一种宠物病毒胶体金快速检测试剂卡的制备方法与流程

本发明属于检测试剂盒制备
技术领域：
，涉及一种宠物病毒胶体金快速检测试剂卡的制备方法。
背景技术：
：胶体金免疫技术在70年代初期由faulk和taylor始创，其特点是以胶体金作为标记示踪物，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术，最初应用于免疫电镜技术。他是以金核为中心通过静电作用形成的相对稳定的多相不均匀体系，其本身具有特有的颜色。可以与蛋白质通过电荷作用牢固结合，又不影响其活性，这一优势使其广泛的应用于免疫诊断行业中。迄今为止，金标记仍主要用于免疫组织化学中。在免疫测定中，金标结合物常与膜载体配合，形成特定的测定模式，如免疫层析试验和斑点免疫渗滤试验，已是目前应用广泛的简便、快速的检验方法。如犬细小病毒(canineparvovirus，cpv)是细小病毒成员，单链小dna病毒。病毒粒子为等轴对称的二十面体，外观呈圆形或六边形，无囊膜，病毒粒径为21nm～24nm，于1977年，首次从患有肠炎的病犬体内分离获得。病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎，发病率为50％～100％，死亡率为0％～50％，对养犬业和经济动物养殖业影响极大，因此要建立快速有效的检测方法，并针对该病进行有效治疗。而猫瘟又称猫猫泛白细胞减少症、猫传染性肠炎，是猫的一种急性高度接触性传染病。其病原猫瘟病毒为细小病毒科、细小病毒属的一种病毒。临床表现多以突发高热、顽固性呕吐、腹泻、脱水、循环障碍以及白细胞急剧减少为主要特征。本病一年四季均可发生，尤以冬春季多发，发病猫可从粪、尿、呕吐物及各种分泌物中大量排出病毒，切病毒可在环境中存活较长时间。本病除感染家猫外，还能感染其他猫科动物(如虎、豹)和鼬科动物(貂)及熊科的浣熊。各年龄的猫均可感染。多数情况下，1岁以下的猫易感，感染率可达70％，死亡率为50～60％，5月龄以下的幼猫死亡率最高可达80～90％，随年龄的增长，发病率逐渐降低，群养的猫可全群爆发或者全窝发病。目前，已经相对成熟的犬细小病毒检测方法有抗体的血清学试验，比如血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验等，但是由于cpv与猫泛白细胞减少症病毒、水貂肠炎病毒三者之间能发生交叉血清学反映，因此在实际应用中这些方法常受到限制。除此之外，elisa的方法应用也相对广泛，但是elisa方法的操作相对复杂，需要有专业技术人员进行操作，而且需要配合酶标仪来判读结果，整体反应时间长，因此不适用于基层的快速诊断的需求。而猫瘟病毒检测的方法中，荧光定量pcr以及elisa方法应用相对广泛，但是，这两种方法的操作相对复杂，要有专业人员进行操作，且均需要配合专业的仪器设备进行判读结果，加之整体反应时间较长，不适用于基层的快速诊断需求。技术实现要素：本发明的目的就是为了提供一种宠物病毒胶体金快速检测试剂卡的制备方法，以实现对犬细小病毒和/或猫瘟病毒的快速准确检测。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种宠物病毒胶体金快速检测试剂卡的制备方法，包括以下步骤：(1)胶体金标链霉亲和素制备：取胶体金溶液调整ph至9-10，再加入链霉亲和素溶液，振荡反应，加入bsa，继续振荡，再离心分离除去上清后，即得到胶体金标链霉亲和素，再采用金标稀释液将沉淀复溶备用；(2)生物素化宠物病毒标记抗体的制备：取宠物病毒标记抗体(即5e2)采用缓冲液稀释，透析，得到宠物病毒标记抗体溶液，再加入生物素溶液，室温反应，接着加入nh4cl溶液，继续室温搅拌反应，随后透析、过柱纯化，即得到生物素化宠物病毒标记抗体；(3)胶体金标记链霉素-生物素化宠物病毒标记抗体的制备：取步骤(1)所制得的胶体金标链霉亲和素与步骤(2)制得的生物素化宠物病毒标记抗体，混合并振荡反应，离心除去上清，即得到胶体金标记链霉素-生物素化宠物病毒标记抗体，随后用金标稀释液将沉淀复溶，备用；(4)胶体金标记物垫的制备：将复溶后的胶体金标记链霉素-生物素化宠物病毒标记抗体喷涂于空白的标记物垫上，过夜烘干，即得到胶体金标记物垫；(5)包被板的制备：用缓冲液将羊抗鼠igg与宠物病毒包被抗体(5b10)进行稀释，并在已粘贴好硝酸纤维素膜和棉浆板的空白包被板上，进行包被，包被结束后，放入烘箱烘干过夜；(6)检测卡的制备：将胶体金标记物垫、包被板与样品垫按照标记物垫压包被板1～2mm(即两者有1-2mm长度的区域重叠)、样品垫压标记物垫1～2mm的顺序粘贴在检测板上，再裁切成试纸条，即为宠物病毒检测试纸条，随后，将试纸条装入卡壳中，即得到宠物病毒检测试剂卡。进一步的，宠物病毒为犬细小病毒或猫瘟病毒，对应的，宠物病毒标记抗体为犬细小标记抗体或猫瘟标记抗体，生物素化宠物病毒标记抗体为生物素化犬细小标记抗体或生物素化猫瘟标记抗体，宠物病毒包被抗体为鼠单抗犬细小包被抗体或鼠单抗猫瘟包被抗体。进一步的，步骤(1)中，胶体金溶液的浓度为万分之一(即0.01wt％)，链霉亲和素溶液的浓度为10mg/ml，且链霉亲和素溶液与胶体金溶液的添加量满足：两者混合后，链霉亲和素溶液的终浓度为20～50μg/ml；bsa的加入量满足：最终的质量浓度为1％。进一步的，步骤(1)中，加入链霉亲和素溶液，振荡反应的时间为20min；进一步的，步骤(1)中，加入bsa后，继续振荡的时间为20min。进一步的，步骤(2)中，宠物病毒标记抗体先用缓冲液稀释至1mg/ml，生物素溶液的浓度为1mg/ml，nh4cl溶液为浓度为1mol/l；生物素溶液、宠物病毒标记抗体溶液与nh4cl溶液的添加量之比为：每毫升宠物病毒标记抗体溶液中，对应加入120ul生物素溶液，每25ug生物素中对应加入1ulnh4cl。进一步的，步骤(2)中，加入生物素溶液后，室温反应的时间为2-4h。进一步的，步骤(2)中，加入nh4cl溶液后，继续室温搅拌反应的时间为10min。进一步的，步骤(3)中，链霉亲和素和生物素化抗体的摩尔比为1：(5-10)。进一步的，步骤(3)中，振荡反应的时间为15min，温度为室温。进一步的，所述的检测板为聚乙烯板。本发明就是以胶体金作为示踪物，结合生物素-链霉亲和素系统，应用于抗原抗体反应的一种检测技术。首先，胶体金溶液中的胶体金颗粒表面带有大量的负电荷，通过静电吸附作用，和链酶亲和素结合成胶体金-链霉亲和素的复合物；随后，将生物素与标记抗体进行偶联，形成生物素-标记抗体复合物；最后，将胶体金-链霉亲和素复合物与生物素化标记抗体复合物反应，最终得到胶体金-链霉亲和素-生物素-标记抗体复合物。本发明反应过程中各种原料的添加量均为生产工艺研究优化后的最适使用量，若不在本发明所限定的工艺条件范围使用量之内，可能会导致胶体金-链霉亲和素-生物素-标记抗体复合物的制备效率降低以及结合物本身的稳定性变差。本发明利用链霉亲-亲和素的多级放大效应，结合胶体金标记技术。即保留了胶体金技术的简便快捷的特性，又提高了胶体金的灵敏度。与现有技术相比，发明具有以下优点：1、提高标记效率；2、节约标记抗体，降低成本；3、提高产品的灵敏度；4、提高产品的精密性。附图说明图1为实施例1与对比例1所制得的检测卡的检测效果图。图2为实施例1与对比例2所制得的检测卡的检测效果对比图。图3为实施例2与对比例3所制得的检测卡的检测效果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下各实施例中，如鼠单抗犬细小标记抗体(5e2)、鼠单抗犬细小包被抗体(5b10)、鼠单抗猫瘟标记抗体(7d5)、鼠单抗猫瘟包被抗体(2f7)为本领域常规市售原料，质控线(c线)包被抗体羊抗鼠igg为外购商品化单抗，购买于上海杰一生物技术有限公司。其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。另外，所用的胶体金溶液的制备过程具体如下：用纯化水将氯金酸溶解成0.01％的溶液，取100ml加热至沸腾；加入1ml质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，持续加热，可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后颜色变为灰色，继而转变成黑色，随后逐渐稳定成红色，继续加热煮沸至颜色稳定，加热时间共持续15分钟；将烧制好的胶体金溶液冷却至室温，用纯化水恢复至原体积。根据柠檬酸钠加入量的不同，可制备不同粒径的胶体金颗粒，基本规则为柠檬酸三钠用量越少，胶体金颗粒的粒径越大。柠檬酸三钠的加入量与胶体金粒径的关系如下表：0.01％氯金酸(ml)1％柠檬酸三钠(ml)胶体金平均粒径(nm)2507.5±152503.75±302502.50±502501.90±60实施例1：一种宠物病毒胶体金快速检测试剂卡的制备方法，包括以下步骤：(1)胶体金标链霉亲和素的制备：将胶体金溶液调整ph至9-10，将链霉亲和素溶解至10mg/ml。取10ml胶体金溶液，将链霉亲和素加入其中，至终浓度为50ug/ml，振荡反应20分钟后，加入质量浓度为20％的bsa，使bsa的终浓度为1％，继续振荡封闭20分钟。随后在10000rpm的转速下离心10分钟，除去上清，最后用1ml金标稀释液将沉淀复溶。(2)生物素化犬细小标记抗体(5e2)的制备a.将待生物素化的犬细小标记抗体(5e2)用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)或0.5mol/l硼酸缓冲液(ph8.6)稀释到1mg/ml，一般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml；b.交互用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)或0.5mol/l硼酸缓冲液(ph8.6)，对犬细小标记抗体充分透析；c.用1mldmso溶解nhsb(即生物素)1mg；d.向1ml犬细小标记抗体溶液(即含蛋白质1mg)加入120μlnhsb溶液(即含nhsb120μg)；e.在室温下持续搅拌，保温2-4小时；f.加入9.6μl1mol/lnh4cl(每25μgnhsb加1μl)，在室温下搅拌10分钟；g.在4℃，对pbs充分透析，以除去游离的生物素；h.将样品上1ml的分子筛柱，以pbs缓慢洗脱，收集1ml/管，犬细小标记抗体在1-3ml之间洗下；i.最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/l)及1.0g/lbsa。将结合产物置4℃，避光保存，如需长时间保存，需置于-20℃条件下。(3)胶体金标记链霉素-生物素化犬细小标记抗体的制备：将制备好的胶体金标链霉亲和素和生物素化抗体，混合，使链霉亲和素和生物素化抗体的物质的量之比为1：5。振荡反应15分钟后，离心去除上清。如用手工涂垫，则用金标稀释液按照胶体金标记链霉素等体积复溶；如用仪器喷垫，则用金标稀释液按照胶体金标记链霉素的四分之一体积进行复溶。(4)胶体金标记物垫的制备：将复溶后的胶体金标记链霉素-生物化犬细小标记抗体喷涂于空白的标记物垫上，过夜烘干干燥后制得。手工涂垫：将空白标记物垫裁切成5mm*30cm，将胶体金标结合物按照25ul/cm的量进行涂布；仪器喷垫：将空白标记物垫裁切成8.5cm*30cm，仪器设定为4ul/cm进行喷涂。(5)犬细小包被板的制备：用包被液将羊抗鼠igg稀释至0.5mg/ml，将犬细小包被抗体(5b10)稀释至1mg/ml。在已粘贴好硝酸纤维素膜和棉浆板的空白包被板上，按照0.6ul/cm的喷量进行包被，包被结束后，放入烘箱烘干过夜制得。(6)样品垫的制备：将裁切好的玻璃纤维素膜用样品垫处理液进行预处理，处理结束后，放入烘箱中进行干燥。(7)犬细小检测卡的制备：将胶体金标记物垫、已包被完成的包被板、处理后的样品垫，按照顺序依次粘贴在聚乙烯板上组成大卡。将组装好的大卡纵向切成4mm的试纸条，即为犬细小病毒检测试纸条。随后，将试纸条装入卡壳中，即得到犬细小病毒检测试剂卡。对比例1：与实施例1相比，绝大部分都相同，除了省去了链霉亲和素与生物素的引入，即用标记抗体直接和胶体金颗粒进行连接，从而得到胶体金-标记抗体结合物。将上述实施例1与对比例1所得的试剂卡同时检测同一份犬细小病毒阳性样本，结果如图1所示，可见，采用实施例1制备的产品，其显色强度(即图中圆圈部分)明显优于通用标记方法的显色强度。可见，本发明通过链霉亲和素-生物素的多级放大效应(一个链霉亲和素可结合四个生物素化的标记抗体)，结合胶体金标记技术得到的胶体金-链霉亲和素-生物素-标记抗体，大大提高了标记抗体和胶体金的结合效率，在节约标记抗体的同时，也能提高产品的灵敏度。对比例2：采用链霉亲和素和生物素特异性反应的原理，从而起到信号放大、提高检测灵敏度的方式，还可通过以下实施例方式进行标记：(1)链霉亲和素-胶体金-标记抗体结合物垫的制备将胶体金溶液调整ph至9-10，取10ml胶体金溶液，然后加入链霉亲和素和犬细小标记抗体(5e2)，使链霉亲和素的终浓度为50ug/ml，犬细小标记抗体(5e2)终浓度为10ug/ml，室温条件下振荡反应20分钟后，加入质量浓度为20％的bsa，使bsa的终浓度为1％，继续振荡封闭20分钟。随后在10000rpm的转速下离心10分钟，除去上清，最后用1ml的金标稀释液将沉淀复溶。将复溶后的链霉亲和素-胶体金-标记抗体结合物喷涂于空白的标记物垫上，过夜烘干干燥后制得。手工涂垫：将空白标记物垫裁切成5mm*30cm，将胶体金标结合物按照25ul/cm的量进行涂布；仪器喷垫：将空白标记物垫裁切成8.5cm*30cm，仪器设定为4ul/cm进行喷涂。(2)胶体金-生物素结合物垫的制备将胶体金溶液调整ph至7±0.5，取10ml胶体金溶液，然后加入生物素使其终浓度为50ug/ml，在室温条件下振荡反应20分钟后，加入质量浓度为20％的bsa，使bsa的终浓度为1％，继续振荡反应20分钟。随后在10000rpm的转速下离心10分钟，除去上清，最后用1ml的金标稀释液将沉淀复溶。将复溶后的胶体金-生物素结合物喷涂于空白的标记物垫上，过夜烘干干燥后制得。手工涂垫：将空白标记物垫裁切成5mm*30cm，将胶体金标结合物按照25ul/cm的量进行涂布；仪器喷垫：将空白标记物垫裁切成8.5cm*30cm，仪器设定为4ul/cm进行喷涂。(3)犬细小包被板的制备：用包被液将羊抗鼠igg稀释至0.5mg/ml，将犬细小包被抗体(5b10)稀释至1mg/ml。在已粘贴好硝酸纤维素膜和棉浆板的空白包被板上，按照0.6ul/cm的喷量进行包被，包被结束后，放入烘箱烘干过夜制得。(4)样品垫的制备：将玻璃纤维素膜裁切成1.8cm*30cm，用样品垫处理液进行预处理，处理结束后，放入烘箱中过夜干燥后制得。(5)犬细小检测卡的制备：将链霉亲和素-胶体金-标记抗体结合物垫、胶体金-生物素结合物垫、犬细小包被板以及处理后的样品垫，按照样品垫压胶体金-生物素结合物垫1-1.5mm，胶体金-生物素结合物垫压链霉亲和素-胶体金-标记抗体结合物垫1-1.5mm，链霉亲和素-胶体金-标记抗体结合物垫压犬硝酸纤维素膜1-1.5mm的顺序粘贴在检测板上组成大卡。将组装好的大卡纵向切成4mm的试纸条，即为犬细小病毒检测试纸条。随后，将试纸条装入卡壳中，即得到犬细小病毒检测试剂卡。与实施例1对比，实施例2中，分别制备了链霉亲和素-胶体金-标记抗体结合物垫和胶体金-生物素结合物垫两个标记物垫，组装成犬细小病毒检测试剂卡后，同时考核另一相同的犬细小病毒阳性样本，结果如图2所示。可见，采用实施例1标记方法制备的检测卡，其显色强度(即图中圆圈部分)整体看优于实施例2标记方法的显色强度。但是，对同一份样本同时检测5次后，结果显示，采用实施例1标记方法制备的检测卡，检测线的线条显色程度较为均一，产品的精密性明显优于实施例2标记方法制备的检测卡。实施例2中，当样本加入后，将胶体金-生物素结合物垫和链霉亲和素-胶体金-标记抗体结合物垫中的结合物释放出来，链霉亲和素和生物素结合，标记抗体和样本中的犬细小病毒结合，形成犬细小病毒-犬细小标记抗体-链霉亲和素-生物素-胶体金的复合物，该过程主要包含有两个反应：1.犬细小病毒和犬细小标记抗体的结合；2.链霉亲和素和生物素的结合。而且链霉亲和素和生物素的结合还受到胶体金-生物素结合物垫的释放效果的影响，因此会导致产品的精密性受到一定的影响。实施例3：一种猫瘟病毒胶体金快速检测试剂卡的制备方法，包括以下步骤：(1)生物素化猫瘟标记抗体(7d5)的制备a.将待生物素化的猫瘟标记抗体(7d5)用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)或0.5mol/l硼酸缓冲液(ph8.6)稀释到1mg/ml，一般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml；b.交互用0.1mol/l碳酸氢钠缓冲液(ph8.0)或0.5mol/l硼酸缓冲液(ph8.6)，对猫瘟标记抗体充分透析；c.用1mldmso溶解nhsb(即生物素)1mg；d.向1ml猫瘟标记抗体溶液(即含蛋白质1mg)加入120μlnhsb溶液(即含nhsb120μg)；e.在室温下持续搅拌，保温2-4小时；f.加入9.6μl1mol/lnh4cl(每25μgnhsb加1μl)，在室温下搅拌10分钟；g.在4℃，对pbs充分透析，以除去游离的生物素；h.将样品上1ml的分子筛柱，以pbs缓慢洗脱，收集1ml/管，猫瘟标记抗体在1-3ml之间洗下；i.最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/l)及1.0g/lbsa。将结合产物置4℃，避光保存，如需长时间存放，置于―20℃保存。(2)胶体金标链霉亲和素的制备：将胶体金溶液调整ph至9-10，将链霉亲和素溶解至10mg/ml。取10ml胶体金溶液，将链霉亲和素加入其中，至终浓度为50ug/ml，振荡反应20分钟后，加入质量浓度为20％的bsa，使bsa的终浓度为1％，继续振荡封闭20分钟。随后在10000rpm的转速下离心10分钟，除去上清，最后用1ml金标稀释液将沉淀复溶。(3)胶体金标记链霉素-生物素化猫瘟标记抗体的制备：将制备好的胶体金标链霉亲和素和生物素化抗体，混合，使链霉亲和素和生物素化抗体的物质的量之比为1：5。振荡反应15分钟后，离心去除上清。如用手工涂垫，则用金标稀释液按照胶体金标记链霉素等体积复溶；如用仪器喷垫，则用金标稀释液按照胶体金标记链霉素的四分之一体积进行复溶。(4)胶体金标记物垫的制备：将复溶后的胶体金标记链霉素-生物化猫瘟标记抗体喷涂于空白的标记物垫上，过夜烘干干燥后制得。手工涂垫：将空白标记物垫裁切成5mm*30cm，将胶体金标结合物按照25ul/cm的量进行涂布；仪器喷垫：将空白标记物垫裁切成5cm*30cm，仪器设定为2.8ul/cm进行喷涂。(5)猫瘟包被板的制备：用包被液将羊抗鼠igg稀释至0.5mg/ml，将猫瘟包被抗体(2f7)稀释至1mg/ml。在已粘贴好硝酸纤维素膜和棉浆板的空白包被板上，按照0.6ul/cm的喷量进行包被，包被结束后，放入烘箱烘干过夜制得。(6)样品垫的制备：将裁切好的玻璃纤维素膜用样品垫处理液进行预处理，处理结束后，放入烘箱中进行干燥。(7)猫瘟检测卡的制备：将胶体金标记物垫、已包被完成的包被板、处理后的样品垫，按照顺序依次粘贴在聚乙烯板上组成大卡。将组装好的大卡纵向切成4mm的试纸条，即为猫瘟病毒检测试纸条。随后，将试纸条装入卡壳中，即得到猫瘟病毒检测试剂卡。对比例3：与实施例2相比，绝大部分都相同，除了省去了链霉亲和素与生物素的引入，即用标记抗体直接和胶体金颗粒进行连接，从而得到胶体金-标记抗体结合物。将上述实施例2与对比例3所得的试剂卡同时检测同一份猫瘟病毒阳性样本，结果如图1所示，可见，采用实施例2制备的产品，其显色强度(即图中圆圈部分)明显优于通用标记方法的显色强度。上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页12