一种检测生物分子间互作的微流控芯片的制作方法

本实用新型属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种检测生物分子间互作的微流控芯片。

背景技术：

在免疫学以及生物化学研究领域，针对抗原以及抗体的检测，一般主要采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassays,elisa)和免疫层析试纸法。其中elisa自面世以来，目前已得到广泛应用，其检测原理基于抗原与抗体间的特异性结合，并通过酶标抗体进行显色反应，采用酶标仪读取检测信号。elisa灵敏度高，特异性好，但由于检测过程包含包被、封闭、抗体孵育以及显色等步骤，耗时较长，一般为10分钟以上，难以达到快速检测的需求。

随着对检测时长的要求日益苛刻，免疫层析试纸法中的胶体金层析检测法近年来发展迅速，最为常见的即为早早孕试纸条，取样简单，几分钟内即可对检测结果进行判定，胶体金层析试纸条检测耗时短，但其优化及制备过程较为复杂，即使一般单位在拥有相关抗原抗体的情况下，也难以轻松制备。

因此，为解决elisa耗时长和免疫层析试纸条制备复杂的问题，本实用新型提供了一种方案：一种检测生物分子间互作的微流控芯片及方法。

技术实现要素：

为解决elisa耗时长和免疫层析试纸条制备复杂的问题，本实用新型提供了一种检测生物分子间互作的微流控芯片。

本实用新型所采用的技术方案为：一种检测生物分子间互作的微流控芯片，包括底板，底板上设置有依次连通的进样单元、检测单元以及动力单元；

动力单元为蠕动泵，蠕动泵的进液口设置有负压接口；进样单元包括进样箱，进样箱上开设有进样孔；检测单元包括检测箱，检测箱上开设有检测孔，检测箱内设置有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜外包覆有亲和素；进样箱与检测箱之间通过第一微管连通，负压接口与检测箱之间通过第二微管连通。

本实用新型的有益效果为：本实用新型基于生物素标记大分子物质策略，通过将生物素和第一生物大分子结合，继而加入待检测物和携带特异性标记的第二生物大分子；其中，待检测物能同时与生物素第一生物大分子和第二生物大分子特异性结合，从而形成复合体；在复合体流经检测孔时其中的生物素会被包覆于硝酸纤维素膜上的亲和素特异性捕获，经肉眼或相关检测设备进行信号检测。从滴加待检测物、生物素第一生物大分子和携带特异性标记的第二生物大分子至出现检测结果，仅需要5分钟，耗时短，提高了检测效率且亲和素的制备简单；适用于基于免疫原理检测的所有生物分子。

进一步限定，所述第一微管和第二微管的管径均为1.5～2.5毫米。

进一步限定，所述底板、第一微管以及第二微管均由聚苯乙烯制成。

进一步限定，所述亲和素的包覆厚度为0.4毫米。

进一步限定，所述进样箱的容量为50～200微升。

附图说明

图1是微流控芯片的结构示意图；

图2是检测单元的结构示意图；

图中：1-底板；2-进样单元；3-检测单元；31-检测箱；32-检测孔；33-硝酸纤维素膜；34-亲和素；4-动力单元；5-第一微管；6-第二微管；7-进样孔。

具体实施方式

为使本实用新型实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本实用新型所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

本实用新型的描述中，有的结构或器件未作具体描述的，理解为现有技术中有能实现的结构或器件。

一种基于微流控芯片的检测生物分子间互作的方法，包括以下步骤：

s1：采用生物素第一生物大分子得到生物素第一生物大分子；

s2：将生物素第一生物大分子、带有特异性标记的第二生物大分子和待检测物混合后加入进样孔内或是将生物素第一生物大分子、待检测物和带有特异性标记的第二生物大分子依次加入进样孔内；

s3：启动蠕动泵，检测亲和素的信号强度；

其中：所述第一生物大分子为蛋白质、肽段或核酸中的任意一种。所述第二种生物大分子为蛋白质、肽段、小分子肽或核酸中的任意一种，所述第二种生物大分子通常使用商品化的产品，具体的反应浓度则依据生产商推荐使用浓度来确定，不同生产商推荐数据略有变化。所述第二生物大分子的特殊标记为胶体金、荧光微球或量子点中的任意一种。

实施例1

如图1和图2所示，一种检测生物分子间互作的微流控芯片，包括底板，底板上设置有依次连通的进样单元、检测单元以及动力单元；

动力单元为蠕动泵，蠕动泵的进液口设置有负压接口；进样单元包括进样箱，进样箱上开设有进样孔；检测单元包括检测箱，检测箱上开设有检测孔，检测箱内设置有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜外包覆有亲和素；进样箱与检测箱之间通过第一微管连通，负压接口与检测箱之间通过第二微管连通。

所述第一微管和第二微管的管径均为1.5～2.5毫米。所述底板、第一微管以及第二微管均由聚苯乙烯制成。所述亲和素的包覆厚度为0.4毫米。所述进样箱的容量为50～200微升；进样孔、检测孔以及负压接口连通。

工作原理：将待检测物质和其他辅助试剂加入进样孔内，启动蠕动泵，则待检测物质和其他辅助试剂经过第一微管到达检测箱，待检测物质和其他辅助试剂被硝酸纤维素膜上的亲和素捕获，检测亲和素的信号强弱即可得到检测结果，阳性反应在检测孔呈现颜色反应，位置即为包被亲和素的点；蠕动泵的作用是为促进液体顺利流经检测孔，也可采用其他相同功能的装置进行代替。

实施例2

1.制作检测生物分子间互作的微流控芯片

根据图1微流控芯片的结构定制模具，尺寸：长×宽＝13×3厘米；材质为聚苯乙烯(ps)。进样箱尺寸：圆形，直径为1.5厘米，用于加样。检测箱与进样箱尺寸相同，检测箱内部固定长方形硝酸纤维素膜，长方形硝酸纤维素膜的尺寸：长×宽＝1.5×0.7厘米；检测箱与进样箱经第一微管道相连，第一微管道直径2毫米。检测箱上开设检测孔，检测孔中设置第二微管道，第二微管道向外延伸形成负压接口，负压接口连接上蠕动泵；第一微管道和第二微管道为模具制作，一次成型。

2.微流控芯片的应用

该微流控芯片可应用于基于免疫学反应的所有反应。目前商品化的生物素标记试剂盒可用于标记蛋白和抗体，合成适体也可采用生物素进行标记。生物素标记蛋白和抗体按照说明书进行。以下程序以生物素标记猪链球菌2型荚膜多糖蛋白cps为例(试剂盒：购自piece公司，货号21435)，阐述生物素标记cps蛋白过程和检测方法。

取原核表达纯化得cps蛋白3mg(1.5mg/ml)，按照说明书要求，生物素标记时的摩尔数应为待标记分子的20倍左右，计算出生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)用量约为73μl(6mg/ml)具体步骤：取1ml待标记蛋白cps浓度3mg/ml(溶剂为50mm磷酸盐缓冲液，ph7.4)；称取3mgsulfo-nhs-lc-biotin溶于500μl超纯水，配置浓度为6mg/ml的生物素溶液；取73μl配置的sulfo-nhs-lc-biotin溶液加入待标记的cps蛋白中，轻轻上下颠倒混匀，室温反应1h；结束后，经脱盐柱1000×g离心3min，去除反应的生物素分子，收集标记产物。

使用磷酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)稀释生物素标记的cps蛋白至2μg/ml，取25μl置于2mlep管中，然后加入25μl待检测的猪链球菌2型抗体，同时加入量子点标记的spa(也可以采用其他标记物)25μl，混匀反应3分钟后，将125μl反应液滴于微流控芯片的进样孔内，开启连接蠕动泵，使液体流动，最终反应液流入废液池内，该过程只需要5分钟。

根据不同的标记物，采用不同方式对检测结果进行检测、判定。如采用量子点或胶体金标记的第二种生物大分子，则通过肉眼即可对结果进行判定；若采用hrp标记，则需要进行显色反应，观察是否出现反应点。

在滴入进样孔中的反应样品中，生物素-cps蛋白偶联物的浓度为2μg/ml，待检测的猪链球菌2性抗体的检测下限线浓度为0.003μg/ml，商品化的携带标记的第二种生物大分子则根据生产商推荐，在本实施例中，量子点标记的spa使用浓度为0.0001μg/ml。

实施例3

与实施例1不同的是：微流控芯片的应用

2.微流控芯片的应用

以生物素标记的核酸为例，阐述检测方法：使用磷酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)稀释合成的生物素-核酸片段(杭州有康生物科技有限公司)至0.2μg/ml，取50μl置于2ml离心管中，然后加入50μl待检测小分子毒素(ota)，浓度为0.1ng/ml，同时加入50μlota特异性抗体(单克隆抗体，稀释倍数为1:20000)，再加入50μl量子点标记的二抗(qds-抗鼠抗体，稀释倍数为1:10000)，室温反应3分钟后，将150μl反应液滴于微流控芯片中的进样孔；打开蠕动泵，反应液体从进样孔流向检测孔，最终反应液全部流入废液池内，该过程操作简单。

在滴入进样孔的反应液中，生物素标记的核酸浓度为0.2μg/ml，ota检测下限浓度为0.1ng/ml，ota单克隆抗体的浓度为0.1ng/ml，商品化的qds抗鼠抗体的浓度为0.5μg/ml。

实施例4

与实施例1不同的是：微流控芯片的应用

2.微流控芯片的应用

以生物素标记黄曲霉毒素afb1单克隆抗体为例，阐述检测方法。以下程序以生物素标记afb1单克隆抗体为例(试剂盒：购自piece公司，货号21435)，阐述生物素标记afb1单克隆抗体过程和检测方法。

取纯化后的afb1单克隆抗体3mg(1.5mg/ml)，按照说明书要求，生物素标记时的摩尔数应为待标记分子的20倍左右，计算出生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)用量约为73μl(6mg/ml)具体步骤为：取1ml待标记抗体浓度3mg/ml(溶剂为50mm磷酸盐缓冲液，ph7.4)；称取3mgsulfo-nhs-lc-biotin溶于500μl超纯水，配置浓度为6mg/ml的生物素溶液；取73μl配置的sulfo-nhs-lc-biotin溶液加入待标记的抗体蛋白中，轻轻上下颠倒混匀，室温反应1h；结束后，经脱盐柱1000×g离心3min，去除反应的生物素分子，收集标记产物。

磷酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)稀释生物素标记的抗体至0.1μg/ml，取50μl置于2mlep管中，然后加入50μlafbi小分子毒素(浓度为0.05ng/ml)，再加入能与毒素反应的fitc标记的核酸适体(浓度0.05μg/ml)，室温反应3分钟。

将125μl反应样品滴于微流控芯片的进样孔内。启动蠕动泵，反应液从进样孔流向检测孔，最终反应液全部流出废液池内。

在待检测的反应液中，生物素标记的抗体浓度为0.1μg/ml，待检测的afb1检测下限为0.001ng/ml，fitc标记的核酸适体浓度0.05μg/ml。

本实用新型不局限于上述可选实施方式，任何人在本实用新型的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本实用新型权利要求界定范围内的技术方案，均落在本实用新型的保护范围之内。