的选择
[0151]
精密吸取实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液和实施例1的各参照物溶液，注入液相色谱仪进行色谱分析。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流
动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速0.2ml/ml，柱温：20℃。
[0152]
表1指纹图谱流动相梯度程序
[0153][0154]
采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波长检测，根据收集的三维图谱(见图1)，并同时收集280nm、290nm、300nm、310nm、320nm波长处的图谱(见图2)，综合考察比对，各波长处图谱锋信息量均比较大，其中，第一当归六黄汤组合物在290nm波长处的峰信息量最大，因此，290nm为当归六黄汤组合物指纹图谱的最优检测波长。
[0155]
以290nm检测波长和上述的色谱条件分别获得实施例1的各参照物溶液的色谱图(如图3所示)，以便于进行当归六黄汤组合物的色谱峰的选择。
[0156]
(2)色谱系统的考察
[0157]
基于(1)中色谱分析的条件，采用290nm检测波长，将流动相乙腈
‑
0.1％磷酸溶液替换为乙腈
‑
磷酸水、甲醇
‑
磷酸水、乙腈
‑
甲酸水或乙腈
‑
乙酸水系统，精密吸取实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液注入色谱仪，进行色谱分析，指纹图谱检测见图4，结果表明：第一当归六黄汤组合物在乙腈
‑
0.1％磷酸水系统下基线平稳，色谱峰峰型和分离效果明显优于其他流动相体系，因此确定流动相系统为乙腈
‑
0.1％磷酸溶液。
[0158]
(3)柱温的选择
[0159]
基于(1)中色谱分析的条件，采用290nm检测波长，将柱温调整为30℃，精密吸取实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液注入色谱仪，得到的指纹图谱与(1)中的290nm检测波长所得色谱相近，表示柱温30℃时仍可生成较好效果的色谱图。
[0160]
实施例4供试品制备方法的考察
[0161]
基于实施例3(1)中色谱分析的条件，采用290nm检测波长，采用不同的第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液的方法，如下：
[0162]
取三份第一当归六黄汤组合物0.1g，精密称定，分别加甲醇、70％甲醇、水适量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得三份不同的供试品溶液。
[0163]
分别精密吸取1μl三份不同的供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果见图5。其它溶剂制备的样品相较于70％甲醇制备的样品，色谱峰有缺失，70％甲醇对第一当归六黄汤组合物提取峰个数最多，因此选择70％甲醇作为当归六黄汤指纹图谱的提取溶剂。
[0164]
实施例5方法学研究
[0165]
5.1专属性试验
[0166]
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、70％甲醇空白溶剂各1μl，注入液相色谱仪，按照实施例3(1)中色谱分析的条件且采用290nm检测波长进行检测，结果供试品色谱中
与对照品色谱相应位置出现相对应色谱峰，空白样品上没有相应峰，表明阴性无干扰，本方法专属性强。
[0167]
5.2指纹图谱精密度试验
[0168]
按照实施例3(1)中色谱分析的条件且采用290nm检测波长进行检测操作，取s1批的样品以实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液的方法制备供试品溶液，连续进样6次，导出色谱图运用2012版中药色谱指纹图谱相似度软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明仪器精密度良好。
[0169]
5.3指纹图谱稳定性试验
[0170]
按照实施例3(1)中色谱分析的条件且采用290nm检测波长进行检测操作，取s1批的样品以实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液的方法制备供试品溶液，于制备完成后的第0、4、8、12、20、24h分别进样测定，导出色谱图运用2012版中药色谱指纹图谱相似度软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，说明供试品溶液在制备完成后的24h内稳定性良好。
[0171]
5.4指纹图谱重复性试验
[0172]
按照实施例3(1)中色谱分析的条件且采用290nm检测波长进行检测操作，取s1批的样品以实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液的方法制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，导出色谱图运用2012版中药色谱指纹图谱相似度软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，说明本指纹图谱测定方法重复性良好。
[0173]
5.5指纹图谱中间精密度试验
[0174]
由不同实验人员在不同日期按照实施例3(1)中色谱分析的条件且采用290nm检测波长进行检测操作，取s1批的样品以实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液的方法制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，导出色谱图运用2012版中药色谱指纹图谱相似度软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，说明本指纹图谱测定方法中间精密度良好。
[0175]
以上试验结果表明，应用此方法具有稳定性好、重复性好，可重现的优点，能全面反映当归六黄汤组合物的整体和内在质量。
[0176]
实施例6共有峰的确定及标准指纹图谱的建立
[0177]
采用不同批次饮片，分别制备10份第一当归六黄汤组合物，以实施例2中第一当归六黄汤组合物制成的供试品溶液的方法制备供试品溶液，基于实施例3(1)中色谱分析的条件，采用290nm检测波长，进行测定。
[0178]
将10批次供试品溶液色谱图导入2012版中药色谱指纹图谱相似度软件，采用全谱匹配方式，确定其共有特征峰为20个，以13号黄芩苷色谱峰为s峰，计算10批样品共有峰相对保留时间。所述的20个共有特征峰的相对保留时间偏差rsd均小于2％，即：
[0179]
1号峰相对保留时间rrt为0.071，rsd％为0.01％；
[0180]
2号峰相对保留时间rrt为0.159，rsd％为0.02％；
[0181]
3号峰相对保留时间rrt为0.357，rsd％为0.04％；
[0182]
4号峰相对保留时间rrt为0.379，rsd％为0.05％；
[0183]
5号峰相对保留时间rrt为0.437，rsd％为0.04％；
[0184]
6号峰相对保留时间rrt为0.482，rsd％为0.03％；
[0185]
7号峰相对保留时间rrt为0.512，rsd％为0.02％；
[0186]
8号峰相对保留时间rrt为0.520，rsd％为0.02％；
[0187]
9号峰相对保留时间rrt为0.626，rsd％为0.02％；
[0188]
10号峰相对保留时间rrt为0.824，rsd％为0.04％；
[0189]
11号峰相对保留时间rrt为0.830，rsd％为0.06％；
[0190]
12号峰相对保留时间rrt为0.852，rsd％为0.05％；
[0191]
13号峰相对保留时间rrt为1.000，rsd％为0.00％；
[0192]
14号峰相对保留时间rrt为1.035，rsd％为0.02％；
[0193]
15号峰相对保留时间rrt为1.064，rsd％为0.04％；
[0194]
16号峰相对保留时间rrt为1.154，rsd％为0.06％；
[0195]
17号峰相对保留时间rrt为1.235，rsd％为0.05％；
[0196]
18号峰相对保留时间rrt为1.278，rsd％为0.03％；
[0197]
19号峰相对保留时间rrt为1.324，rsd％为0.02％；
[0198]
20号峰相对保留时间rrt为1.374，rsd％为0.01％；
[0199]
其中，13号s峰是参照物的色谱峰。
[0200]
运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012年版)对10批第一当归六黄汤组合物样品进行拟合(见图6)，生成当归六黄汤对照指纹图谱(见图7)即为标准指纹图谱。采用夹角余弦法计算样品相似度，如表下表所示。结果表明，10批第一当归六黄汤组合物相似度在0.921～0.989之间，相似度较高，表明化学成分稳定。
[0201]
表2 10份第一当归六黄汤组合物相似度评价结果
[0202][0203]
实施例7采用标准指纹图谱对当归六黄汤组合物进行检测
[0204]
取实施例6中的第一当归六黄汤组合物中的饮片，采用实施例2中的方法制备3批第二当归六黄汤组合物样品和将第二当归六黄汤组合物样品制成供试品溶液。按照实施例3(1)中色谱分析的条件且采用290nm检测波长进行检测操作，测定3批第二当归六黄汤组合物的色谱图。
[0205]
将3批色谱图导入相似度软件(见附图8)，以实施例6的标准指纹图谱作为随行对照图谱，计算3批次第二当归六黄汤组合物的相似度，如下表所示。结果表明3批第二当归六黄汤组合物的相似度均大于0.9，表明三批当归六黄汤制剂质量稳定。
[0206]
表3第二当归六黄汤组合物相似度计算结果
[0207][0208]
根据本发明实施例的一种当归六黄汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法的其他构成等以及操作对于本领域普通技术人员而言都是已知的，这里不再详细描述。
[0209]
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0210]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。