β-抑制蛋白突变体的制作方法

β
‑
抑制蛋白突变体
1.本发明涉及以下领域：抑制蛋白(arrestin)突变体，特别是β
‑
抑制蛋白突变体、本发明的突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的复合物以及编码本发明的突变体β
‑
抑制蛋白的载体。


背景技术：

2.g蛋白偶联受体(g protein
‑
coupled receptor，gpcr)是通过g蛋白介导跨膜信号传导的膜受体家族。gpcr响应于刺激而激活g蛋白来调节第二信使的产生，第二信使随后调节下游信号传导效应物。为了关闭信号传导响应，募集gpcr激酶(gpcr kinase，grk)以磷酸化gpcr并为抑制蛋白结合做准备。抑制蛋白结合阻断g蛋白介导的信号传导，并可引导受体至内化途径。在与gpcr结合后，抑制蛋白还充当协调gpcr信号传导网络的骨架(zhou et al.，2017，identification of phosphorylation codes for arrestin recruitment by g protein
‑
coupled receptors，cell 170，pp.457
‑
469)。这表明gpcr
‑
抑制蛋白复合物的不同构象与gpcr相互作用以使g蛋白脱敏并介导受体内吞作用(cahill et al.，distinct conformations of gpcr
‑
β
‑
arrestin complexes mediate desensitization，signaling，and endocytosis，pnas 114(10)，pp.2562
‑
2567)。
3.抑制蛋白形成一个小的蛋白质家族，包括几个亚型，例如抑制蛋白
‑
1，也称为视觉抑制蛋白、s抗原或48
‑
kda蛋白；抑制蛋白
‑
2，也称为β
‑
抑制蛋白1；抑制蛋白
‑
3，也称为β
‑
抑制蛋白2；以及抑制蛋白
‑
4，也称为视锥抑制蛋白或x
‑
抑制蛋白。抑制蛋白
‑
1是第一个被发现的抑制蛋白，并且因其在光转导中的关键作用而被命名为视觉抑制蛋白。β
‑
抑制蛋白(beta
‑
抑制蛋白)是一种胞质衔接蛋白，其以两种不同的同工型存在，称为β
‑
抑制蛋白1(由arrb1基因编码)和β
‑
抑制蛋白2(由arrb2基因编码)。最近，已鉴定了另一种抑制蛋白亚型，称为α
‑
抑制蛋白。它们在结构上类似于它们的视觉/视锥和β
‑
抑制蛋白配对物，并已被提议用于调节脂解(lipolysis)和肥胖的发病机制(ahmadzai et al.，canonical and noncanonical signaling roles of β
‑
arrestins in inflammation and immunity，advances in immunology 136，pp.279
‑
313)。
4.potter等在2002年(arrestin variants display differential binding characteristics for the phosphorylated n
‑
formyl peptide receptor carboxyl terminus，j biol chem 277(11)，pp.8970
‑
8978，2002)检测了抑制蛋白家族的多种成员与甲酰肽受体(formyl peptide receptor，fpr)的相互作用，甲酰肽受体是gpcr受体家族的成员。抑制蛋白
‑
2和抑制蛋白
‑
3，而不是抑制蛋白
‑
1，以磷酸化依赖的方式与fpr羧基末端肽结合。截短的抑制蛋白
‑
2(1
‑
382)和抑制蛋白
‑
3(1
‑
393)显示与完整受体的磷酸化非依赖性结合。对另外两个抑制蛋白
‑
2突变体与fpr羧基末端的结合亲和力进行了评价。然而单点突变体抑制蛋白
‑
2 r169e显示出与全长抑制蛋白相似的亲和力，三重点突变体抑制蛋白
‑
2 i386a/v387a/f388a显示出更类似于截短形式的抑制蛋白与fpr羧基末端结合的亲和力。
5.发明简述
6.发明人设计了β
‑
抑制蛋白突变体，其示出了gpcr的配体，特别是β2
‑
肾上腺素能受体(β2
‑
adrenergic receptor，β2ar)的配体提高的募集，如在基于细胞的生物发光共振能
量转移(bioluminescence resonance energy transfer，bret)测定中所示。与野生型(wt)抑制蛋白
‑
3相比，本发明的抑制蛋白
‑
3突变体的募集提高至多30％。
7.此外，与wtβ
‑
抑制蛋白突变体相比，本发明的β
‑
抑制蛋白突变体发挥生物传感器的作用并且能够以更敏感的方式感知细胞中β2ar异丙肾上腺素激活的构象。本发明的β
‑
抑制蛋白突变体，特别是抑制蛋白
‑
3突变体，与wt抑制蛋白
‑
3相比，能够识别细胞中更低量的激活受体(更高效价(potency))，并且当使用最高浓度的β2ar激动剂时显示出检测到的最大信号的高至30％的提高(更高效力(efficacy))。
8.此外，通过比较本发明的β
‑
抑制蛋白突变体与gpcr的相对反应性，可在bret测定中区分不同的构象状态。bret测定允许对抑制蛋白募集进行动力学测量，并且由于gpcr构象通过平衡转换，因此本发明的β
‑
抑制蛋白突变体适合于监测这样的变化。通过使抑制蛋白在受到刺激时对gpcr的磷酸化羧基末端不那么敏感，本发明的β
‑
抑制蛋白突变体，特别是通过对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置处的突变，还可允许感知受体的磷酸化非依赖性构象。
9.此外，监测了本发明的β
‑
抑制蛋白突变体在细胞中的表达水平(例如，通过使用例如融合的绿色荧光蛋白(gfp)的报道蛋白)。尽管抑制蛋白
‑
3突变体在人hek293细胞中的表达一直较低(与wt抑制蛋白
‑
3相比在26％至55％的范围)，但仍观察到β2ar的较强募集。考虑到这一因素，发明人预测本发明的抑制蛋白
‑
3突变体的蛋白质
‑
蛋白质相互作用的实际强度应超过bret测定给出的实验值。
10.因此，在第一方面中，本发明提供了突变体β
‑
抑制蛋白，在突变体β
‑
抑制蛋白中与亲本β
‑
抑制蛋白相比至少两个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第一个位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386的氨基酸位置，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第二个位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299的氨基酸位置。
11.在另一方面中，本发明提供了突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的复合物，其中优选地所述gpcr是β2
‑
肾上腺素能受体(β2ar)。
12.在另一方面中，本发明提供了编码本发明的β
‑
抑制蛋白的载体。
13.在另一方面中，本发明提供了本发明的突变体β
‑
抑制蛋白或本发明的复合物用于所述复合物或所述复合物的所述gpcr的结构确证的用途。
14.在另一方面中，本发明提供了本发明的突变体β
‑
抑制蛋白或本发明的复合物用于药物筛选的用途，其中对于抑制蛋白
‑
3突变体对gpcr的募集进行测量。
15.附图简述
16.图1：进行基于生物发光共振能量转移(bret)的抑制蛋白
‑
3突变体对b2ar的经典抑制蛋白募集测定，以比较新的抑制蛋白
‑
3突变体的募集效率。示出了异丙肾上腺素诱导的野生型抑制蛋白
‑
3和抑制蛋白
‑
3突变体a、b、c和d对β2ar的募集的浓度
‑
响应曲线。
17.图2：使用在线工具protein blast/blastp算法(blosum62矩阵，条件组合分数矩阵调整，国家生物技术信息中心)的野生型抑制蛋白
‑
3(query)与具有t299a、i386a和r166a的三重突变体b(sbjct)的蛋白质序列比对。突变r166a、t299a和i386a用空白表示。由于起始密码子(atg，甲硫氨酸)被排除在该表示中，所以氨基酸编号移动了一个氨基酸。
18.图3：人野生型抑制蛋白
‑
3(arrb2_human)与小鼠、大鼠和牛的同源抑制蛋白
‑
3蛋
白的序列比对。深灰色：相同残基；浅灰色：关于侧链的极性和尺寸而言相似的残基；无高亮：不同残基；
“‑”
：插入其他序列中。总的来说，发现在所有序列之间具有很高的同源性(91.92％)，其中有387个相同残基、15个相似残基和7个不同残基。使用带有默认转换矩阵gonnet和其默认设置下的hhalign算法的clustal
‑
omega程序进行分析，如j.et al.，protein homology detection be hmm
‑
hmm comparison，bioinformatics 21，pp.951
‑
960中描述。
19.图4：抑制蛋白
‑
2(arrb2_human)和抑制蛋白
‑
3(arrb1_human)两种同工型的序列比对。深灰色：相同残基；浅灰色：关于侧链的极性和尺寸而言相似的残基；无高亮：不同残基；
“‑”
：插入其他序列中。总的来说，发现在所有序列之间具有73.47％的同源性，其中具有313个相同残基、63个相似残基和33个不同残基。使用带有默认转换矩阵gonnet和其默认设置下的hhalign算法的clustal
‑
omega程序进行分析，如j.et al.，protein homology detection be hmm
‑
hmm comparison，bioinformatics 21，pp.951
‑
960中描述。
20.发明详述
21.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
22.在本说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或词语“包括”及其变体应理解为暗示包含要素、所述整数、步骤或其组，但不排除任何其他要素、所述整数、步骤或其组。
23.如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另有明确规定，否则没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。
24.当与数值一起使用时，术语“约”或“大约”意在涵盖具有比指示数值小0
‑
10％的下限且具有比指示数值大0
‑
10％的上限的范围内的数值。术语“约”或“大约”意指优选
±
10％，更优选
±
5％，再更优选
±
3％或最优选
±
0％(分别参照给定的数值)。在本发明的每个实施方案中，可删除“约”。本文公开的值的所有范围应指代并包括落入所述范围内的任何和所有值，包括限定该范围的值。
25.本文所使用的术语“天然存在的”是指天然来源的序列，这意味着其全部或一部分不是合成的并且在自然界中存在或产生。更优选地，本文所使用的术语“天然存在的”是指天然来源的序列，其意味着整个序列不是合成的并且在自然界中存在或产生。
26.术语“β
‑
抑制蛋白”优选包含抑制蛋白
‑
2(β
‑
抑制蛋白1)和抑制蛋白
‑
3(β
‑
抑制蛋白2)。更优选地，术语“β
‑
抑制蛋白”仅指抑制蛋白
‑
2和抑制蛋白
‑
3。术语“β
‑
抑制蛋白”包括完整的和截短的β
‑
抑制蛋白。通常来说且优选地，术语抑制蛋白
‑
2和抑制蛋白
‑
3是指规范序列(canonical sequence)。
27.术语“突变的”、“突变”和“突变体”在本文中可互换使用。通常来说且优选地，所述突变氨基酸或突变是一个氨基酸被替换为一个或更多个氨基酸、插入、缺失或其组合。最优选地，所述突变氨基酸或突变是单个氨基酸被替换为不同的单个氨基酸。
28.突变的或突变体β
‑
抑制蛋白与亲本β
‑
抑制蛋白相比发生突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白通常且优选地为天然存在的β
‑
抑制蛋白。突变的或突变体抑制蛋白
‑
3与亲本β
‑
抑制蛋白相比发生突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白通常且优选地为天然存在的抑制蛋白
‑
3。
29.抑制蛋白
‑
3的氨基酸位置在本文中与人抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)比对(或映射
至人抑制蛋白
‑
3)，优选地通过结构比对。如本文所用，“对应的氨基酸残基”或“对应于
……
的氨基酸位置”的表述是指与seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中给定的氨基酸残基比对的β
‑
抑制蛋白中的氨基酸残基。通常来说且优选地，使用软件pymol(分子图形系统，2.0版llc内置比对算法)进行结构比对。通常来说且优选地，比对是结构比对。zhan，x.等2011年解释了这种基于牛抑制蛋白3的比对的一个实例(“crystal structure of arrestin
‑
3 reveals the basis of the difference in receptor binding between two non
‑
visual subtypes”，j.mol.biol.406(3)，pp.467
‑
478)(瑞士模型)，也显示在本技术的图2、3和4中。通常来说且优选地，使用使用标准算法参数的蛋白质
‑
蛋白质blast来进行比对。优选的标准参数是阈值10、字号3、矩阵blosum62、空位罚分存在11/延伸1、条件组合分数矩阵调整、无滤波器和掩蔽。
30.术语“g蛋白偶联受体”(gpcr)通常且优选地是指a类(或1类)(视紫红质样)、b类(或2类)(促胰液素受体家族)、c类(或3类)(代谢型谷氨酸/信息素)、d类(或4类)(真菌交配信息素受体)、e类(或5类)(环amp受体)、f类(或6类)(卷曲/平滑(frizzled/smoothened))。更优选gpcr是视紫红质样受体，更优选是a17亚家族的视紫红质样受体。更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。所述肾上腺素能受体通常且优选地包括α1a(adra1a，a1aa)、α1b(adra1b，a1ab)、α1d(adra1d，a1ad)、α2a(adra2a，a2aa)、α2b(adra2b，a2ab)、α2c(adra2c，a2ac)、β1(adrb1，b1ar)、β2(adrb2，b2ar)、β3(adrb3，b3ar)。再更优选地，所述gpcr是β2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
31.第一方面中，本发明涉及突变体β
‑
抑制蛋白，在该突变体β
‑
抑制蛋白中与亲本β
‑
抑制蛋白相比至少两个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第一个位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386的氨基酸位置，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第二个位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299的氨基酸位置。
32.在一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3。优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠或大鼠的抑制蛋白
‑
3。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：7至9中的任一项，或具有与seq id no：1中的任一项或seq id no：7至9中的任一项具有80％至100％同一性的氨基酸序列。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：1或seq id no：7至9中任一项的氨基酸序列。
33.优选地，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白是突变体抑制蛋白
‑
3，在突变体抑制蛋白
‑
3中与亲本抑制蛋白
‑
3相比至少两个氨基酸独立地突变，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3是天然存在的抑制蛋白
‑
3，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第一个位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386的氨基酸位置，并且所述至少两个突变氨基酸中的第二个位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299的氨基酸位置。更优选地，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白是突变体抑制蛋白
‑
3，在该突变体抑制蛋白
‑
3中与亲本抑制蛋白
‑
3相比至少两个氨基酸独立地突变，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3是天然存在的抑制蛋白
‑
3，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第一个位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386的氨基酸位置，并且所述至少两个突变氨基酸中的第二个位于对应于seq id no：1的人抑制
蛋白
‑
3中的t299的氨基酸位置。
34.在一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少两个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第一个位于与seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386相对应的氨基酸位置，并且所述至少两个突变氨基酸中的第二个位于与seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299相对应的氨基酸位置，并且其中任选地在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，氨基酸在第三氨基酸位置处突变。优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中再更优选seq id no：1或6。
35.在一个更优选的实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白是突变体抑制蛋白
‑
3，在该突变体抑制蛋白
‑
3中与亲本抑制蛋白
‑
3相比至少两个氨基酸独立地突变，其中优选地所述亲本抑制蛋白
‑
3是天然存在的抑制蛋白
‑
3，并且其中所述至少两个突变氨基酸中的第一个位于与seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386相对应的氨基酸位置，并且所述至少两个突变氨基酸中的第二个位于与seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299相对应的氨基酸位置，并且其中任选地在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，氨基酸在第三氨基酸位置处突变。优选地，所述亲本抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3，其中更优选人抑制蛋白。更优选地，所述亲本抑制蛋白
‑
3选自seq id no：1、seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9，其中更优选seq id no：1。
36.优选地，所述任选的第三氨基酸位置选自位置r166、d298和r393，每个位置均在seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中。更优选地，所述任选的第三氨基酸位置是r166或d298，每个位置均在seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中。再更优选地，所述任选的第三氨基酸位置是r166，每个位置均在seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中。
37.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变。所述亲本β
‑
抑制蛋白优选为seq id no：1中的任一项或seq id no：6至12中的任一项。在另一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白为天然存在的抑制蛋白
‑
3，优选地，所述天然存在的具有选自seq id no：1或seq id no：7至9中任一项的氨基酸序列。
38.在一个优选实施方案中，所述至少三个突变氨基酸中的第三个位于对应于以下的氨基酸位置：选自seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166a、d298和r393的氨基酸位置。优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：1或seq id no：6至12中任一项的氨基酸序列。
39.在一个优选实施方案中，所述至少三个突变氨基酸中的第三个位于对应于以下的氨基酸位置：选自seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166a、d298和r393的氨基酸位置，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3，优选地，所述天然存在的具有选自seq id no：1或seq id no：7至9中任一项的氨基酸序列。
40.在一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第
一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和第三氨基酸位置。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中再更优选seq id no：1或6。
41.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3突变体。在一个更优选的实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3突变体，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和第三氨基酸位置，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3突变体。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3，其中更优选人抑制蛋白。再更优选地，所述β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1、seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9，其中再更优选seq id no：1。
42.在一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和所述第三氨基酸位置选自seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166、d298和r393的位置。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中任一项，其中更优选seq id no：1或6。
43.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和所述第三氨基酸位置选自seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166、d298和r393的位置，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3突变体。更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3，其中更优选人抑制蛋白。再更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自seq id no：1、seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9，其中再更优选seq id no：1。
44.在一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299，在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和第三氨基酸位置，其中所述第三氨基酸位置为r166或d298。在另一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299，在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1
中的r166、d298或r393和第四氨基酸位置。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
47.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本抑制蛋白
‑
3相比，至少四个氨基酸独立地突变，其中所述至少四个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386、在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166、d298或r393和第四氨基酸位置，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3。更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3，其中更优选人抑制蛋白。再更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自seq id no：1、seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9，其中再更优选seq id no：1。
48.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少两个氨基酸独立地突变，所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白，其中所述至少两个氨基酸位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置(双突变体t299+i386)。在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少两个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白优选为天然存在的抑制蛋白
‑
3，其中所述至少两个氨基酸位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置(双突变体t299+i386)。
49.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中：
50.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少两个氨基酸独立地突变，其中所述至少两个氨基酸位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置，或
51.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386，和在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166、d298或r393。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
52.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中：
53.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少两个氨基酸独立地突变，其中所述至少两个氨基酸位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置，或
54.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386，和在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166或d298。所
述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
55.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中：
56.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少两个氨基酸独立地突变，其中所述至少两个氨基酸位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置，或
57.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386，和在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
58.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中：
59.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少两个氨基酸独立地突变，其中所述至少两个氨基酸位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置，或
60.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386，和在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的d298。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
61.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中：
62.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少两个氨基酸独立地突变，其中所述至少两个氨基酸位于对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386和t299的氨基酸位置，或
63.‑
与亲本β
‑
抑制蛋白(优选天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386，和在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r393。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或
6。
64.在一个优选实施方案中，在所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白(其为天然存在的β
‑
抑制蛋白)相比，至少三个氨基酸独立地突变，其中所述至少三个氨基酸位于以下氨基酸位置：在第一氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的t299、在第二氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的i386，和在第三氨基酸位置处对应于seq id no：1的人抑制蛋白
‑
3中的r166、d298或r393。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
65.在一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白或与所述天然存在的β
‑
抑制蛋白中的任一种具有80％至100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的人β
‑
抑制蛋白或与天然存在的人β
‑
抑制蛋白具有80％至100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在又一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的人β
‑
抑制蛋白。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3或与所述天然存在的抑制蛋白
‑
3中的任一种具有80％至100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白为亲本抑制蛋白
‑
3，其中，所述亲本抑制蛋白
‑
3是天然存在的人β
‑
抑制蛋白或与天然存在的人β
‑
抑制蛋白具有80％至100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在又一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白为亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3为天然存在的人β
‑
抑制蛋白。优选地，与所述天然存在的β
‑
抑制蛋白或抑制蛋白
‑
3中的任一种具有80％至100％的氨基酸序列同一性的所述蛋白质保留对gpcr的配体结合能力。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
66.在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是当与天然存在的人、牛、小鼠或大鼠的β
‑
抑制蛋白(其中更优选为人抑制蛋白)相比具有80％至100％、更优选85％至100％、再更优选90％至100％、再更优选95％至100％、再更优选99％至100％、最优选100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3是当与天然存在的人、牛、小鼠或大鼠的抑制蛋白
‑
3(其中更优选为人抑制蛋白)相比具有80％至100％、更优选85％至100％、再更优选90％至100％、再更优选95％至100％、再更优选99％至100％、最优选100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
67.在另一个优选实施方案中，所述突变体β
‑
抑制蛋白是当与天然存在的人、牛、小鼠或大鼠的β
‑
抑制蛋白(其中更优选为人β
‑
抑制蛋白)相比具有80％至100％、更优选85％至100％、再更优选90％至100％、再更优选95％至100％、再更优选99％至100％、最优选100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述突变体抑制蛋白
‑
3是当与天然存在的人、牛、小鼠或大鼠的抑制蛋白
‑
3(其中更优选为人抑制蛋白
‑
3)相比具有80％至100％、更优选85％至100％、再更优选90％
至100％、再更优选95％至100％、再更优选99％至100％、最优选100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
68.在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白。在本发明的另一个优选实施方案中，所述突变体β
‑
抑制蛋白是突变体抑制蛋白
‑
3，并且所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3。在本发明的另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3。在另一个优选实施方案中，所述β
‑
抑制蛋白为抑制蛋白
‑
3，并且所述亲本β
‑
抑制蛋白为亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3，其中更优选人抑制蛋白
‑
3。
69.在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白与seq id no：1中的任一项或seq id no：6至12中的任一项具有80％至100％，优选90％至100％的氨基酸序列同一性。在另一个优选实施方案中，所述突变体β
‑
抑制蛋白与seq id no：1中的任一项或seq id no：7至9中的任一项具有80％至100％，优选90％至100％的氨基酸序列同一性。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3，其中所述突变体β
‑
抑制蛋白与seq id no：1中的任一项或seq id no：7至9中的任一项具有80％至100％、优选90％至100％的氨基酸序列同一性。
70.在一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：1或seq id no：6至12中任一项的氨基酸序列，或具有与seq id no：1中的任一项或seq id no：6至12中的任一项具有80％至100％同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3具有选自seq id no：1或seq id no：7至9中任一项的氨基酸序列，或具有与seq id no：1中的任一项或seq id no：7至9中的任一项具有80％至100％的同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：1的氨基酸序列或具有与seq id no：1具有80％至100％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白为亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3具有seq id no：1的氨基酸序列，或具有与seq id no：1中的任一项或seq id no：7至9中的任一项具有80％至100％同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白为亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3具有选自seq id no：1或seq id no：7至9中任一项的氨基酸序列，或具有与seq id no：1中的任一项或seq id no：7至9中的任一项具有80％至100％同一性的氨基酸序列。优选地，与seq id no：1中的任一项或seq id no：7至9中的任一项具有80％至100％同一性的所述氨基酸序列或者与seq id no：1中的任一项或seq id no：6至12中的任一项具有80％至100％同一性的氨基酸序列保留对gpcr的配体结合能力。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
71.在另一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白是当与选自seq id no：1或seq id no：6至12中任一项(其中更优选seq id no：1或6)的氨基酸序列相比时具有80％至100％、更优选85％至100％、再更优选90％至100％、再更优选95％至100％、再更优选99％至100％、最优选100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在另一个优选实施方案中，所述亲本
β
‑
抑制蛋白是亲本抑制蛋白
‑
3，其中所述亲本抑制蛋白
‑
3是当与选自seq id no：1或seq id no：7至9中任一项(其中更优选seq id no：1)的氨基酸序列相比时具有80％至100％、更优选85％至100％、再更优选90％至100％、再更优选95％至100％、再更优选99％至100％、最优选100％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
72.在一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：1或seq id no：6至12中任一项的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所述亲本β
‑
抑制蛋白为亲本抑制蛋白
‑
3，其中，所述亲本抑制蛋白
‑
3具有选自seq id no：1或seq id no：7至9中任一项的氨基酸序列。
73.在一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少两个且至多80个氨基酸位置，优选至少两个且至多40个氨基酸位置，进一步优选至少两个且至多20个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多10个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多5个氨基酸位置、再更优选至少两个且至多4个氨基酸位置、以及最优选至少两个且至多3个氨基酸位置发生突变。
74.在一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少两个且至多40个氨基酸位置，进一步优选至少两个且至多20个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多10个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多5个氨基酸位置发生突变。所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的β
‑
抑制蛋白。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
75.在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白是突变体抑制蛋白
‑
3，其中与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少两个且至多80个氨基酸位置，优选至少两个且至多40个氨基酸位置，进一步优选至少两个且至多20个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多10个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多5个氨基酸位置、再更优选至少两个且至多4个氨基酸位置、以及最优选地至少两个且至多3个氨基酸位置发生突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3。在一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，至少两个且至多40个氨基酸位置，进一步优选至少两个且至多20个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多10个氨基酸位置，再更优选至少两个且至多5个氨基酸位置发生突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3，优选地所述天然存在的抑制蛋白
‑
3具有选自seq id no：1或seq id no：7
‑
9的氨基酸序列。更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3，其中更优选人抑制蛋白。再更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自seq id no：1、seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9，其中再更优选seq id no：1。
76.在另一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，独立地至少两个且至多4个氨基酸位置、再更优选至少两个且至多3个氨基酸位置发生突变。在另一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，独立地至少两个且至多4个氨基酸位置、再更优选至少两个且至多3个氨基酸位置发生突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3，优选地所述天然存在的具有选自seq id no：1或seq id no：7至9的氨基酸序列。
77.在另一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，恰好两个或恰好三个氨基酸独立地突变。在另一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，恰好四个氨基酸位置独立地突变。在另一个非常优选的实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，恰好两个氨基酸位置独立地突变。在另一个非常优选的实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白相比，恰好三个氨基酸位置独立地突变。更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的β
‑
抑制蛋白，其中更优选人β
‑
抑制蛋白抑制蛋白。再更优选地，所述亲本β
‑
抑制蛋白选自seq id no：1或seq id no：6至12中的任一项，其中更优选seq id no：1或6。
78.在另一个优选实施方案中，在本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白中，与亲本β
‑
抑制蛋白相比，恰好两个或恰好三个氨基酸独立地突变，其中所述亲本β
‑
抑制蛋白是天然存在的抑制蛋白
‑
3，优选地所述天然存在的抑制蛋白
‑
3具有选自seq id no：1或seq id no：7至9的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，在本发明的所述β
‑
抑制蛋白突变体中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白(其为天然存在的抑制蛋白
‑
3)相比，恰好四个氨基酸位置独立地突变。在另一个非常优选的实施方案中，在本发明的所述β
‑
抑制蛋白突变体中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白(其为天然存在的抑制蛋白
‑
3)相比，恰好两个氨基酸位置独立地突变。在另一个非常优选的实施方案中，在本发明的所述β
‑
抑制蛋白突变体中，与所述亲本β
‑
抑制蛋白(其为天然存在的抑制蛋白
‑
3)相比，恰好有三个氨基酸位置独立地突变。更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自天然存在的人、牛、小鼠和大鼠的抑制蛋白
‑
3，其中更优选人抑制蛋白。再更优选地，所述天然存在的抑制蛋白
‑
3选自seq id no：1、seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9，其中再更优选seq id no：1。
79.在一个优选实施方案中，所述突变氨基酸或突变是单个氨基酸被替换为不同的单个氨基酸，其中所述不同的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、2
‑
氨基丁酸、2
‑
氨基庚酸、叔亮氨酸、二乙基丙氨酸、高亮氨酸、3
‑
甲基
‑1‑
别异亮氨酸、别异亮氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、缬氨酸、乙烯基甘氨酸或2
‑
烯丙基甘氨酸。更优选地，所述不同的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、2
‑
氨基丁酸、别异亮氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸和缬氨酸。再更优选地，所述不同的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸异亮氨酸或缬氨酸。再一次更优选地，所述不同的氨基酸是丙氨酸。然而，当亲本中的特定氨基酸残基已经是丙氨酸时，优选用甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸替代。
80.在一个优选实施方案中，所述突变体β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16的氨基酸序列或具有与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16中的任一项具有80％至100％，优选90％至100％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所述突变体β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16的氨基酸序列或具有与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16中的任一项具有80％至100％、优选90％至100％、更优选95％至100％、再更优选99％至100％同一性的氨基酸序列。
81.在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16的序列。
82.在一个优选实施方案中，所述突变体β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5的氨基酸序列或具有与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5中的任一项具有80％至100％，优选90％至100％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所述突变体β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5的氨基酸序列或具有与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5中的任一项具有80％至100％、优选90％至100％、更优选95％至100％、再更优选99％至100％同一性的氨基酸序列。
83.在一个更优选的实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4和seq id no：5的序列。
84.在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有选自seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：2或seq id no：4的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：2的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：3的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：4的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：5的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：13的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：14的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：15的序列。在一个优选实施方案中，本发明的所述突变体β
‑
抑制蛋白具有seq id no：16的序列。
85.在另一方面中，所述发明涉及包含本发明的β
‑
抑制蛋白突变体的组合物。
86.在另一方面中，所述发明涉及突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的对(pair)。
87.优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
88.在另一方面中，所述发明涉及包含突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的对的组合物。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。在所述对中，所述突变体β
‑
抑制蛋白和所述gpcr可以彼此分离或相互结合。在包含突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的对的所述组合物中，所述突变体β
‑
抑制蛋白和所述gpcr可以彼此分离、相互结合或彼此部分结合且部分分离。
89.在另一方面中，所述发明涉及突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的复合物。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
90.在另一方面中，所述发明涉及包含突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的复合物的组合物。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。在复合物中，所述突变体β
‑
抑制蛋白和所述gpcr彼此结合。
91.在另一方面中，所述发明涉及编码本发明的突变体β
‑
抑制蛋白的载体。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
92.在另一方面中，所述发明涉及包含编码本发明的突变体β
‑
抑制蛋白的载体的组合物。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
93.在另一方面中，所述发明涉及包含本发明的突变体β
‑
抑制蛋白和编码本发明的突变体β
‑
抑制蛋白的载体的组合物。
94.在另一方面中，本发明涉及本发明的突变体β
‑
抑制蛋白或本发明的突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的复合物用于gpcr或gpcr与本发明的突变体β
‑
抑制蛋白的复合物的结构确证的用途。优选地，所述gpcr是视紫红质样受体，更优选a17亚家族的视紫红质样受体。再更优选地，所述gpcr是肾上腺素能受体。再更优选地，所述gpcr是β
‑
2肾上腺素能受体。优选地，所述β
‑
2肾上腺素能受体是规范的天然存在的人、小鼠、大鼠或牛的β
‑
2肾上腺素能受体。
95.本发明的β
‑
抑制蛋白突变体使gpcr与所述β
‑
抑制蛋白突变体的复合物稳定。在一个优选实施方案中，所述β
‑
抑制蛋白突变体将gpcr稳定在配体诱导的激活状态下。gpcr与本发明的突变体β
‑
抑制蛋白的复合物在gpcr或gpcr
‑
抑制蛋白复合物的结构确证(例如通过蛋白质结晶或其他手段)中具有合适的性质。在一个优选实施方案中，已确证的gpcr或gpcr与β
‑
抑制蛋白突变体的复合物的结构用于在计算机中设计和筛选药物候选物。
96.在另一方面中，本发明涉及本发明的突变体β
‑
抑制蛋白或本发明的突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的复合物用于药物筛选、优选在计算机中进行的药物筛选的用途。在一个优选实施方案中，所述gpcr是β2ar。在一个优选实施方案中，本发明的突变体β
‑
抑制蛋白与gpcr的复合物由本发明的β
‑
抑制蛋白突变体稳定。优选地，本发明的所述β
‑
抑制蛋白突变体能够使gpcr稳定在配体诱导的激活状态下。gpcr的这种激活状态示例性地以β2ar示出(rasmussen et al.，structure of a nanobody
‑
stabilized active state of the beta2
‑
adrenoceptor，nature，2011；rasmussen et al.，crystal structure of the beta2
‑
adrenergic receptor
‑
gs protein complex，nature，2011)。这样的稳定的gpcr/突变体β
‑
抑制蛋白复合物用于无细胞和基于细胞的测定中的药物筛选。在一个优选实施方案中，药物筛选基于无细胞和基于细胞的测定。本发明的所述β
‑
抑制蛋白突变体能够提高β
‑
抑制蛋白募集到gpcr、优选到β2ar的效力和效价，如bret测定中所证明(实施例1，表1)。提高的募集值在基于细胞和无细胞的抑制蛋白募集测定中可能有用，以提高信噪比，特别是对于本质上以低效率募集抑制蛋白而导致低信噪比的gpcr类型。在一个优选实施方案中，测量了本发明的β
‑
抑制蛋白突变体募集到gpcr的效率。
97.序列
[0098][0099]
seq id no：1：人野生型(wt)抑制蛋白
‑3[0100][0101]
seq id no：2：与人wt抑制蛋白
‑
3相比，含有t299a和i386a的抑制蛋白
‑
3双突变体a(所述氨基酸位置对应于人wt抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)中的t299a和i386a)。
[0102][0103]
seq id no：3：与人wt抑制蛋白
‑
3相比，含有t299a、i386a和r166a的抑制蛋白
‑
3三重突变体b(所述氨基酸位置对应于人wt抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)中的t299a、i386a和r166a)。
[0104][0105]
seq id no：4：与人wt抑制蛋白
‑
3相比，含有t299a、i386a和d298a的抑制蛋白
‑
3三重突变体c(所述氨基酸位置对应于人wt抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)中的t299a、i386a和d298a)。
[0122][0123]
seq id no：13：与人wt抑制蛋白
‑
3相比，含有t298a和i386a的抑制蛋白
‑
2双突变体(所述氨基酸位置对应于人wt抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)中的t299a和i386a)。
[0124][0125]
seq id no：14：与人wt抑制蛋白
‑
3相比，含有t298a、i386a和r165a的抑制蛋白
‑
2三重突变体(所述氨基酸位置对应于人wt抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)中的t299a、i386a和r166a)。
[0126][0127]
seq id no：15：与人wt抑制蛋白
‑
3相比，含有t298a、i386a和d297a的抑制蛋白
‑
2三重突变体c(所述氨基酸位置对应于人wt抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)中的t299a、i386a和d298a)。
[0128][0129]
seq id no：16：与人wt抑制蛋白
‑
3相比，含有t298a、i386a和r393a的抑制蛋白
‑
2三重突变体d(所述氨基酸位置对应于人wt抑制蛋白
‑
3(seq id no：1)中的t299a、i386a和r393a)。
[0130]
seq id no：序列名称：1人野生型(wt)抑制蛋白
‑
32含有t299a和i386a的抑制蛋白
‑
3双突变体a
3含有t299a、i386a和r166a的抑制蛋白
‑
3三重突变体b4含有t299a、i386a和d298a的抑制蛋白
‑
3三重突变体c5含有t299a、i386a和r393a的抑制蛋白
‑
3三重突变体d6人野生型抑制蛋白
‑
27小鼠野生型抑制蛋白
‑
38大鼠野生型抑制蛋白
‑
39牛野生型抑制蛋白
‑
310小鼠野生型抑制蛋白
‑
211大鼠野生型抑制蛋白
‑
212牛野生型抑制蛋白
‑
213含有t298a和i386a的抑制蛋白
‑
2双突变体14含有t298a、i386a和r165a的抑制蛋白
‑
2三重突变体15含有t298a、i386a和d297a的抑制蛋白
‑
2三重突变体16含有t298a、i386a和r393a的抑制蛋白
‑
2三重突变体
实施例
[0131]
实施例1
‑
在生物发光共振能量转移(bret)测定中向β2
‑
肾上腺素能受体(β2ar，b2ar)募集野生型抑制蛋白
‑
3和抑制蛋白
‑
3双突变体和三重突变体
[0132]
材料和方法：
[0133]
将he位置r166a、d298和r393细胞以每孔约25000个细胞的密度接种到聚
‑
l
‑
赖氨酸包被的白色96孔板上。24小时后，使用lipofectamine2000(thermofisher)将细胞与bret供体构建体(90ng/孔的rluc8β2ar)和10ng的bret受体构建体(10ng/孔的gfp
‑
抑制蛋白
‑
3wt或者突变体a、b、c或d)瞬时共转染。转染后第二天，用新鲜培养基交换细胞培养基。再过24小时后，用测定缓冲液(hbss+20mm hepes且ph 7.4)替换细胞培养基，并用5μm细胞渗透性底物腔肠素400a(cayman chemical)处理细胞，腔肠素由bret供体rluc8催化，导致发光(λ
max
＝410nm)。在具有光学模块(bret2 plus，515
‑
30，410
‑
80)的读板器pherastar fsx(bmg biotech)中进行bret测量。在t＝4.5分钟时，将异丙肾上腺素(tocris bioscience)以递增的浓度添加至细胞(10pm至10μm)。bret比率通过计算gfp发射的光强度(515nm)与rluc8/腔肠素400a发射的光强度(410nm)的比率来确定。减去bret比率基线(异丙肾上腺素刺激前)，计算曲线下面积(auc)(异丙肾上腺素刺激19.5分钟)并相对于异丙肾上腺素浓度进行绘制。bret信号以gfp
‑
抑制蛋白
‑
3wt的募集百分比(设定为100％)表示，并且效价(pec
50
±
sd)和效力(e
max
±
sd)由graphpad prism 7.04软件(san diego，california，usa)中的非线性回归计算得出。将所有突变体的最大效力(e
max
)归一化为其各自的wt抑制蛋白
‑
3，10μm异丙肾上腺素条件(设定为100％)。决定系数r2可在0到1之间，并且表示实验值(标记，图1)和非线性回归分析(曲线，图1)之间的拟合质量。实验在两个独立的实验中以技术上的重复进行。
[0134]
结果：
[0135]
进行了基于生物发光共振能量转移(bret)的抑制蛋白募集测定，以比较抑制蛋白
‑
3双突变体和三重突变体与野生型抑制蛋白
‑
3对b2ar的募集效率。异丙肾上腺素诱导的
不同的基础构象。换言之，抑制蛋白
‑
3突变体的激活机制比未经修饰的抑制蛋白野生型蛋白需要更少的能量。发明人假设，通过移除这个另外的激活步骤促进了抑制蛋白募集到β2ar。这将能够检测对展示出低抑制蛋白募集能力的gpcr，例如a类gpcr的抑制蛋白募集响应，已知所述a类gpcr仅与抑制蛋白经历微弱和短暂的相互作用，因此测量抑制蛋白募集响应可具有挑战性。此外，这种新的“更强的抑制蛋白募集者”可用于使β2ar或任何其他gpcr稳定，以例如通过结晶或通过其他方式促进作为单独的gpcr或作为gpcr
‑
抑制蛋白复合物的gpcr，特别是处于其激活构象的gpcr的纯化或结构确证。
[0142]
实施例2
‑
突变体抑制蛋白
‑
3表达水平的监测
[0143]
材料和方法：
[0144]
根据实施例1的方案，将抑制蛋白
‑
3突变体与egfp探针融合。通过在读板器中使用光学模块fi 485 520测量gfp荧光(例如，在bret测量之前)来确定构建体的表达水平。
[0145]
结果：
[0146]
如表3所示，与wt抑制蛋白
‑
3相比，所有抑制蛋白
‑
3突变体均在细胞中的表达较少(26％至55％)。与bret测定相比，通过灯在485nm处闪烁诱导gfp荧光，并在同一读板器中测量每个孔的荧光。将两次测定中的值取平均值并以wt归一化。尽管抑制蛋白
‑
3突变体在人hek293细胞中的表达持续较低(与wt抑制蛋白
‑
3相比在40％至65％的范围，参见表3)，但仍观察到抑制蛋白
‑
3突变体对β2ar的更强募集。考虑到这一因素，本发明的抑制蛋白
‑
3突变体的蛋白质
‑
蛋白质相互作用的实际强度应超过bret测定给出的实验值，即，如果根据其较低的表达水平对值进行校正，则抑制蛋白
‑
3突变体对b2ar的募集能力似乎甚至更高。
[0147]
讨论：
[0148]
细胞中的蛋白质表达是不可预测的。例如，向wt抑制蛋白
‑
3添加2个丙氨酸突变使双突变体a的表达降低了74％，而三重突变体c中的另一个突变使表达从36％提高到55％。
[0149]
当分析蛋白质
‑
蛋白质募集时，测量细胞中的表达水平是必要的，因为严格的蛋白质
‑
蛋白质亲和力与效价、效力以及表达水平相关。尽管抑制蛋白
‑
3突变体的表达谱较低，但检测到突变体a、b和c的较高募集谱。表观的β2ar
‑
抑制蛋白
‑
3突变体复合物亲和力将因此在晶体学研究中加剧，这是由于其在化学计量条件下进行。
[0150]
表2：突变体抑制蛋白
‑
3的表达水平
[0151] 与wt相比的gfp水平(％)wt抑制蛋白
‑
3100％双突变体a36％三重突变体b35％三重突变体c55％三重突变体d26％