2019-nCoV新型冠状病毒快速检测免疫层析试纸条的制作方法

本实用新型属于医疗器械领域，具体涉及一种2019-ncov新型冠状病毒快速检测免疫层析试纸条。
背景技术：
：2019新型冠状病毒，即"2019-ncov"，2020年1月12日被世界卫生组织命名。和2003年的sars冠状病毒以及2012年的mers冠状病毒同属于冠状病毒科β属。2019-ncov与2003年"非典"sarscov比对，有约70％序列相似性，与merscov有40％的序列相似性。目前没有特异治疗方法，但许多症状是可以处理的，需根据患者临床情况进行治疗。2019-ncov每个病例必须采集急性期呼吸道标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽吸物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本等)和血液样本。呼吸道标本主要用于进行核酸检测和抗原检测，血清样本主要用于进行2019-ncov病毒特异性抗体igm或igg检测。其中，特异性抗体igm是最初体液免疫应答中最早出现的抗体，约一周出现。血液中检测到特异性抗体igm提示新近发生感染，可用于早期诊断。特异性抗体igg是再次免疫应答产生的主要抗体，于2-4周达到高峰，是机体抗感染的主力军。因为发热病人基数庞大，要确诊疑似病人是否感染了2019-ncov新型冠状病毒，要对疑似病例进行检测。首先研发成功并投入使用的是2019-ncov新冠状病毒核酸检测试剂盒，但其检测至少需要40分钟，而且核酸检测仪器通量比较小，远远不能满足医院门诊大量疑似病例的检测需求。并且核酸检测对实验室设备和操作人员的专业要求也很高，在基层医院无法实现。免疫层析试剂因其操作简便，对实验室设备和操作人员的专业要求较低，检测时间只需要10～15min，非常适合门诊或发热急诊对病人进行初步筛查并及时分流，以及对基层医院、社区的样本初步检测。面对目前严峻的防疫形式，不但需要特异、准确的检测手段，还需要一种更简便快捷且阳性检出率较高的试剂来筛查2019-ncov新型冠状病毒，尽早把病人以及疑似病人隔离并进行对症治疗，避免疫情的迅速蔓延。技术实现要素：本实用新型的目的之一是提供一种2019-ncov新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，用于对2019-ncov新型冠状病毒进行快速有效检测，阳性检出率高，可同时测出2019-ncov病毒的特异性抗体igm和igg。实现上述目的的技术方案如下。一种2019-ncov新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫顺次相互搭接地粘结在底板上，所述结合垫上喷涂有2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物和羊抗鸡igy抗体-荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上设有包被抗人μ链抗体的第一检测线和包被抗人igg抗体的第二检测线、以及包被鸡igy的对照线，所述第一检测线、第二检测线、对照线之间相互间隔。在其中一些实施例中，所述对照线靠近所述吸水垫，所述包被抗人igg抗体的第二检测线位于包被抗人μ链抗体第一检测线和包被鸡igy的对照线之间。在其中一些实施例中，所述对照线靠近所述吸水垫，所述包被抗人μ链抗体第一检测线位于包被抗人igg抗体的第二检测线和包被鸡igy的对照线之间。第一检测线与第二检测线的位置可以互换，在本申请中，最优选为所述包被抗人igg抗体的第二检测线位于包被抗人μ链抗体第一检测线和包被鸡igy的对照线之间。该设计有利于igm的快速和高灵敏度的检测，阳性检出率较高。在其中一些实施例中，所述第一检测线与第二检测之间、对照线与第一检测线或第二检测线之间的间距分别为2～7mm。进一步地，在其中一些实施例中，所述第一检测线和第二检测线之间间隔为2.5～3.5mm，所述对照线与最近的检测线和对照线之间间隔为3.5～4.5mm。在其中一些实施例中，所述荧光标记物为荧光胶乳微球，可以发射的波长范围是180nm～800nm。荧光胶乳微球含有荧光素，在基态下是稳定的，在激发光源的作用下能够发射不同波长范围的荧光。在其中一些实施例中，所述荧光标记物为所述荧光微球，所述荧光微球为近红外ii区高分子荧光微球。进一步优选地，所述试纸条的宽度为4-7mm，所述抗人μ链抗体的浓度为0.5～2mg/ml，包被量为80-100μl，所述抗人igg抗体的浓度为0.5～2mg/ml,包被量为80-100μl，所述鸡igy的浓度为1～1.5mg/ml，在所述对照线的包被量为80-100μl。所述试纸条的宽度为4-7mm，所述2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物中，所述2019-ncov重组结构蛋白的浓度为0.1～1.5mg/ml，所述2019-ncov重组结构蛋白与荧光标记物的质量用量比为1：5-8；所述荧光标记物标记的2019-ncov重组结构蛋白在所述结合垫上的包被量为100-120μl。进一步优选地，在一些实施例中，所述免疫层析试纸条的宽度为4-7mm，抗人μ链抗体的浓度为1.0-1.2mg/ml,包被量为80-100μl，抗人igg抗体的包被量为0.8-1.2mg/ml，包被量为80-100μl。所述鸡igy的浓度为1～1.5mg/ml，在所述对照线的包被量为80-100μl。在一个实施例中，所述免疫层析试纸条的宽度为4-7mm，所述2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物中，2019-ncov重组结构蛋白的浓度为1～1.5mg/ml，所述2019-ncov重组结构蛋白与荧光微球的质量用量比为1:5-8，所述荧光微球标记的2019-ncov重组结构蛋白在所述结合垫上的包被量为100-120μl。本实用新型的另一目的是提供一种2019-ncov新型冠状病毒免疫层析检测卡。实现上述目的的技术方案如下。一种2019-ncov新型冠状病毒免疫层析检测卡，包括塑料外壳和组装在塑料外壳内的上述2019-ncov新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，所述塑料卡壳是由塑料上壳和塑料下壳扣合而成，所述塑料上壳设有加样孔和显示窗，所述加样孔对应于所述试纸条的样品垫，所述显示窗对应于所述试纸条的第一检测线、第二检测线及对照线。本实用新型所述试纸条运用捕获法同时检测2019-ncov病毒特异性抗体igm和igg，当待检测的样品(包括血清或者血浆或全血)加载样品垫上，若样品中有2019-ncov病毒特异性抗体igm或igg，则其与结合垫中的2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物结合，形成igm或igg-2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物的结合物，其与羊抗鸡igy抗体-荧光标记物一起通过毛细作用向前层析当达到检测区，结合物再分别与检测线上固定的抗人μ链抗体和抗人igg抗体结合，形成荧光标记物-抗体-抗原-抗抗体复合物并被固定在检测线上，而羊抗鸡igy抗体-荧光标记物继续向前层析，与固定在对照线上的鸡igy结合。反应10min后，插入配套检测仪器读取荧光信号。荧光信号与待测物浓度呈正相关。与现有技术相比，本实用新型主要具有以下有益效果：(1)本实用新型所述2019-ncov新型冠状病毒检测免疫层析试纸条操作简便，对实验室设备和操作人员的专业要求较低，无需更多处理设备，无需对医护人员再次进行专业的技能培训，大大释放了医院、医护人员的压力，给病人快速检测实现便利方法。(2)检测时间较短，只需10～15min即可以完成检测。(3)产能高，能短期内大量供给医院、社区使用，可用于2019-ncov病毒患者的大规模初筛。(4)本实用新型所述2019-ncov新型冠状病毒检测免疫层析试纸条可配合全自动荧光免疫分析仪使用，实现全封闭检测，避免产生气溶胶，降低感染风险。本实用新型所述2019-ncov新型冠状病毒检测免疫层析试纸条能够快速检测病人的特异性抗体igm和/或igg检测，具有快速，准确，阳性检出率高的优点，适合当前用于快速检测并及时遏制2019-ncov新型冠状的传播蔓延，并使病人得到对症治疗。附图说明图1为本实用新型实施例1的荧光免疫层析试纸条的结构示意图；附图标记：1、样品垫；2、结合垫；3、包被膜；4、吸水垫；5、第一检测线；6、第二检测线；7、对照线；8、底板。具体实施方式本实用新型为了便于理解本实用新型，下面将对本实用新型进行更全面的描述。本实用新型可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本实用新型公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本实用新型所使用的所有的技术和科学术语与属于本实用新型的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本实用新型的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本实用新型。本申请实施例的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。在本文中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。实施例12019-ncov新型冠状病毒快速检测免疫层析试纸条本实施例的所述2019-ncov新型冠状病毒快速检测免疫层析试纸条，包括底板8、以及依次设在所述底板8上的样品垫1、结合垫2、包被膜3和吸水垫4(吸水纸)，所述结合垫2上包被有2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物和羊抗鸡igy抗体-荧光标记物，所述包被膜3包括平行设置、且相互间隔的第一检测线5、第二检测线6和对照线7，所述第一检测线5包被有抗人μ链抗体，第二检测线6包括有抗人igg抗体，所述对照线7包被有鸡igy。本实施例中，所述第二检测线6在第一检测线5和对照线7之间。参见图1。本实施例中，所述包被膜3为化学交联结合有聚碳酸酯与聚苯乙烯丙烯腈(聚合物)的硝酸纤维膜，所述聚碳酸酯与聚苯乙烯丙烯腈聚合物在小于450nm波长具有10％以下透光率，在500nm波长以上具有95％以上的透光率的材料。这种材料可以允许绝大多数的可见光透过，光检测器能够捕捉多层多孔膜表面和内部的荧光信号，使检测结果更准确。所述结合垫2为聚酯膜，其能够载有足量的荧光微球，且遇样品后又能迅速释放微球。本实施例中，所述荧光微球选用近红外ii区羧基聚苯乙烯荧光微球。本实施例中，所述2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物中，2019-ncov重组结构蛋白的浓度为1.0mg/ml，所述2019-ncov重组结构蛋白与荧光微球的质量比为1：7.5，所述荧光微球标记的2019-ncov重组结构蛋白在所述结合垫上的包被量为100μl。所述羊抗鸡igy抗体-荧光标记物中，所述羊抗鸡igy抗体与荧光微球的质量比为1：6，其余与所述2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物相同。在该实施例中，所述第一检测线5靠近所述结合垫2，所述对照线7靠近所述吸水垫4，所述第二检测线6在第一检测线5和对照线7之间，所述第一检测线5、第二检测线6的间隔为0.25cm，第二检测线6和所述对照线7的间隔为0.40cm。所述试纸条的宽度为4mm。本实施例的试纸条制备方法包括以下步骤：(1)样品垫浸泡在样品垫缓冲中(1％bsa，2％tritonx-100,2％pvp40,20mmtris-hcl，50mmnaac)处理1h，然后在37℃真空干燥箱中干燥过夜处理。按常规方法标记好的2019-ncov重组结构蛋白-荧光标记物和羊抗鸡igy抗体-荧光标记物通过免疫层析专用喷头喷散在样品垫上制作成结合垫，然后50℃干燥10h备用。(2)抗人μ链抗体(1.2mg/ml，90μl)和抗人igg抗体(1.0mg/ml，90μl)以及鸡igy(1.5mg/ml,100μl)溶液通过定量喷膜仪均匀地喷散在硝酸纤维素膜上，分别形成检测线(t1线)和(t2线)和对照线(c线)，50℃烘箱中过夜处理。或者是在包被膜的不同位置分别固定抗人μ链抗体、抗人igg抗体和鸡igy，形成两个检测线以及对照线；具体为：使用含有1％蔗糖的0.01mol/l的ph为7.2的磷酸盐缓冲液，分别将抗人μ链抗体、抗人igg抗体和鸡igy稀释到1.0-1.5mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以4ul/cm将三者按照设计好的间隔和用量喷于硝酸纤维素膜上，50℃烘干1h，加入干燥剂封存备用。(3)在底板上依次相互交错的黏贴上样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，然后切割成宽度为0.4cm大小。其中吸附垫与硝酸纤维膜、硝酸纤维膜与结合垫、结合垫与样品垫相互叠置，使其紧密接触，保证检测过程中液流顺利。最后，组装好的试纸条通过免疫层析试纸切割机切割成4mm大小，得到2019ncov新型冠状病毒快速检测免疫层析试纸条，并将其保存在密封的铝质包装袋中保存。(4)进一步，将所述试纸条装配成检测卡，所述试纸条外还设置在温度(18～26)℃、湿度≤30％的环境下进行装配；将粘贴好的大板切成4mm宽的试纸条，装入塑料卡壳内，所述塑料卡壳是由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳，所述试纸条组装于所述塑料外壳中得检测卡，所述塑料上壳设有加样孔和显示窗，所述加样孔对应于所述试纸条的样品垫，所述显示窗对应于所述试纸条的对照线、检测线。将每一检测卡置于铝膜袋中，加入干燥剂1包，热合封口备用。本实施例的2019-ncov新型冠状病毒快速检测免疫层析试纸条在使用时，血液样本浸入到样品垫上，当样品垫上的样本达到饱和状态后，通过毛细管作用将样本输送到结合垫。当血液样本中含2019-ncov病毒特异性抗体igm和igg时，其与荧光微球上的2019-ncov重组结构蛋白形成抗原-抗体复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达包被识别特异性抗体的检测线处，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，聚集在两检测线处。羊抗鸡igy抗体-荧光标记物继续前行，到达对照线时，鸡igy与荧光微球上的羊抗鸡igy抗体结合。整个反应在10分钟内完成，并进行上机读卡。在激发光源下产生的荧光强度与试纸条上的结合物含量成正比，当光源照射到试纸条的检测区和对照区时，激发附着的荧光物质，发射光收集并转化为电信号，电信号的强弱和荧光分子数量相关，检测仪计算样品中待测物的含量。实施例2本实施例所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条的制备与实施例1相同，不同的是检测特异性抗体igm与特异性抗体igg的检测线的位置对调，即第一检测线在第二检测线与对照线之间。实施例3本实施例所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条的制备与实施例1相同，不同的是检测所述特异性抗体igm的第一检测线5、检测特异性抗体igg的第二检测线6的间隔为常规的3.5mm，特异性抗体igg检测线6和所述对照线7的间隔为4.5mm。实施例4本实用新型的所述试纸条的临床样本测试从某省疾病预防控制中心中选出经基因测序和临床肺部ct确诊的2019-ncov新型冠状病毒患者30例，以健康人血清样本(标准是：身体无任何临床症状，无传染病接触史、感染史，肺部ct检测正常)30例做对照，使用本实用新型实施例1至实施例3的检测试纸条进行测试，结果如表1-表3所示。表1实施例1所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条检测结果阳性阴性试纸条中igm2535试纸条中igg2535试纸条igm+igg213130例阳性样本中，应用本实用新型实施例1所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条，其中，特异性抗体igm阳性的，出现25例，这25例中，有21例还出现了特异性抗体igg阳性。在未出现特异性抗体igm阳性的5例中，特异性抗体igg阳性的有4例。综合计算，总阳性率达到96.6％。可见，本实用新型所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条的阳性检测率非常高。在30例正常样本中，特异性抗体igm和特异性抗体igg都为阴性。表2实施例2所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条检测结果阳性阴性试纸条中igm2337试纸条中igg2634试纸条igm+igg213230例阳性样本中，应用实施例2所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条进行检测，其中，出现23例特异性抗体igm阳性，这23例阳性中，有21例还出现了特异性抗体igg阳性。而在未出现特异性抗体igm阳性的7例中，特异性抗体igg阳性的有5例，即特异性抗体igm和特异性抗体igg都为阴性的共2例。综合计算，总阳性检出率达到93.3％。在30例正常样本中，特异性抗体igm和特异性抗体igg都为阴性，本实用新型所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条的特异性非常好。从与表1的检测结果来看，实施例1所述试纸条的检测效果优于实施例2所述的试纸条，当然，上述结果也可能与阳性样本的两种抗体的浓度相关，结合特异性抗体igm检测线和特异性抗体igg检测线的位置有变化，导致实施例2所述试纸条中的检测效果不如实施例1所述试纸条。表3实施例3所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条检测结果阳性阴性试纸条中igm2337试纸条中igg2436试纸条igm+igg203330例阳性样本中，应用实施例3所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条进行检测，其中，出现23例特异性抗体igm阳性，这23例阳性中，有20例还出现了特异性抗体igg阳性。而在未出现特异性抗体igm阳性的7例中，特异性抗体igg阳性的有4例，即特异性抗体igm和特异性抗体igg都为阴性的共3例。综合计算，总阳性检出率达到90％。在30例正常样本中，特异性抗体igm和特异性抗体igg都为阴性。从以上检测结果发现，实施例1所述的试纸条的检测效果最好。实施例5本实用新型的试纸条的临床样本跟踪测试采用本实用新型实施例1的试纸条对与2019-ncov新型冠状病毒患者有密切接触的20例的疑是患者样本(样本编号cov-n1-cov-n20)进行2周的跟踪检测。试纸条为本实用新型实施例1所述2019-ncov新型冠状病毒检测试纸条，检测样本为血清。基因检测：荧光pcr，样本为痰咽拭子。临床症状：不明原因乏力，发烧，干咳，咳嗽，痰少，胸闷，严重时会出现呼吸困难等。肺部ct阳性：开始时实变区域开始吸收，密度减低，逐渐成为磨玻璃密度影，累及1个或多个肺叶，严重时为白色实变的影像。表1可疑患者的跟踪检测从表3结果可以看出，本实用新型的所述检测试纸条具有很好的特异性。最终以阳性确诊的cov-n.1、cov-n.5、cov-n.13、cov-n.18的4例样本中，显示本实用新型的所述检测试纸条具有很好的灵敏度。pcr基因检测在前期出现假阴性，可能与样本取材不当或者是患者临床症状不明显，导致取样量不够有关。本实用新型所述试纸条的检测对象是血液，不必受取样限制。而且，通过igm出现的时间早，随后出现igg，病程不同阶段，个体不同会有差异，测总抗体可以确保不漏掉各个阶段的病人，能及时监控各个阶段的病人，从而使医护人员能结合其它检验方法和临床判断及早确诊或采取治疗或隔离措施，对疫情的预防和控制有着积极的意义。此外，本实用新型所述试纸条对病程早期具有很好的检测效果，考虑到igg后期出现的浓度，实施例1所述试纸条中的特异性igm检测线和特异性igg检测线的设置，配合经过优化的合适制备参数，适合当前的2019-ncov新型冠状病毒检测和疫情控制。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12