新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸及装置的制作方法

本申请属于生物应用技术领域，更具体地说，是涉及一种新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸及装置。

背景技术：

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（sars-cov-2或2019-ncov）是一种包膜的正义单链rna病毒，该病毒导致了2019年冠状病毒病（covid-19）在人类中的传播。sars-cov-2具有几种结构蛋白，其包括刺突（s）、包膜（e）、膜（m）和核衣壳（n）。其中，刺突蛋白包含一个受体结合域（rbd），负责识别细胞表面受体血管紧张素转化酶2（ace2）。研究发现，sars-cov-2刺突蛋白的rbd与人体ace2受体强烈相互作用，进而导致肺内部宿主细胞的内吞和病毒复制。sars-cov-2感染会引发免疫反应，其中包括在血液中产生抗体。部分分泌的抗体可防止病毒感染，它们会在感染后的人体循环系统中存在数月，并且会与病原体迅速牢固结合，从而阻止细胞浸润和复制，这些抗体被称为中和抗体。

新冠肺炎康复患者体内及疫苗注射后诱导产生的中和抗体被认为：在新冠病毒再次入侵时能够识别出病毒的刺突蛋白并阻止病毒感染。因此，中和抗体的检测能够判断人们是否具备这种预防病毒感染的能力，同时有助于疫苗产品的开发及评价。现有针对新冠中和抗体的检测方法包括酶联免疫、化学发光等检测手段，该两种方法已有对应的试剂盒上市。但是，试剂盒的检测操作较为复杂且耗时较长，并不适合大规模疫苗注射效果的伴随诊断。

技术实现要素：

本申请实施例的目的在于提供一种新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸，以解决现有试剂盒的检测操作复杂、耗时长且不适合大规模伴随诊断的技术问题。

为实现上述目的，本申请采用的技术方案是：提供一种新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸，其包括基板和设置于所述基板上的样品垫、胶体金垫、nc膜、吸样垫；其中：

所述样品垫、胶体金垫、nc膜、吸样垫依次连接；

所述胶体金垫上设置有胶体金标记的新冠病毒重组抗原和胶体金标记的鸡igy抗体；

所述nc膜上设置有检测线t1、检测线t2和质控线，所述检测线t1为包被在所述nc膜上的鼠抗人igg抗体，所述检测线t2为包被在所述nc膜上的人ace2蛋白，所述质控线为包被在所述nc膜上的羊抗鸡抗体；

所述检测线t2、所述检测线t1和所述质控线沿所述胶体金垫至所述吸样垫的方向依次平行且间隔布置。

在一个实施例中，所述新型冠状病毒特异性抗体为igg抗体、igm抗体、igm+igg抗体、iga抗体、igg+iga抗体或总抗体。

在一个实施例中，所述样品垫、所述胶体金垫、所述nc膜和所述吸样垫均粘贴于所述基板上。

在一个实施例中，所述胶体金垫压接于所述nc膜的下边缘，所述样品垫压接于所述胶体金垫的下边缘，所述吸样垫压接于所述nc膜的上边缘。

在一个实施例中，所述基板为pvc板。

在一个实施例中，所述样品垫为玻璃纤维膜或无纺布，所述吸样垫包括依次层叠设置的至少两层吸水滤纸。

在一个实施例中，所述联合检测试纸还包括手柄纸，所述手柄纸连接于所述吸样垫。

本申请提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸，利用sars-cov-2刺突蛋白的rbd和hace2之间的蛋白质相互作用可被针对rbd的中和抗体阻断的原理，加样后，样本中存在的中和抗体将与rbd标记的胶体金结合，并阻止rbd与hace2之间的蛋白质相互作用，而未与中和抗体结合的rbd标记的胶体金以及与非中和抗体结合的rbd标记的胶体金，将在检测线t2上被hace2蛋白捕获。样本中存在的抗新冠病毒igg抗体与胶体金标记的重组新冠病毒抗原结合,并在检测线t1上被鼠抗人igg抗体捕获，胶体金标记的鸡igy抗体与包被在质控线的山羊抗鸡igy抗体结合，该色带作为质控线，随着中和抗体浓度的增加，检测线t2会变弱，而在中和抗体浓度足够高时，则检测线t2会消失。如此，可在同一试纸上实现新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体的联合检测，其中，新型冠状病毒特异性抗体可为上述的igg抗体或使用igm抗体、igm+igg抗体、iga抗体、igg+iga抗体、总抗体替代igg抗体，亦能够达到同样的效果。

本申请提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸，其检测性能稳定，判断标准直观，特异性强，不需特殊设备，20-30分钟可以得到两种目标检测物的结果。该试纸能够对新冠疫苗诱导免疫效果的评价、新冠肺炎康复患者体内中和抗体水平的检测、新冠病毒感染患者体内新冠病毒igg抗体的定性检测、新冠肺炎治疗血浆中和抗体水平的检测提供有效的支撑。

本申请的另一目的还在于提供一种新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测装置，其包括包被壳体，以及如上所述的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸；

所述包被壳体包括具有敞口的外壳和可拆卸连接于所述外壳的盖体，所述盖体能够封闭或敞开所述敞口；所述联合检测试纸置于所述壳体中，所述外壳或所述盖体上构造有样品滴入口，所述样品滴入口与所述联合检测试纸的样品垫对应。

在一个实施例中，所述壳体为具有上敞口的长方体结构，所述壳体内开设有沿其长度方向延伸的放置槽，所述联合检测试纸放置于所述放置槽中；所述盖体上构造有所述样品滴入口。

在一个实施例中，所述盖体上还构造有稀释液滴入口和观察口，所述稀释液滴入口和所述观察口沿所述盖体的长度方向分别设于所述样品滴入口的两侧，所述观察口与所述联合检测试纸的nc膜对应。

本申请提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测装置相比于现有技术的有益效果同于本申请提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸相比于现有技术的有益效果，此处不再赘述。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸；

图2为本申请实施例提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测装置，其中附加示出样品滴头；

图3为本申请实施例提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测装置，其中附加示出稀释液滴头。

其中，图中各附图标记：

10-基板；20-样品垫；30-胶体金垫；40-nc膜；50-吸样垫；60-包被壳体；70-样品滴头；80-稀释液滴头；401-检测线t1；402-检测线t2；403-质控线；601-稀释液滴入口；602-样品滴入口；603-观察口。

具体实施方式

为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。

需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

现对本申请实施例提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸及装置进行说明。

请参阅图1，本申请实施例提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸包括基板10，以及沿基板10的长度方向依次设置于基板10上的样品垫20、胶体金垫30、nc膜40、吸样垫50。

其中，基板10为长方形薄板，优选为pvc板，可具有一定的塑性和薄度，方便于剪裁和制备。样品垫20、胶体金垫30、nc膜40和吸样垫50均粘贴于基板10上。在一个实施例中，样品垫20为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫50包括至少两层吸水滤纸层叠组成。

本实施例中，样品垫20、胶体金垫30、nc膜40、吸样垫50依次连接。优选地，样品垫20、胶体金垫30、nc膜40、吸样垫50依次压接或依次接触连接。更为优选地，本实施例采用压接方式，胶体金垫30压接于样品垫20，胶体金垫30上设置有胶体金标记的新冠病毒重组抗原和胶体金标记的鸡igy抗体；nc膜40压接于胶体金垫30，nc膜40上包被有检测线t1401、检测线t2402和质控线403，检测线t1由包被在nc膜40上的鼠抗人igg抗体形成，检测线t2由包被在nc膜40上的人ace2蛋白形成，质控线由包被在nc膜40上的羊抗鸡抗体形成；吸样垫50压接于nc膜40，检测线t2、检测线t1和质控线沿由胶体金垫30向吸样垫50的方向依次平行且间隔开。

本实施例中，优选地，胶体金垫30宽度为6mm，压nc膜40下边缘约1mm粘贴在pvc板上，样品垫20压胶体金垫30下边缘约3mm粘贴在pvc板上，吸样垫50压nc膜40上边缘1mm粘贴在pvc板上。胶体金垫30上粘贴箭头标签膜，箭头标签膜上缘压nc膜2mm，向下包住胶体金垫30平整粘贴到样品垫20上。

本实施例中，新型冠状病毒特异性抗体可为igg抗体、igm抗体、igm+igg抗体、iga抗体、igg+iga抗体或总抗体。

以igg抗体为例，利用sars-cov-2刺突蛋白的rbd和hace2之间的蛋白质相互作用可被针对rbd的中和抗体阻断的原理，加样后，样本中存在的中和抗体将与rbd标记的胶体金结合，并阻止rbd与hace2之间的蛋白质相互作用，而未与中和抗体结合的rbd标记的胶体金以及与非中和抗体结合的rbd标记的胶体金，将在检测线t2上被hace2蛋白捕获。样本中存在的抗新冠病毒igg抗体与胶体金标记的重组新冠病毒抗原结合,并在检测线t1上被鼠抗人igg抗体捕获，胶体金标记的鸡igy抗体与包被在质控线的山羊抗鸡igy抗体结合，该色带作为质控线，随着中和抗体浓度的增加，检测线t2会变弱，而在中和抗体浓度足够高时，则检测线t2会消失。

综上，本申请实施例提供的联合检测试纸可在同一试纸上实现新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体的联合检测，其中，新型冠状病毒特异性抗体可为上述的igg抗体或使用igm抗体、igm+igg抗体、iga抗体、igg+iga抗体、总抗体替代igg抗体，亦能够达到同样的效果。

在一个实施例中，为便于检测者手持，联合检测试纸还包括手柄纸（图中未示出），手柄纸连接于吸样垫50。优选地，手柄纸下缘和吸样垫50下缘重合，平整向上粘贴包住吸样垫50。

参照图2和图3，本申请的另一目的还在于提供一种新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测装置，其包括包被壳体60，以及如上的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸。

其中，包被壳体60包括具有敞口的外壳和可拆卸连接于外壳的盖体，盖体能够封闭或敞开敞口，由该敞口将上述的联合检测试纸放入外壳中或由外壳中取出。将联合检测试纸置于壳体中，外壳或盖体上构造有样品滴入口602，样品滴入口602与联合检测试纸的样品垫20对应，用于使用样品滴头70滴入样品。

本实施例中，壳体为具有上敞口的长方体结构，壳体内开设有沿其长度方向延伸的放置槽，联合检测试纸放置于放置槽中，盖体上构造有样品滴入口602。优选地，盖体可拆卸地卡装在敞口上。例如，敞口边缘和盖体两者中的一者上构造有微凸起的凸部，敞口边缘和盖体两者中的另一者上构造有微凹陷的凹部，凸部和凹部均为环形或多个间隔的柱形和槽形，均能够使外壳和盖体可便捷拆卸地卡接。

在一个实施例中，盖体上还构造有稀释液滴入口601和观察口603，稀释液滴入口601和观察口603沿盖体的长度方向分别设于样品滴入口602的两侧，观察口603与联合检测试纸的nc膜40对应。其中，稀释液滴入口601用于使用稀释液滴头80滴入稀释液，观察口603用于观察检测线t1、检测线t2和质控线。

其他实施例中，敞口可开设在外壳的长度方向的一端，上述的稀释液滴入口、样品滴入口和观察口可构造在外壳上，沿外壳的长度方向依次间隔排列。

本申请实施例提供的新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸的制备方法如下：

1.通用溶液配制

1.1制备1%氯金酸溶液(100ml)

1)按电子天平标准操作规程，称取氯金酸1g置于烧杯中；

2)加入100ml纯化水，混匀、充分溶解过滤。

1.2制备1%柠檬酸三钠溶液(100ml)

1)按电子天平标准操作规程，称取柠檬酸三钠1g置于烧杯中；

2）加入80ml纯化水，混匀、充分溶解后补纯水至100ml。

1.3制备0.2mol/l碳酸钾溶液(100ml)

1)按电子天平标准操作规程，称取k2co32.76g置于烧杯中；

2)加入80ml纯化水，混匀、溶解后补纯化水至100ml。

1.4制备0.01mph7.4pbs(1000ml)

1)按电子天平标准操作规程，分别称取nacl8.0g、na2hpo4•12h2o3.58g、nah2po40.24g，置于烧杯中；

2)量取纯化水800ml搅拌混匀，充分溶解；

3)用ph计检测ph值，若有偏差，用hcl或naoh调ph值为7.4；

4)补纯化水至1000ml，转入试剂瓶中。

1.5制备10%bsa(100ml)

1）按电子天平标准操作规程，用天平称取bsa10g置于烧杯中；

2)加入80ml纯化水、充分搅拌，使固体物质完全溶解，补纯化水至100ml。

2.胶体金溶液制备

2.1量取纯化水400ml、1%氯金酸8ml，加入烧杯或烧瓶中，置电热煲（套）上，加热至沸腾。

2.2加入1%柠檬酸三钠8ml，继续煮沸，直至液体变为稳定的红色,冷却至室温。

3.复溶液制备

3.1按电子天平标准操作规程，称取0.2gna2hpo4、0.9gnacl、0.2gbsa置于烧杯中。

3.2加入80ml纯化水，混匀、充分溶解后量取tritonx-1001.5ml，加入上述溶液中。

3.3用ph计检测ph值，用hcl或naoh调ph值为8.0。

4.新冠病毒重组抗原和鸡igy抗体标记

4.1分别取胶体金溶液400ml，置于2个烧杯中，放在搅拌器上，加入适量k2co3约3.8ml，用ph计测量并调整ph为7.0。

4.2开启搅拌器，分别取8mg新冠病毒重组抗原、8mg鸡igy抗体，在中速搅拌下分别加入到2个胶体金溶液中，继续在室温下搅拌120min，进行标记。

4.3分别向胶体金中加入10%bsa8ml，搅拌封闭60分钟。

4.4按离心机标准操作规程开启离心机，取出胶体金溶液放入离心管中，配平、对称放入离心机中，设置8000g/4℃，离心20分钟，取出离心管，弃上清，留沉淀。

4.5分别向沉淀中加入复溶液40ml，使之充分溶解，浓缩为原体积的1/10。

4.6取浓缩液加入复溶液，将新冠病毒重组抗原胶体金浓缩液稀释至10%、鸡igy抗体胶体金浓缩液稀释至5%，充分混匀成混合液。

4.7按20cm²无纺布/ml混合液均匀涂抹在无纺布上晾干，作为胶体金垫。

5.nc膜包被

5.1粘贴：取一张pvc胶板，揭去pvc胶板中间的粘胶纸，将nc膜平整粘贴在去除粘胶纸的pvc胶板上，重复粘贴下一张，直至批量要求。

5.2配液：取羊抗鸡抗体8mg，加入pbs，使终浓度为2mg/ml，总体积为4ml；取鼠抗人igg抗体8mg，取ace2蛋白6mg，加入pbs使鼠抗人igg抗体终浓度为2mg/ml,总体积为4ml；ace2蛋白终浓度为1.5mg/ml，总体积为4ml；配液量可根据批量要求调节。

5.3包被：

a)将羊抗鸡抗体、鼠抗人igg抗体、ace2蛋白装载于喷膜机上。

b)调整c、1、2线参数均为0.12ul/mm，划线速度50-80mm/s，划线长度300mm；

c)运行喷膜机，在pvc胶板的nc膜上划线，用笔在划线有缺陷的部分进行标记；重复下一张，直至批量要求。

5.4划线完成后，将nc膜放置2小时以上直至nc膜晾干。

6.大板组装

6.1大板组装：胶体金垫宽度为6mm，压nc膜下边缘约1mm粘贴在pvc板上，然后将样品垫压胶体金垫条下边缘约3mm粘贴在pvc板上；吸样垫压nc膜上边缘1mm粘贴在pvc板上，手柄纸下缘和吸样垫下缘重合，平整向上粘贴包住吸样垫粘贴到包被板的后部，包被板中下端胶体金垫上粘贴箭头标签膜，箭头标签膜上缘压nc膜2mm，向下包住胶体金垫平整粘贴到样品垫上；制备完成后注明标签及状态标志，填写好制备记录。

7.切条

7.1条型试剂切成3mm宽度的试纸，卡型试剂切成3mm宽度的试纸，设置参数，使用切条机进行切割。

8.内包装

8.1使用喷码机在内包装铝箔袋上打印产品的批号、生产日期及有效期。

8.2将试剂卡、干燥剂装入铝箔袋中，使用封口机封口。

9.外包装

9.1将完成内包装的试剂按照20个/盒装入包装盒中，将使用说明书按照1份/盒装入包装盒中。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。