一种四联农残免疫胶体金快速检测试剂板的制作方法

1.本实用新型涉及农产品中农药残留快速检测领域，具体涉及一种可同时检测毒死蜱、氟虫腈、多菌灵和克百威的四联农残免疫胶体金快速检测试剂板。


背景技术：

2.我国是农业大国，同时也是农药生产和使用大国。农药的大量使用为保证农产品供给作出了重要贡献。然而，在农业生产中，农药尤其是有机农药的大量、不科学施用，形成严重的农药残留和环境污染等问题，直接威胁着人类生命安全和身体健康，并成为各贸易国之间重要的技术壁垒。农药残留问题越来越受到政府和消费者的高度重视。“中央一号文件”指出实施农药零增长行动，到2020年农药残留限量指标基本与国际食品法典标准接轨；2019年11月，农业农村部农药管理司发布禁限用农药名录，禁止使用的农药46种，并进一步明确了毒死蜱、氟虫腈、克百威等20种农药在部分范围禁止使用。然而，近几年来市场监管总局、各省局官方网站公布的不合格信息中农兽药项目不合格率较高，占总不合格比约30%。其中，毒死蜱、氟虫腈、多菌灵和克百威这四种农药的检出率相对较高，是蔬果中主要的不合格指标。为此，加强农药残留检测是十分必要的。
3.传统的农药残留检测方法主要有酶抑制检测法和色谱质谱检测法，在实际应用方面仍存在成本投入高、检测周期长、操作复杂的特点，无法满足检测工作人员的需求。且酶抑制检测法在定性定量上不够理想，可检测的农药种类少、适应性差、覆盖面窄。胶体金免疫层析法是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，它不仅具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无需任何仪器设备等优点，而且结果直观可靠、成本低廉，现已广泛应用于医学检验、食品安全等领域。cn208636329u公开了一种用于检测毒死蜱农残的快速检测卡，包括上层塑料盒盖、下层塑料底板，及底板上依次黏贴的样品垫、金标结合垫、层析膜和吸水垫，层析膜上设有一条包被毒死蜱抗原的检测线和一条包被兔抗鼠igg抗体的控制线，上层塑料盒盖上设置有加样孔和显示窗。该检测卡可检测毒死蜱残留，但检测指标单一，无法满足多指标的检测需求；cn202351242u公开了一种多联试纸免疫层析检测卡，包括在一块面板上设置至少四组检测单位，每组检测单元包括加样孔和相对应的观察窗，以及位于加样孔和观察窗下方的试纸。该检测卡虽然满足了多指标同时检测，但仅为几条单一试纸条的简单拼加，需要多次点样，操作繁琐，且并没有减少试剂板、试纸条等耗材的使用，不能降低检测成本；cn208334386u公开了一种基于纸芯片的新型多通道胶体金检测卡，该专利在三条试纸条样品垫的上方左端增加上层样品垫实现一个加样孔加样。该检测卡虽然实现了3个指标同时检测，且只需一次点样，简化操作步骤，但并未解决试剂板、试纸条等耗材使用量大、检测成本高等问题。
4.综上所述，针对果蔬中农药残留的快速检测，尤其是果蔬中毒死蜱、氟虫腈、多菌灵和克百威等检出率较高的指标，开发高通量、低成本、简便快速的多联农残免疫胶体金检测试剂卡，可有效弥补传统实验室检测技术的不足，为现场果蔬农残检测监管提供技术支持。


技术实现要素：

5.在本实用新型的目的在于提供一种能同时检测毒死蜱、氟虫腈、多菌灵和克百威的四联农残免疫胶体金快速检测试剂板。
6.为实现上述目的，本实用新型技术方法是：一种四联农残免疫胶体金快速检测试剂板，包括外壳体和四联试纸条，外壳体由上下两块塑料壳体组成，试纸条由底板和底板上依次连接的样品垫、金标结合垫、缓冲垫、反应膜和吸水垫组成。
7.所述样品垫由玻璃纤维膜经缓冲溶液浸泡后烘干制得，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液ph的作用。
8.所述金标结合垫由聚酯膜制成，金标结合垫上包被有四种农药的金标单克隆抗体的等体积混合物，为样品溶液中的有效成分和四种金标单抗反应提供场所。
9.所述缓冲垫由玻璃纤维膜用0.1 mol/l磷酸盐缓冲溶液（pbs）+1%聚乙二醇辛基苯基醚（triton x
‑
100）+1%牛血清白蛋白（bsa）混合溶液浸泡后晾干制得。缓冲垫经过缓冲盐和稳定剂处理，提高了反应体系的抗压能力和承受能力，避免四种金标单抗发生特异性免疫反应时相互干扰，样品溶液中的待测物与金标抗体的反应更充分，从而使检测线和控制线显色更均匀。
10.所述反应膜由硝酸纤维素膜制成，沿层析方向依次设有t1、t2、t3、t4四条检测线和一条质控线c线；其中，t1至t4线上分别包被四种农药与载体蛋白的偶联物，c线上包被羊抗鼠igg二抗。
11.所述吸水垫为滤纸，用来吸收反应过程中多余的样品溶液。
12.所述底板由一面涂有不干胶的聚氯乙烯（pvc）材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。
13.所述缓冲垫的长度为4~6 mm，作为优选，选择5 mm。
14.本实用新型中，所述偶联四种药物半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。作为优选，免疫抗原的载体蛋白选择牛血清白蛋白，包被抗原的载体蛋白选择鸡卵白蛋白。
15.本实用新型中，所述t1、t2、t3、t4和c线均与所述反应膜的轴线垂直，四条检测线的间隔均为2~3 mm，t4线到c线的距离为3~4 mm。
16.本实用新型提供的四联试纸条中，所述样品垫与金标结合垫的相邻部分有1~2 mm的重叠；所述金标结合垫与缓冲垫的相邻部分有1~2 mm的重叠；所述缓冲垫与反应膜的相邻部分有1~2 mm的重叠；所述反应膜与吸水垫的相邻部分有1~2 mm的重叠。重叠的目的之一是保证层析作用从样品垫到吸水部位的顺利进行，另一方面是样品经过缓冲垫时，保证样品溶液中的有效成分与金标结合垫上的金标单抗充分发生反应。
17.所述外壳体起固定胶体金试纸条及标示功能，由上下两块塑料壳体组成，上壳体上设置有一个加样孔和一个观察窗，通过加样孔将待测样本滴在胶体金试纸条的样品垫上，观察窗用于观察t线和c线的显色情况，下壳体设置有固定试纸条的定位槽；所述试剂板整体呈长条扁平薄壳状，近加样孔端设有防滑螺纹，近观察窗端设有溯源二维码。
18.使用本发明提供的试剂板进行检测时，将一定量的待检测溶液滴至加样孔s，静置等待3
‑
5分钟后观察所述观察窗中t线和c线颜色深浅，按照图4所示的判读方法，判定检测样本中毒死蜱、氟虫腈、多菌灵和克百威四种农药残留的情况。
19.本实用新型试剂板具有如下有益效果：
20.（1）高通量：本实用新型试剂板，在试纸条的检测区设置了四条检测线，可以同时检测毒死蜱、氟虫腈、多菌灵和克百威四种农药，通量较高，适用于大规模样本的多指标筛查。
21.（2）成本低：本实用新型试剂板与单一试剂板所用耗材用量相当，且只需一次点样就可以同时检测四种农药，减少了试剂板、试纸条等耗材的使用，降低检测成本。
22.（3）准确性高：本实用新型在金标结合垫和反应膜之间增加了一块5 mm长的缓冲垫，提高了反应体系的抗压能力和承受能力，使检测线和控制线显色更均匀，提高结果准确性。
23.（4）操作简单：样品检测只需一次点样，操作简便，加样后3
‑
5 min即可以用肉眼根据检测线和质控线颜色深浅读取结果，整个检测过程不需要专业操作人员不依赖任何仪器设备，结果判定直观准确，适用于现场快速检测。
24.（5）本实用新型试剂板设有溯源二维码，可在使用胶体金读数仪度数时记录检测样本信息，防止重复读数，适用于现场快速检测和大批量样品筛查。
附图说明
25.为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
26.图1为本实用新型胶体金检测四联试剂板的剖面结构示意图；其中1：上壳体，2：下壳体，3：加样孔，4：样品垫，5：金标结合垫，6：缓冲垫，7：反应膜，8：观察窗，9：底板，10：吸水垫。
27.图2为本实用新型胶体金检测四联试剂板的俯视图；其中，11：溯源二维码，12：防滑螺纹。
28.图3为本实用新型胶体金检测四联试剂板的操作示意图。
29.图4为本实用新型胶体金检测四联试剂板的结果判断示意图，其中t为检测线，代表t1‑
t4中的任意一条线，c为质控线。
具体实施方式
30.以下的实施例便于更好地理解本实用新型，但并不限定本实用新型。本实用新型一种检测农药残留的胶体金四联试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备、特异性单克隆抗体的制备、金标单克隆抗体的制备和四联试剂板的组装。
31.实施例1 偶联物、特异性单克隆抗体和金标单克隆抗体的制备
32.1 偶联物的制备
33.1.1 半抗原合成
34.1.1.1 毒死蜱半抗原合成：取20 ml蒸馏水和0.5 ml乙酸放入圆底烧瓶，混匀，加入0.5 mmol酒石酸毒死蜱和0.5 mmol对氨基苯乙酸，加热回流至溶液变黄后，将溶液转移到40 ℃鼓风干燥箱中干燥，将所得残渣用10 ml乙醇溶解，并加入10 ml乙酸乙酯，通过真
空抽滤的方式获得液体中的黄色沉淀，用50 ml乙酸乙酯分3次洗涤所得沉淀物，通过旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，即可得到对氨基苯乙酸毒死蜱半抗原。
35.1.1.2 多菌灵半抗原合成：同步骤1.1中毒死蜱半抗原的合成方法。
36.1.1.3 氟虫腈半抗原合成：称取氟虫腈原药0.5 g (2 mmol)溶于40 ml丙酮，搅拌使其溶解。将此溶液缓慢滴加到20 ml 2 mol/l naoh溶液中，在常温下搅拌反应12 h，用1mol/l hci调ph至5，有黄色沉淀物产生，抽滤得到黄色固体。将该物质溶于少量2 mol/l nahco3溶液后，再用盐酸调节其ph至5，有黄色沉淀产生，用此种方法反复纯化3次，得到的固体经干燥，即可得到氟虫腈半抗原。
37.1.1.4 克百威半抗原合成：称取1.64 g呋喃酚溶解于50 ml二氯甲烷中，冰浴下加入1.11 g三乙胺。边搅拌边将3.04 g二(对硝基苯)碳酸酯溶于15 ml二氯甲烷中，缓慢滴加到上述反应体系中，缓慢升温至室温，继续搅拌反应1 h，tlc板监控反应完成，展开剂为v(石油醚) : v(乙酸乙酯)=10 : 1，此为溶液a；称取1.697 g经三乙胺碱化的4
‑
氨基丁酸甲酯盐酸盐溶于10 ml二氯甲烷中，在冰浴下滴加到a液中，将温度升到室温并继续搅拌过夜；用水、饱和食盐水依次洗涤并用无水硫酸钠干燥，滤液真空旋干后用硅胶柱层析纯化，得到半抗原中间体b；将b溶于15 ml 1,4
‑
二氧六环溶液中，加入18 ml三氟醋酸和15 ml水，60℃反应4 h后冷却至室温；反应液用乙酸乙酯萃取后，进行洗涤干燥，滤液真空旋干纯化后即为克百威半抗原。
38.1.2 偶联物制备
39.1.2.1 毒死蜱
‑
载体蛋白偶联物的制备采用碳二亚胺法，具体为：称取0.074 g bsa或ova，溶于2 ml 1 mol/l的nahco3溶液中，混匀得到a液；称取对氨基苯乙酸毒死蜱半抗原0.0532 g，溶于4 ml n，n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)中，加入三乙胺25 μl混匀后加入氯甲酸异丁脂20 μl ，磁力搅拌反应1 h，得到b液；将a液缓慢加到b液中，边加边搅拌，搅拌反应12 h。将反应液转至透析袋中，生理盐水透析2天，每天换液3次。透析完毕，将透析液用0.2 μm的滤膜过滤，
‑
20℃保存，得到免疫抗原毒死蜱
‑
bsa和包被抗原毒死蜱
‑
ova。
40.1.2.2 多菌灵、氟虫腈和克百威载体蛋白偶联物的制备均采用碳二亚胺法，同步骤1中毒死蜱
‑
载体蛋白偶联物的制备，得到免疫抗原和包被抗原。
41.2 特异性单克隆抗体的制备
42.2.1 毒死蜱鼠单克隆抗体的制备
43.2.1.1 动物免疫程序：将合成的毒死蜱
‑
bsa 抗原作为免疫抗原，采用balb/c小鼠作为免疫动物。首次免疫用弗氏完全佐剂等体积乳化免疫原，皮下分点注射，免疫剂量为75 μg/只。以后每隔3周加强免疫1次，用弗氏不完全佐剂等体积乳化免疫抗原后腹腔注射，剂量为85 μg/只，加强免疫共4次。细胞融合前3天强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍，3天后取脾细胞。
44.2.1.2 细胞融合：取强化免疫后小鼠脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞在50% peg2000作用下按8︰1的比例进行融合。将融合后的细胞悬液加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，在37 ℃、5% co2的细胞培养箱中培养3~5 d后，用hat培养基再换液1次，第10天换成ht培养基培养。
45.2.1.3 阳性杂交瘤细胞筛选及克隆化：细胞融合7天后，以毒死蜱
‑
ova包被酶标板，采用间接elisa法对融合细胞分泌的抗体进行特异性筛选。对筛选为阳性的孔用有限稀
释法进行克隆化扩大培养，用于腹水制备和液氮保存。
46.2.1.4 腹水制备和纯化：采用小鼠体内诱生腹水的方式生产盐酸克伦特罗单克隆抗体。取3月龄雌性balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5 ml/只，7~10天后腹腔注射杂交瘤细胞1
ꢀ×ꢀ
106/只，8天后抽取小鼠腹水。
47.2.1.5 抗体纯化：采用饱和硫酸铵法进行单克隆抗体的纯化，取10 ml腹水加入10 ml生理盐水，边搅拌边逐滴加入20 ml饱和硫酸铵溶液，4 ℃沉淀过夜；4℃ 12,000 rpm离心20 min，弃上清，加入10 ml生理盐水溶解沉淀，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵溶液5 ml，4℃，沉淀过夜；4℃、12,000 rpm离心20 min，弃上清；用0.01 mol/l、ph 7.4的 pbs缓冲液溶解沉淀至10 ml；4℃、0.01 mol/l pbs缓冲液透析1天半，中间换液3次，得到毒死蜱单克隆抗体溶液（
‑
20℃保存）。
48.2.2 多菌灵、氟虫腈和克百威单克隆抗体的制备：同步骤2.1中毒死蜱单克隆抗体制备。
49.3 金标单克隆抗体的制备
50.3.1 胶体金溶液的制备：取1 ml 1%的氯化金水溶液加入99 ml超纯水中，配制成0.01%的haucl4溶液，并置于三角烧瓶中，烧瓶口覆上保鲜膜，放置在恒温磁力搅拌器上，匀速搅拌加热至沸腾。将恒温磁力搅拌器搅拌速度旋钮旋至最大，迅速加入1 ml 1%柠檬酸三钠水溶液。继续搅拌加热沸腾2
‑
5min，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内颜色变化为灰色
‑
黑色
‑
紫红色，继续煮沸20min，溶液最终呈红色，得到稳定的胶体金溶液（胶体金的直径为30
‑
40 nm）。冷却至室温后，4℃下保存备用。
51.3.2 金标单克隆抗体的制备：分别取20 ml 胶体金溶液于4支离心管中，加入0.1 mol/l的k2co3水溶液调胶体金溶液的ph至标记所需ph值；分别将毒死蜱单克隆抗体、氟虫腈单克隆抗体、多菌灵单克隆抗体、克百威单克隆抗体用纯水稀释至1 mg/ml工作浓度，分别加入到1
‑
4号离心管中，终浓度为4~20
ꢀµ
g/ml；室温反应2 h后加入5%的bsa溶液100
ꢀµ
l进行封闭，充分反应30分钟后，20,000 rpm 4℃离心15 min，弃上清液，将沉淀用10 ml 含2% bsa的pbs缓冲液溶解，用0.22
ꢀµ
m无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。
52.实施例2 四联试剂板的组装
53.本实用新型提供了一种检测农药残留的胶体金四联试剂板：包括外壳体和四联试纸条，外壳体由上下两块塑料壳体组成，四联试纸条由底板以及依次粘在底板上的样品垫、金标结合垫、缓冲垫、反应膜和吸水垫组成，试剂板外形呈长条扁平薄壳状。
54.1. 金标结合垫的制备
55.(1)结合垫处理液的配制：称取5 g pva、7.1 g na2hpo4、5 g bsa、1 ml triton x
‑
100，加1 l h2o溶解，调节ph为7.4。
56.(2)金标结合垫预处理：金标结合垫由聚酯膜制成，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所；用结合垫处理液浸泡30分钟，放置在37℃的干燥箱中烘干。
57.(3) 将制备好的毒死蜱、氟虫腈、多菌灵和克百威四种农药的金标单克隆抗体溶液等体积混匀，按照标记量为10
ꢀµ
g/ml，喷量为4
ꢀµ
l/cm，以喷涂的方式固着于预处理后的金标抗体结合垫上，干燥4 h小时，密封保存。
58.2. 反应膜的制备
59.参照图1，所述反应膜沿层析方向依次具有t1、t2、t3、t4和c线，所述t1、t2、t3、t4和c
线上依次包被有毒死蜱
‑
bsa、氟虫腈
‑ꢀ
bsa、多菌灵
‑
bsa、克百威
‑ꢀ
bsa和羊抗鼠igg（包被浓度均为1 mg/ml，包被量为1
ꢀµ
l/cm），37 ℃烘箱干燥8 h。
60.3. 缓冲垫的制备
61.由玻璃纤维膜经缓冲溶液浸泡后晾干制得，保证样品溶液中的有效成分与金标结合垫上的金标抗体充分发生反应。具体制备方法为：用0.1 mol/l磷酸盐缓冲溶液（pbs）+1%聚乙二醇辛基苯基醚（triton x
‑
100）+1%牛血清白蛋白（bsa）混合溶液浸泡玻璃纤维膜后晾干制得。
62.4. 样品垫的制备
63.(1)样品垫处理液的配制：称取38.137 g na2b4o7•
10h2o、10 g pvp、1 g bsa、10 ml triton x
‑
100，加1 l h2o溶解、调节ph 9.3。
64.(2)样品垫由玻璃纤维膜制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液ph值的作用；将样品垫用样品垫处理液浸泡15分钟以上，放置在37℃的干燥箱中，烘至16小时以上。
65.5. 底板为pvc板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。
66.6. 吸水纸为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。
67.7. 试剂条的组装：如图1所示，将样品垫、金标结合垫、缓冲垫、反应膜、吸水垫依次黏贴于pvc底衬上组成试剂卡，所述样品垫长度为18 mm，所述金标结合垫长度为8 mm，所述缓冲垫长度为5 mm，所述t1线距离缓冲垫的垂直距离为6 mm，四条检测线的间隔均为2~3 mm，t4线到c线的距离为3~4 mm，所述c线距离吸水垫的垂直距离为6 mm，所述吸水垫的长度为15mm。所述样品垫与金标结合垫的相邻部分有2 mm的重叠，所述金标结合垫与缓冲垫的相邻部分有2 mm的重叠，所述缓冲垫与反应膜的相邻部分有2 mm的重叠，所述反应膜与吸水垫的相邻部分有2 mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液中的有效成分与样品垫有充分反应时间。用切割机将卡片分切成3.0 mm宽的试剂条，然后置于下壳体的固定槽中固定，并盖上上壳体制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭存储。
68.8. 试剂板的组装：试剂板由上下两块塑料壳体组成，上壳体上设置有一个加样孔和一个观察窗，下壳体设置有固定试纸条的定位槽；将组装好的四联试纸条放置在下壳体的定位槽中固定，试纸条的样品垫正对上壳体加样孔位置，将组装好的试剂板和干燥剂放入外包装袋密封保存。
69.实施例3 四联试剂板的实施操作方法
70.1. 样品制备
71.取黄瓜、韭菜等蔬菜中可食用部分组织样本，进行粉碎匀浆；取2 g匀浆后的样本于10 ml离心管中，加入6 ml乙腈提取液；剧烈震荡2 min混合均匀，室温下4000 rpm离心1 min（或静置1 min），取0.1 ml上清液加入0.9 ml样本稀释液(0.02 mol/l pbs)中，混合均匀，得到待检样本溶液。
72.2. 检测步骤
73.将四联试剂板放置于水平桌面上，用滴管吸取待检样品溶液到加样孔s中，滴加4滴，如图3所示，加样后开始计时，结果应在3～5分钟内读取，其他时间判读无效。
74.3. 结果判读
75.结果判定如图4所示，其中t线代表t1‑
t4中的任意一条线。
76.阴性（－）：四条t线均显红色，均比c线深或颜色一样深，如图4中a图中两种情况，表示待测样品中待测四种农药浓度均低于检出限或无待测药物残留；
77.阳性（＋）：四条t线中任意一条、几条或四条线均无显色，或显红色且比c线颜色浅，如图4中b图中两种情况，表示待测样本中某一种、几种或四种农药浓度等于或高于检出限，t线显色比c线颜色越浅，表示样本中待测农药的浓度越高；
78.无效： c线未显色，t线显色或未显色，如图4中c图中两种情况，表示检测结果无效，可能是操作不当或试剂板已失效。