一种基于S抗原的新型冠状病毒2019-nCoV抗体快速检测试剂盒的制作方法

本实用新型属于临床医学检测领域，涉及免疫层析检测技术，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体的快速检测试剂盒。

背景技术：

新型冠状病毒是一种可引起人肺炎/肺部感染的新的冠状病毒，它与已知可引起感冒、严重急性呼吸综合症(sars)和中东呼吸综合症(mers)同属一个冠状病毒家族，世界卫生组织(who)已将其命名为2019新型冠状病毒，即2019-ncov。

2019-ncov是一种以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，感染人体后可引起发热，咳嗽、气粗和呼吸困难等呼吸道症状，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合症、肾衰竭、甚至死亡。目前对新型冠状病毒感染所致疾病尚无特效治疗药物。2019-ncov自发现以来以较快的速度在人群传播。对新型冠病毒的防控党中央及各级政府高度重视，全国各个省市政府启动了重大突发公共卫生事件一级响应。虽然全国已形成了一个严密的联防联控体系，但仍然无法阻挡病毒的快速传播，因为面对新型冠状病毒，人们对其了解甚少，还有很多未知的情况。从目前临床检测确诊和收治患者情况来看，多数患者症状较轻，重症和危重患者比例较小，致死率也不高，甚至有些密切接触这病毒核酸检测阳性，但没有任何临床症状，这一现象提示人群中可能还存在不少潜伏期病毒感染者，这些潜伏感染者可能是一批更危险的传染源，给病毒防控带来了新的挑战。另外香港大学微生物系教授袁国勇在1月24日国际权威医学期刊《柳叶刀》发表论文，对一个家庭新型冠状病毒聚集性感染流行病学及临床症状进行了研究，其研究结果提示，此次新型冠状病毒肺炎症状并不是“特定”的。因此，该论文作者认为针对此次新型冠状病毒肺炎疫情，除了要及早隔离发热者，也要及早追踪并隔离“接触者”，因为肺部感染病变却没有症状的病人是可能存在的，这些没有症状的感染者可能会成为疫情扩散的一个来源。

自2019年新型冠状病毒肺炎出现以来，全社会高度关注，复旦大学张永振教授团队争分夺秒第一时间分析了“新型冠状病毒”的基因数据，并将数据放在美国国家生物技术信息中心上共享。国内已有多家实验室和公司依靠已公开的新型冠状病毒基因数据设计研发出了荧光pcr新型冠状病毒核酸检测试剂盒，用于此次疫情防控中病毒感染诊断和疗效评价，为疫情的防治提供了有效的技术手段。

此次引发疫情的新型冠状病毒是之前没有出现过的，人类对其认知还是相当有限的，因此，在此次疫情防控中应认清新型冠状病毒肺炎与当年sars疫情的不同之处，在当年sars防控经验的基础上根据新型冠状病毒肺炎的临床表现特征，制定更加完善的防控策略，更加有效的控制疫情扩散。在体温检测和病毒核酸检测的基础上，应更加关注“接触者”的追踪、检测和隔离措施。由于受检测条件和技术限制，荧光pcr病毒核酸检测当前仅限于发热等临床症状明显疑似感染者的检测诊断，和临床疗效评价，尚不适应“接触者”的追踪检测。因此，此次疫情防控急需一种可适用于“接触者”筛查及无临床症状病毒感染者检测诊断的快速、简便、可现场使用的新型冠状病毒感染检测诊断技术及试剂产品。

冠状病毒属尼多病毒目冠状病毒科，主要分为α属冠状病毒、β属冠状病毒、γ属冠状病毒以及δ属冠状病毒。各种属的冠状病毒具有类似的基因组成，其基因组为单股正义rna病毒，通常大小为27～31kb，5’utr具有帽子结构，3’utr具有polya结构，5’端编码2个大的复合蛋白orf1a和1b，占全基因组的2/3，剩余1/3靠近3’端的基因组主要编码结构蛋白，包括纤突蛋白(spike，s)、膜蛋白(membrane，m)、核蛋白(nucleocapsid，n)和包膜蛋白(envelop，e)。冠状病毒的s蛋白是一个在病毒表面呈三聚体状态的跨膜糖蛋白，主要负责识别结合细胞，在介导病毒和受体结合进入宿主细胞起着非常重要的作用。新型冠状病毒的纤突蛋白(spike，s)包含1273氨基酸，理论大小为141.1kda。本实用新型以新型冠状病毒s蛋白为靶标，采用基因工程技术原核表达s蛋白，结合免疫层析技术研制一种新型冠状病毒感染快速检测技术，并研制相关试剂盒产品。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种测定新型冠状病毒抗体(igm/igg)的试剂盒，该试剂盒采用“双抗原夹心法”，具有灵敏度高、特异性强，检测速度快、操作简便，无需专门设备，可适用于疑似感染者咽喉部棉拭子样本新型冠状病毒抗原检测。检测过程简单，不需要任何设施设备，现场或家庭即可完成检测，3-5分钟出检测结果，检测结果可人工直接读取。该技术是对当前病毒核酸检测技术的一种补充，可有效提高疫情防控效果。该试剂盒可适用于“接触者”筛查及无临床症状病毒感染者检测诊断。

本发明的主要内容如下。

一种基于s抗原的新型冠状病毒2019-ncov抗体快速检测试剂盒，其特征在于：由卡盒和检测条两部分组成；检测条的衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标垫，在检测层上包被有检测线和质控线；在加样端吸水纸层与检测层的交接部位，夹贴金标垫的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层中间，1/5部分在纤维素膜层上，按照4毫米宽、7厘米长规格切条；将检测条组装于塑料盒内形成检测卡，盒盖上加样孔正对测试条的加样端吸水纸层，观察孔正对纤维素膜的检测层。

下面对本实用新型进行详细阐述。

本实用新型的新型冠状病毒s抗原，主要是依据已公开的新型冠状病毒基因序列数据s蛋白基因序列进行优化，合成病毒特异性s抗原基因，构建大肠杆菌e.coli原核表达载体，诱导表达，并对表达蛋白进行结构复性和纯化。

下面将详述本实用新型制备新型冠状病毒s抗原的方法。

从genbank获取新型冠状病毒s蛋白基因序列，人工合成新型冠状病毒s蛋白基因序列并进行密码子优化。目的基因经双酶切后与经同样双酶切的原核表达载体连接，转化感受态细胞(大肠杆菌)、筛选阳性重组菌。阳性克隆菌提取质粒、双酶切和测序鉴定，证明插入的目的基因正确。重组菌经iptg诱导表达、离心得重组菌菌体，菌体重悬于缓冲液后超声裂解，离心获得包涵体形式的的蛋白沉淀，经洗涤后溶于尿素溶液。变性蛋白需要经过结构复性与纯化才能获得天然蛋白的免疫反应原性和达到新型冠状病毒抗体检测的应用标准。

对于新型冠状病毒s蛋白包涵体复性方法，可应用透析法、梯度稀释法、凝胶层析法等，优选透析法和梯度稀释法相结合的方法，因为它们易于控制，蛋白复性率高。

对于包涵体复性后新型冠状病毒s蛋白基因序列的纯化方法，可应用凝胶层析、亲和层析等，优选凝胶层析法，因为它最易于控制，收率高。

通过基因重组获得的新型冠状病毒s抗原具有较高的特异性和敏感性。

对于快速测定抗体的方法，这里列举的是优选的方法，如应用各种标记抗体的免疫层析测定，应用各种标记抗体的免疫渗滤法等。

下面详述免疫层析测定方法。

新型冠状病毒抗体免疫层析测定方法包括下述步骤：新型冠状病毒s抗原固定到固相载体1上，标记抗原固定到固相载体2上，待测样品中的抗体(igm和igg)与标记抗原接触，若待测样品中存在新型冠状病毒抗体，则新型冠状病毒抗体与标记抗原反应形成抗体-标记抗原复合物，该“复合物”在固相1上水平移动，与固定到载体1上的新型冠状病毒s抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固相载体上固定抗原的位置就会有显色反应；若待测样品不含新型冠状病毒抗体，则“复合物”不能被固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据固相载体上固定抗原位置是否有显色反应，来判断待测样品中是否存在抗新型冠状病毒抗体。

对于固相载体1，可应用例如硝酸纤维素膜(nc膜)、pvdf膜等。优选硝酸纤维素膜。

对于固相载体2，可应用例如玻璃纤维素膜，无纺布等任何一种形式。优选无纺布作结合物释放垫，因为它最易于控制。

本实用新型的有益效果：

(1)本实用新型包括新型冠状病毒s抗原的优化表达，合成了优化的s抗原基因序列，这一序列的表达效率更高，特异性更强。而且本发明还探索出了一套完整的包涵体抗原纯化和复性的方法，制备出的抗原收率高，免疫原性高。

(2)本实用新型制备了一种一步法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒。该试剂盒检测新型冠状病毒的igg或igm抗体，利于确证感染阶段。

(3)本实用新型还可以直接检测全血样本，在检测卡上有滤血膜，可以用少量全血样本检测。

因此，本实用新型可以通过一次取样一步法全血检测新型冠状病毒的感染，通过检测病毒特异性抗体igm可以对病毒早期感染者和“接触者”中病毒潜伏期感染者做出诊断，通过检测病毒特异性抗体igg可以对病毒感染无临床症状患者做出诊断，可适用于“接触者”人群无临床症状者筛查。

附图说明

图1，显示了本实用新型试剂—检测卡的外观结构示意图

1-检测板；2-加样孔；3-检视窗

图2，显示了本实用新型试剂—检测条的外部结构示意图

4-加样端吸水纸层；5-金标垫；6-控制线；7-检测线；8-检测层；9-吸水端吸水层；10-衬板

具体实施方式

实施例1一种基于s抗原的新型冠状病毒2019-ncov抗体igg/igm金标快速检测试剂盒的制备

上述所得到基因重组新型冠状病毒s抗原作检测抗原，在硝酸纤维素膜包被检测线，参照图2，制备新型冠状病毒抗体金标快速检测试剂，其组成成分包括：在衬板(10)上设有加样端吸水层(4)、检测层(8)和吸水端吸水层(9)，在检测层(8)和加样端吸水层(4)之间设有金标垫(5)，在检测层(8)上包被有检测线(7)和质控线(6)。其中加样端吸水层(4)和吸水端吸水层(9)由多层滤纸制成：检测层(8)为硝酸纤维素膜；金标垫为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗原。

检测试剂制备程序包括：制备金标垫(5)，质控线(6)、检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合金标测试条，在衬板(10)的两端分别粘贴加样端吸水纸层(4)与吸水端吸水层(9)；在其中段粘贴包被检测线(7)和质控线(6)的检测层(8)，在加样端吸水纸层(4)与检测层(8)的交接部位，夹贴金标垫(5)的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层(4)中间，1/5部分在纤维素膜层(8)上。然后按照4毫米宽、7厘米长规格切条。再参照图2，将检测条组装于塑料盒内形成检测卡，盒盖上加样孔(2)正对测试条的加样端吸水纸层(4)，观察孔(3)正对纤维素膜的检测层(8)。

上述的金标垫的制备方法包括下述步骤：a.胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，煮沸15分钟，可得到直径为15-50纳米的胶体金颗粒溶液；b.胶体金标记新型冠状病毒s抗原，取100ml胶体金溶液，用0.2m碳酸钾溶液调ph为8.4，加入1mg新型冠状病毒s抗原，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白(bsa)，继续搅拌5分钟，4℃静置2-4小时；c.将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，去沉淀，得到上清；d.将上清液经10000转/分钟离心60分钟得到沉淀；e.将沉淀溶于4ml0.02mph7.4的tris-hcl缓冲液得到胶体金溶液，该溶液中含有0.25％bsa和0.02％叠氮钠；f.将胶体金溶液浸入玻璃纤维或者无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥2小时形成金标垫5。

所述的检测层(8)是在硝酸纤维素膜上设有重组新型冠状病毒s抗原构成的检测线(7)和由羊或兔抗鼠igm/igg抗体形成的质控线(6)。将重组新型冠状病毒s抗原调浓度为1.5mg/ml，加入2％的甲醇，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线(7)；再取羊或兔抗鼠igm/igg抗体调浓度为1.5mg/ml，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，喷涂质控线(6)，按2μl/cm设置喷膜量，喷膜后置于37℃干燥2小时，再用0.01mlph7.0的含10％小牛血清的pbs在37℃下封闭30分钟，0.01mlph7.0的pbs漂洗，45℃干燥。

检测方法及结果判定：取样品稀释液(0.01m/lph7.2pbs)300μl加入一种带过滤功能的特制样品管中，将咽喉采集的棉拭子或痰液拭子浸入样品管稀释液中，沿管壁不断搅拌挤压，使拭子中的病毒抗原尽量容入稀释液中，取出棉拭子，给样品管加过滤盖，倒置样品管，滴2滴约100μl于加样孔，同时将样本编号填写在盒盖正面信息记录栏，开始观察结果，观察检视窗处质控线c和检测线t是显色状况，20分钟内有效。若质控线c和检测线t均显紫红色，则结果为阳性；若只有质控线c显紫红色，检测线t不显色，则结果为阴性；若质控线c和检测线t均不显色，则结果无效。气管灌洗液样本可直接取100μl加入加样孔，按上述程序观察和判读结果。

本实施例所述试剂盒适用于咽喉拭子、痰液、口腔唾液及气管灌洗液样本检测。

实施例2一种基于s抗原的新型冠状病毒2019-ncov抗体igg/igm乳胶免疫层析快速检测试剂盒

该试剂盒的组成结构金标垫(5)由彩色乳胶垫代替外，其他条件与实施例1相同，所述彩色乳胶垫除了所用标记物为彩色乳胶外，其制备方法同金标垫。适用样本、样本制备方法和加样量，结果判定也同实施例1。

实施例3一种基于s抗原的新型冠状病毒2019-ncov抗体igg/igm荧光微球免疫层析快速检测试剂盒

该试剂盒的组成结构金标垫(5)由荧光微球垫代替外，其他条件与实施例1相同，所述荧光微球垫除了所用标记物为荧光微球外，其制备方法同金标垫。其样本制备方法及加样量与实施例1相同。结果判读：用手持荧光灯照射观察检视窗内反应膜，观察检视窗处质控线c和检测线t是显示荧光反应状况，20分钟内有效。若质控线c和检测线t均显紫色荧光，则结果为阳性；若只有质控线c显紫色荧光，检测线t不显色，则结果为阴性；若质控线c和检测线t均不显色，则结果无效。