用于评估T细胞功能和预测对疗法的应答的方法和药剂与流程

用于评估t细胞功能和预测对疗法的应答的方法和药剂
技术领域
1.本公开总体上涉及用于评估t细胞功能和预测对疗法的应答的方法和药剂/试剂。更具体而言，本发明涉及用于检测t细胞中不同形式的脱中胚蛋白(eomesodermin，eomes)的方法和药剂/试剂，其可用于评估t细胞功能、评估受试者的免疫功能、预测癌症患者对疗法(包括免疫疗法)的应答可能性、将癌症患者分层为对疗法的可能应答者或无应答者，以及管理癌症患者的治疗。相关申请
2.本技术要求于2019年2月27日提交的名称为“用于评估t细胞功能和预测对疗法的应答的方法和药剂”的澳大利亚临时申请号2019900628的优先权，其内容通过引用方式整体并入本文。


背景技术：

3.癌症是全世界发病率和死亡率的重要原因。尽管多年来许多不同癌症类型的护理标准已经大大提高，但目前的护理标准仍然未能满足对有效疗法的需求，以改善癌症的治疗。靶向细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)和程序性细胞死亡受体
‑
1(pd
‑
1)及其配体pd
‑
l1的免疫肿瘤学药剂的临床应用，已经使治疗许多癌症类型的护理标准得到提高。虽然这些检查点抑制剂在某些癌症中产生改进的临床应答，但持久的临床应答仅发生在大约10
‑
45％的患者中。而且，相当数量的肿瘤要么产生抗性，要么变得难治性。例如，大约20
‑
50％的黑色素瘤和肺癌会对免疫疗法产生明显应答，而其它的则不会。因此，从医疗护理和患者生活质量的角度来看，确定哪些受试者是更合适的癌症疗法候选者是非常有利的。
4.相应地，在本领域中仍然需要有助于以改进的准确性预测对疗法(包括免疫疗法)的应答的方法和药剂/试剂。


技术实现要素：

5.本发明部分源于确定了在t细胞中eomes的不同翻译后修饰与该转录因子定位于不同的细胞区室有关。而且，不同的翻译后修饰与不同的t细胞功能和对癌症疗法的不同应答性有关。特别是，本发明人已经发现，eomes的核定位序列(nls)中赖氨酸(即，eomes
‑
641k)的不同翻译后修饰与eomes定位于细胞核还是细胞质有关。更具体地，发现eomes
‑
641k的乙酰化(即，eomes
‑
263k
‑
ac)与eomes偏向定位于细胞核有关。感兴趣的是，发现eomes的这种乙酰化形式还与t细胞衰竭和对疗法的抗性或无应答性有关。与之相反，发现eomes
‑
641k的甲基化(即，eomes
‑
641k
‑
me)通常与eomes更偏向定位于t细胞的细胞质有关。这种形式的eomes也与具有活性(competent)免疫功能的t细胞有关，并与对癌症疗法的应答性相关。本发明人还证明，eomes的dna结合结构域中赖氨酸(即，eomes
‑
373k)的翻译后修饰与对癌症疗法的应答性相关。具体来说，eomes
‑
373k的甲基化(即，eomes
‑
373k
‑
me)与偏向细胞质定位和对癌症疗法的应答性有关。
6.如下文所述，已将这些发现简化为方法实践和药剂/试剂，以用于评估t细胞功能、
用于评估受试者的免疫功能、用于预测和/或监测对疗法的应答、用于根据eomes在t细胞中的表达形式将患者分层为可能应答者或无应答者、用于根据分层来管理患者的治疗、以及用于预测临床结果。
7.因此，一方面，本文提供的是一种用于评估t细胞功能的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：在t细胞中检测eomes的核定位序列和/或dna结合基序中的翻译后修饰。
8.在一个实施方案中，该方法包括检测t细胞中eomes
‑
641k的乙酰化(本文也称为“eomes
‑
641k
‑
ac”)，并确定t细胞是功能失调的。在一个特定的实施方案中，在t细胞中检测到相对于合适的对照(例如，功能性t细胞)的eomes
‑
641k
‑
ac水平升高。该方法还可以包括检测eomes
‑
641k
‑
ac在t细胞中的细胞定位(例如，细胞核和/或细胞质定位)。在一个特定的示例中，该方法包括检测eomes
‑
641k
‑
ac在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
9.在用于评估t细胞功能的方法的又一实施方案中，该方法包括检测t细胞中eomes
‑
641k的甲基化(本文也称为“eomes
‑
641k
‑
me”)，并确定t细胞是功能性的。例如，可以在t细胞中检测到相对于合适的对照(例如，功能失调的t细胞)的eomes
‑
641k
‑
me水平升高。该方法还可以包括检测eomes
‑
641k
‑
me在t细胞中的细胞定位(例如，细胞核和/或细胞质定位)。在一个示例中，检测了eomes
‑
641k
‑
me在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
10.在用于评估t细胞功能的方法的另一实施方案中，该方法包括检测t细胞中eomes
‑
373k的甲基化(本文也称为“eomes
‑
373k
‑
me”)，并确定t细胞是功能性的。在一个示例中，在t细胞中检测到相对于合适的对照(例如，功能失调的t细胞)的eomes
‑
373k
‑
me水平升高。该方法还可以包括检测eomes
‑
373k
‑
me在t细胞中的细胞定位(例如，细胞核和/或细胞质定位)。在一个实施方案中，检测了eomes
‑
373k
‑
me在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
11.本发明的又一方面提供了用于预测患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的应答可能性的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：在获自受试者的t细胞或t细胞群中检测eomes的核定位序列和/或eomes的dna结合基序中的翻译后修饰，从而预测受试者对疗法的应答可能性。
12.在本方法的一个实施方案中，该方法包括检测t细胞或t细胞群中eomes
‑
641k的乙酰化(本文也称为“eomes
‑
641k
‑
ac”)，以此确定受试者对疗法有抗性或无应答性的可能性增加。在一个示例中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测相对于合适的对照(例如，功能性t细胞或获自健康受试者的t细胞)的eomes
‑
641k
‑
ac水平升高。该方法还可以包括检测eomes
‑
641k
‑
ac在t细胞中的细胞定位(例如，细胞核和/或细胞质定位)。在一个特定的示例中，该方法包括检测eomes
‑
641k
‑
ac在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
13.在用于预测患有癌症的受试者对疗法的应答可能性的方法的又一实施方案中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
641k的甲基化(本文也称为“eomes
‑
641k
‑
me”)，以此确定受试者对疗法的敏感性或应答性的可能性增加。在一个示例中，在t细胞或t细胞群中检测到相对于合适的对照(例如，功能失调的t细胞)的eomes
‑
641k
‑
me水平升高。该方
法还可以包括检测eomes
‑
641k
‑
me在t细胞中的细胞定位(例如，细胞核和/或细胞质定位)。在一个示例中，检测了eomes
‑
641k
‑
me在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
14.在用于预测患有癌症的受试者对疗法的应答可能性的方法的另一实施方案中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
373k的甲基化(本文也称为“eomes
‑
373k
‑
me”)，以此确定受试者对疗法的敏感性或应答性的可能性增加。在一个示例中，在t细胞或t细胞群中检测到相对于合适的对照(例如，功能失调的t细胞)的eomes
‑
373k
‑
me水平升高。该方法还可以包括检测eomes
‑
373k
‑
me在t细胞中的细胞定位(例如，细胞核和/或细胞质定位)，并且任选地检测eomes
‑
373k
‑
me在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
15.本发明的另一方面涉及用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有抗性的可能性的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：在获自受试者的t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
641k
‑
ac的存在，以此确定受试者对疗法有抗性的可能性增加。在一个实施方案中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测相对于合适的对照(例如，功能性t细胞或者获自健康受试者或对癌症疗法敏感的受试者的t细胞)的eomes
‑
641k
‑
ac水平升高，这表明受试者对疗法有抗性的可能性增加。在一个特定的示例中，该方法包括使包含t细胞或t细胞群的样品与特异性结合eomes
‑
641k
‑
ac的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
ac的复合物，以此确定受试者对疗法有抗性的可能性增加。
16.本文还提供了一种用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有敏感性的可能性的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：在获自受试者的t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
641k
‑
me的存在，以此确定受试者对该疗法有敏感性的可能性增加。在一个示例中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测相对于合适的对照(例如，功能失调的t细胞或者获自对癌症疗法有抗性的受试者的t细胞)的eomes
‑
641k
‑
me水平升高，这表明受试者对于疗法有敏感性的可能性增加。在一个特定的实施方案中，该方法包括使包含t细胞或t细胞群的样品与特异性结合eomes
‑
641k
‑
me的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
me的复合物，以此确定受试者对疗法有敏感性的可能性增加。
17.在又一方面中，本文提供的是一种用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有敏感性的可能性的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：在获自受试者的t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
373k
‑
me的存在，以此确定受试者对疗法有敏感性的可能性增加。在一些示例中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测相对于合适的对照(例如，功能失调的t细胞或者获自对癌症疗法有抗性的受试者的t细胞)的eomes
‑
373k
‑
me水平升高，这表明受试者对疗法有敏感性的可能性增加。在进一步的示例中，该方法包括使包含t细胞或t细胞群的样品与特异性结合eomes
‑
373k
‑
me的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
373k
‑
me的复合物，以此确定受试者对疗法有敏感性的可能性增加。
18.在另一方面中，本发明提供了一种用于预测患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的应答可能性的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列
步骤组成：在获自受试者的t细胞或t细胞群中测量eomes
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641k
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ac和eomes
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641k
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me的水平；对t细胞或t细胞群中eomes
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641k
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ac和eomes
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641k
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me的水平进行比较；并基于该比较预测受试者对疗法的应答，其中eomes
‑
641k
‑
ac的水平高于eomes
‑
641k
‑
me表明受试者对疗法有抗性的可能性增加，而其中eomes
‑
641k
‑
me的水平高于eomes
‑
641k
‑
ac表明受试者对疗法有敏感性的可能性增加。在一个实施方案中，该方法包括使包含t细胞或t细胞群的样品与特异性结合eomes
‑
641k
‑
ac的第一抗原结合分子和特异性结合eomes
‑
641k
‑
me的第二抗原结合分子接触；在样品中测量包含第一抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
ac的第一复合物的水平以及包含第二抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
me的第二复合物的水平；并基于该比较预测受试者对疗法的应答可能性，其中在样品中第一复合物的水平高于第二复合物表明受试者对疗法有抗性的可能性增加，而其中在样品中第二复合物的水平高于第一复合物表明受试者对疗法有敏感性的可能性增加。该方法还可以涉及在t细胞或t细胞群中检测至少一种其它的生物标志物，例如ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
‑
2、ki67、pd
‑
1和/或cd107a。
19.还提供了一种用于将患有癌症的受试者分层为对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的可能应答者或无应答者的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：在取自受试者的样品中检测t细胞或t细胞群，该t细胞或t细胞群包含eomes的核定位序列和/或dna结合基序中的翻译后修饰，从而将受试者分层为对疗法的可能应答者或无应答者。
20.在一个示例中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
641k
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ac，并将受试者分层为对疗法的可能无应答者。在一个特定的实施方案中，该方法包括使样品与特异性结合eomes
‑
641k
‑
ac的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
ac的复合物，从而将受试者分层为对疗法的可能无应答者。在又一实施方案中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
641k
‑
me，并将受试者分层为对疗法的可能应答者，例如通过使样品与特异性结合eomes
‑
641k
‑
me的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
me的复合物，从而将受试者分层为对疗法的可能应答者。在另一实施方案中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
373k
‑
me，并将受试者分层为对疗法的可能应答者，例如通过使样品与特异性结合eomes
‑
373k
‑
me的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
373k
‑
me的复合物，从而将受试者分层为对疗法的可能应答者。
21.在用于将患有癌症的受试者分层为对疗法的可能应答者或无应答者的方法的一个实施方案中，该方法包括使样品与特异性结合eomes
‑
641k
‑
ac的第一抗原结合分子和特异性结合eomes
‑
641k
‑
me的第二抗原结合分子接触；在样品中测量包含第一抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
ac的第一复合物的水平以及包含第二抗原结合分子和eomes
‑
641k
‑
me的第二复合物的水平；并基于该比较将受试者分层为可能的应答者或无应答者，其中在样品中如果第一复合物的水平高于第二复合物，则将受试者分层为可能无应答者，而其中在样品中如果第二复合物的水平高于第一复合物，则将受试者分层为可能应答者。
22.还提供了一种对用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)治疗患有癌症的受试者进行管理的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：基于受试者是该疗法的可能应答者，选择用该疗法进行治疗的患有癌症的受试者，或者基于受试者是该疗法的可能无应答者，选择不用该疗法进行治疗的患有癌症的受试者，并根据此选择用或不
用该疗法对受试者进行治疗，其中此选择基于一种分层方法，该分层方法包括在取自受试者的样品中检测包含eomes的核定位序列和/或dna结合基序中的翻译后修饰的t细胞或t细胞群，以此将受试者分层为对疗法的可能应答者或无应答者。在一个示例中，该分层方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
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641k
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me，并将受试者分层为对疗法的可能应答者，例如通过使样品与特异性结合eomes
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641k
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me的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
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641k
‑
me的复合物，以此将受试者分层为对疗法的可能应答者。在另一示例中，该分层方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
373k
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me，并将受试者分层为对疗法的可能应答者，例如通过使样品与特异性结合eomes
‑
373k
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me的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
373k
‑
me的复合物，以此将受试者分层为对疗法的可能应答者。在又一示例中，该分层方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
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641k
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ac，并将患者分层为对疗法的可能无应答者，例如通过使样品与特异性结合eomes
‑
641k
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ac的抗原结合分子接触，并在样品中检测包含抗原结合分子和eomes
‑
641k
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ac的复合物，以此将患者分层为对疗法的可能无应答者。在一个特定的实施方案中，该分层方法包括使样品与特异性结合eomes
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641k
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ac的第一抗原结合分子和特异性结合eomes
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641k
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me的第二抗原结合分子接触；在样品中测量包含第一抗原结合分子和eomes
‑
641k
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ac的第一复合物的水平以及包含第二抗原结合分子和eomes
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641k
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me的第二复合物的水平；并基于比较将受试者分层为可能应答者或无应答者，其中在样品中如果第一复合物的水平高于第二复合物，则将受试者分层为可能无应答者，而其中在样品中如果第二复合物的水平高于第一复合物，则将受试者分层为可能应答者。
23.在上述方法的一些示例中，所述方法还包括在t细胞或t细胞群中检测至少一种其它的生物标志物，例如ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
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2、ki67、pd
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1和/或cd107a。
24.在又一方面中，提供的是一种用于评估受试者免疫功能的方法，该方法包括下列步骤、由或基本上由下列步骤组成：在获自受试者的t细胞或t细胞群中检测eomes的核定位序列和/或eomes的dna结合基序中的翻译后修饰。
25.在一个实施方案中，该方法涉及在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
641k的乙酰化(本文也称为“eomes
‑
641k
‑
ac”)，从而确定受试者的免疫功能受损。例如，该方法可以包括在t细胞或t细胞群中检测相对于合适的对照(例如，从具有正常或活性免疫功能的受试者获取的t细胞)的eomes
‑
641k
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ac水平升高。在一些实施方案中，检测了eomes
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641k
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ac在t细胞中的细胞定位，例如细胞核和/或细胞质定位。在一个特定的示例中，该方法包括检测eomes
‑
641k
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ac在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
26.在又一实施方案中，用于评估免疫功能的方法包括在在t细胞或t细胞群中检测eomes
‑
641k的甲基化(本文也称为“eomes
‑
641k
‑
me”)，以此确定受试者具有正常或活性免疫功能，例如在t细胞或t细胞群中检测相对于合适的对照(例如，来自免疫功能受损的受试者的t细胞)的eomes
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641k
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me水平升高。在一个示例中，检测了eomes
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641k
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me在t细胞中的细胞定位，例如细胞核和/或细胞质定位。在一个特定的示例中，该方法包括检测eomes
‑
641k
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me在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
27.在另一实施方案中，该方法包括在t细胞或t细胞群中检测eomes
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373k的甲基化(本文也称为“eomes
‑
373k
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me”)，以此确定受试者具有正常或活性免疫功能，例如在t细胞或t细胞群中检测相对于合适的对照(例如，来自免疫功能受损的受试者的t细胞)的eomes
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373k
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me水平升高。在一个实施方案中，该方法包括检测eomes
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373k
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me在t细胞中的细胞定位，例如检测eomes
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373k
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me在t细胞中的细胞核和/或细胞质定位，以及任选地检测eomes
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373k
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me在t细胞中细胞核与细胞质定位的比率或细胞质与细胞核定位的比率。
28.还提供了一种特异性结合eomes
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ac的抗原结合分子，其适用于评估t细胞功能、用于预测患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的应答可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有抗性的可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有敏感性的可能性、用于将患有癌症的受试者分层为对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的可能应答者或无应答者、用于对患有癌症的受试者用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的治疗进行管理、用于评估受试者的免疫功能和/或对免疫功能受损或下降的受试者用疗法(例如，免疫疗法)的治疗进行管理。
29.在另一方面中，提供了一种复合物，该复合物包含eomes
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ac和特异性结合eomes
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ac的抗原结合分子。
30.在又一方面中，提供了一种特异性结合eomes
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me的抗原结合分子，其适用于评估t细胞功能、用于预测患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的应答可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有抗性的可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有敏感性的可能性、用于将患有癌症的受试者分层为对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的可能应答者或无应答者、用于对患有癌症的受试者用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的治疗进行管理、用于评估受试者的免疫功能和/或对免疫功能受损或下降的受试者用疗法(例如，免疫疗法)的治疗进行管理。
31.本文还描述了一种复合物，其包含eomes
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me和特异性结合eomes
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me的抗原结合分子。
32.在另一方面中，提供了一种特异性结合eomes
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me的抗原结合分子，其适用于评估t细胞功能、用于预测患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的应答可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有抗性的可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有敏感性的可能性、用于将患有癌症的受试者分层为对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的可能应答者或无应答者、用于对患有癌症的受试者用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的治疗进行管理、用于评估受试者的免疫功能和/或对免疫功能受损或下降的受试者用疗法(例如，免疫疗法)的治疗进行管理。
33.还提供了一种复合物，该复合物包含eomes
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me和特异性结合eomes
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me的抗原结合分子。
34.本发明的又一方面提供了一种试剂盒，该试剂盒用于评估t细胞功能、用于预测患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的应答可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有抗性的可能性、用于确定患有癌症的受试者对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)有敏感性的可能性、用于将患有癌症的受试者分层为对疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的可能应答者或无应答者、用于对患有癌症的受试者用疗法(例如，细胞毒性疗法和/或免疫疗法)的治疗进行管
理、用于评估受试者的免疫功能和/或对免疫功能受损或下降的受试者用疗法(例如，免疫疗法)的治疗进行管理，其中该试剂盒包括特异性结合eomes
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ac的抗原结合分子、特异性结合eomes
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me的抗原结合分子和特异性结合eomes
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me的抗原结合分子中的至少一种、至少两种或每一种。在一个实施方案中，该试剂盒还包含一种或多种对照，包括阳性对照和阴性对照，例如，其中该阳性对照选自于eomes
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ac多肽、eomes
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me多肽和eomes
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373k
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me多肽。该试剂盒可以任选地包括用于执行上述和本文所述方法的说明材料。
35.本发明的另一方面涉及包含复合物的t细胞，该复合物包含eomes
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ac和特异性结合eomes
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ac的第一抗原结合分子；eomes
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me和特异性结合eomes
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me的第一抗原结合分子；或eomes
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373
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me和特异性结合eomes
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‑
me的第一抗原结合分子。在一个示例中，t细胞还包含结合第一抗原结合分子的第二抗原结合分子，例如包含可检测标记的第二抗原结合分子。
36.在上述和本文所述的方法、试剂盒、抗原结合分子、复合物或t细胞的一个实施方案中，疗法是免疫疗法，例如免疫检查点抑制剂。示例性的抑制剂包括特异性结合免疫检查点分子的拮抗剂抗原结合分子(例如，抗体)。在一个示例中，拮抗剂抗原结合分子(例如，抗体)特异性结合于选自pd
‑
1、pd
‑
l1和ctla4的免疫检查点分子。
附图说明
37.图1是示意性的图形和影像表征，其示出了从健康供体和患有转移性乳腺癌或黑色素瘤的患者分离出的cd8
+
t细胞中eomes的普遍性。在基线采血后的24个月内，每3个月从健康供体(hd)、转移性乳腺癌患者或黑色素瘤患者的液体活检中分离出cd8
+
t细胞。根据对免疫疗法治疗(使用帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)和/或伊匹单抗(ipilimumab)的单一或双重疗法)的客观应答，将黑色素瘤患者进一步划分为完全应答(cr)、部分应答(pr)、病情稳定(sd)或病情进展(pd)。所绘制的图表示出了如recist 1.1所述的对于pd(病情进展)或cr(完全应答)患者队列的肿瘤生长变化％。(a)如上所述，从完全应答(cr)、病情稳定(sd)或病情进展(pd)的黑色素瘤患者中分离出cd8
+
t细胞。以佛波醇
‑
12
‑
肉豆蔻酸酯13
‑
乙酸酯联合钙离子载体a23187(pma/ci)刺激细胞或不刺激细胞，然后固定。对ns cd8
+
t细胞使用抗ki67的一抗，对ns或st cd8
+
t细胞使用抗tnf
‑
α或抗ifn
‑
γ的一抗，连同dapi染色来进行免疫荧光显微术。这些图表示ki67的细胞核荧光强度(nfi)值以及tnf
‑
α和ifn
‑
γ的总荧光强度(tfi)值，并使用imagej进行测量以选择细胞核减去背景(对于一个队列10名患者，每名患者n>20个单个细胞)。(b)如上所述，从健康供体(hd)以及划分为完全应答(cr)、部分应答(pr)、病情稳定(sd)或病情进展(pd)的黑色素瘤患者中分离出cd8
+
t细胞。将细胞固定，并使用针对eomes和pd1的一抗连同dapi染色进行免疫荧光显微术。这些图表示eomes复合物的nfi值和pd
‑
1的平均tfi，并使用通用扫描和分析系统(applied scientific instrumentation；asi)测量，该系统对多重化免疫荧光样品进行高通量if显微术，以对细胞数和if信号强度进行定量(对于一个队列10名患者，每名患者n>2500个单个细胞)。该图表示％细胞群。(c)eomes蛋白结构，其示出了nls结构域。(d)eomes质粒的示意图：eomes wt(e
‑
wt；野生型eomes)；eomes突变体1(e
‑
mut1；在641位赖氨酸上具有丙氨酸突变的eomes，它模拟了赖氨酸残基的非乙酰化或非甲基化)；和eomes突变体2(e
‑
mut2；在641位赖氨酸上具有苯丙氨酸突变的eomes，它模拟了赖氨酸残基的高甲基化状态)。(e)用仅空载体(vo)、e
‑
wt、e
‑
mut1或e
‑
mut2转染jurkat t细胞，并用抗eomes、抗tbet和抗pd1抗体探测。所绘之图表示eomes的fn/c、eomes的平均nfi或pd
‑
1的平均tfi，其使用imagej减去背景进行测量(对于每组，n＝>20个细胞)。示出了每个数据集的代表性图像。比例尺显示为橙色，长度等同于10mm。(f)用抗ki67、抗ifn
‑
γ和抗tnf
‑
α抗体来探测以vo、e
‑
wt、e
‑
mut1或e
‑
mut2转染的jurkat t细胞。所绘之图表示使用imagej减去背景所测量的ki67、ifn
‑
γ和tnf
‑
α的tfi(对于每组，n＝>20个细胞)。
38.图2是针对多种eomes多肽产生的多克隆兔抗体的特异性的图形表征。(a)针对无翻译后修饰的eomes多肽产生的抗体。(b)针对在641位赖氨酸上具有乙酰化的eomes多肽产生的抗体。(c)针对在641位赖氨酸上具有甲基化的eomes多肽产生的抗体。(d)针对在373位赖氨酸上具有甲基化的eomes多肽产生的抗体。
39.图3是示意图和图形表征，其示出了抗eomes抗体预测患者对免疫疗法应答的能力。(a)eomes蛋白结构，其示出了dna结合结构域。(b)针对nls基序或dna结合基序特异性的多克隆抗体的产生示意图，这些基序未经修饰或者经甲基化(me)或乙酰化(ac)修饰。(c)采用bond rx(leica biosystems)，将来自原发性肿瘤基线活检的黑色素瘤患者的福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样品(最终划分为应答者或抗性者队列)进行处理用于3d高分辨率显微术。将ffpe组织进行固定，并通过使用针对cd8、乙酰化eomes(抗eomes
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ac；"eomes
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ac")或甲基化eomes(抗eomes
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me；"eomes
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me")的一抗连同dapi染色对样品探测来进行免疫荧光显微术。所绘之图表示eomes
‑
me的平均nfi值和eomes
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ac的平均nfi，其使用imagej减去背景进行测量(对于每个患者样品，n＝90个细胞。以n＝10名患者为一个队列)。(d)在基线采血后的24个月内，每3个月从知情同意的黑色素瘤患者中取液体活检。根据对免疫疗法治疗(使用帕博利珠单抗、纳武单抗和/或伊匹单抗的单一或双重疗法)的客观应答，将患者进一步划分为对免疫疗法有抗性或存在应答。以抗cd8抗体和抗eomes
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‑
ac多克隆抗体对从按照recist 1.1所定义的抗性者队列或应答者队列血液中分离出的cd8
+
t细胞进行筛选。将细胞固定，并以抗体和dapi染色进行免疫荧光显微术。所绘之图表示使用imagej减去背景所测量的eomes
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ac的平均nfi和细胞质荧光强度(cfi)，每个队列n＝10名患者(每组n＝10名患者)。(e)在基线采血后的24个月内，每3个月从知情同意的黑色素瘤患者中取液体活检。根据对免疫疗法治疗(使用帕博利珠单抗、纳武单抗和/或伊匹单抗的单一或双重疗法)的客观应答，将患者进一步划分为对免疫疗法有抗性或存在应答。以抗cd8抗体和抗eomes
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‑
me多克隆抗体对从按照recist 1.1所定义的抗性者队列或应答者队列血液中分离出的cd8
+
t细胞进行筛选。将细胞固定，并以抗体和dapi染色进行免疫荧光显微术。所绘之图表示使用imagej减去背景所测量的eomes
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me的平均nfi、cfi(每组n＝10名患者)。(f)在基线采血后的24个月内，每3个月从知情同意的黑色素瘤患者中取液体活检。根据对免疫疗法治疗(使用帕博利珠单抗、纳武单抗和/或伊匹单抗的单一或双重疗法)的客观应答，将患者进一步划分为对免疫疗法有抗性或存在应答。以抗cd8抗体和抗eomes
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me多克隆抗体对从按照recist 1.1所定义的抗性者队列或应答者队列血液中分离出的cd8
+
t细胞进行筛选。将细胞固定，并以抗体和dapi染色进行免疫荧光显微术。所绘之图表示使用imagej减去背景所测量的eomes
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me的平均nfi、cfi(每组n＝10名患者)。(g)在基线采血后的12个月内，每1个月从知情同意的具有braca阳性、三阴性乳腺癌
(tnbc)患者中取液体活检。以抗cd8抗体、抗eomes
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me多克隆抗体或抗eomes
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ac多克隆抗体对从按照recist 1.1所定义的抗性者队列或应答者队列血液中分离出的cd8
+
t细胞进行筛选。将细胞固定，并以抗体和dapi染色进行免疫荧光显微术。所绘之图表示使用imagej减去背景所测量的eomes
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ac的平均fi和eomes
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me的fi(每组n＝10名患者)。
40.图4是图形表征，其示出了经翻译后修饰的eomes在脑癌转移病灶中的普遍性。使用bond rx和opal
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5多色自动化试剂盒(来自perkin elmer)对来自10个患者样品的原发性肿瘤脑ffpe切片进行处理。将ffpe组织进行固定，并使用抗eomes
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ac、抗eomes
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me、抗细胞角蛋白(一种肿瘤标志物)和抗cd8抗体以及dapi染色(绿色＝eomes
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ac、青色＝eomes
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eomes
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me、红色＝cd8、洋红＝细胞角蛋白、dapi＝蓝色)，连同opal试剂盒染料520、570、650和690来进行免疫荧光显微术。测量了cd8
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和eomes
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ac或eomes
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me阳性的cd8
+
t细胞的细胞群％。(a)所绘之图表示eomes
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ac或eomes
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me阳性的cd8
+
t细胞的细胞群％。(b)所绘之图表示在cd8
+
t细胞中，eomes
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ac和eomes
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me的tfi(+/
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标准误差)。(n＝10名患者，对于每个患者的ffpe样品分析了n为至少50000个细胞的谱)。
具体实施方式
1.定义
41.除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可以使用与本文所述的那些类似或等同形式的任何方法或材料来实施或测试本发明，但是描述了优选的方法或材料。出于本发明的目的，将以下术语定义如下。
42.本文所用的冠词“一个”和“一种”指的是该冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法对象。举例来说，“一种要素”意指一个要素或多于一个要素。
43.如本文所用的术语“大约”，指的是本技术领域的技术人员容易知晓的相应数值的通常误差范围。本文提到的“大约”数值或参数包括(并描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。
44.术语“同时施用
……”
或“将
……
同时施用”或“共同施用”等，指的是施用含有两种或多种活性物的单一组合物，或者在足够短的时间内同时期地或同时地或顺次地以分别的组合物形式施用每种活性物和/或通过分别的途径递送，使其有效结果等同于将所有此类活性物作为单一组合物形式施用时获得的结果。所谓“同时地”意指将活性剂基本上在同一时间施用，且期望是在同一制剂中一起施用。所谓“同时期地”意指将活性剂在接近的时间上施用，例如，将一种药剂在另一种药剂之前或之后的大约1分钟内到大约1天内施用。任何同时期的时间都是可用的。然而，经常的情况将是，当不同时施用时，会将药剂在大约1分钟内至大约8小时内施用，并且适当地在少于大约1至大约4小时内施用。当同时期施用时，适当地将药剂在受试者的同一部位施用。术语“同一部位”包括精确位置，但也可以在大约0.5至大约15厘米的范围内，优选地在大约0.5至大约5厘米的范围内。如本文所用的术语“分别地”，意指将药剂以一定的间隔施用，例如以大约1天至数周或数个月的间隔施用。活性剂可以按任一顺序施用。如本文所用的术语“顺次地”，意指将药剂按顺序施用，例如以数分钟、
数小时、数天或数周的间隔施用。如果合适的话，可以将活性剂以有规律的重复周期施用。
45.术语“药剂/试剂(agent)”指的是任何诊断性、治疗性或预防性药剂/试剂。术语“药剂/试剂”不应被狭义地理解，而应扩展到小分子，蛋白质性分子例如肽、多肽和蛋白质，以及遗传分子如rna、dna和其模拟物和化学类似物，以及细胞药剂。术语“药剂/试剂”包括能够产生和分泌本文所称的多肽以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸的细胞。术语“药剂/试剂”还扩展到核酸构建体，包括载体如病毒或非病毒载体、表达载体和质粒，用于在一系列细胞中表达和分泌。
46.如本文所用的“扩增”通常指的是产生所需序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”意思是至少两个拷贝。“拷贝”并不一定意味着与模板序列具有完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，如脱氧肌苷，有意的序列改变(例如，通过包含可与模板杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)，和/或扩增过程中出现的序列错误。
47.生物标志物的“量”或“水平”是在样品中可检测到的水平或量。这些可以通过本领域技术人员已知的并且本文也公开的方法来测量。这些术语包括定量的量或水平(例如，重量或摩尔)、半定量的量或水平、相对的量或水平(例如，类别内的重量％或摩尔％)、浓度等。因此，这些术语包括样品中生物标志物的绝对或相对的量或水平或浓度。可以将所评估的生物标志物的表达水平或量用于确定对治疗的应答。
48.如本文所用的，“和/或”指的是并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及作为备选(或)解释时缺少组合。
49.术语“拮抗剂”或“抑制剂”指的是一种防止、阻断、抑制、中和或降低另一分子(如受体)的生物活性或作用的物质。
50.术语“拮抗剂抗体”指的是一种与靶标结合并阻止或降低该靶标的生物学作用的抗体。在一些实施方案中，该术语可以表示阻止其所结合的靶标(如，pd
‑
1、ctla4等)发挥生物学功能的抗体。
51.如本文所用的，“抗免疫检查点分子拮抗剂抗体”指的是一种能够抑制由免疫检查点分子介导的生物学活性和/或下游事件(一个或多个)的抗体。抗免疫检查点分子拮抗剂抗体涵盖阻断、拮抗、压制或降低(任何程度，包括显著)免疫检查点分子生物学活性的抗体，所述免疫检查点分子生物学活性包括通过免疫检查点分子的抑制性信号转导和由免疫检查点分子介导的下游事件，例如免疫检查点分子结合伴侣与免疫检查点分子的结合和下游信号传导、抑制细胞增殖(包括肿瘤增殖)、抑制t细胞增殖、抑制t细胞激活、抑制细胞因子分泌和抑制抗肿瘤免疫应答。出于本发明的目的，应当明确理解，术语“抗免疫检查点分子拮抗剂抗体”(可互换地称为“拮抗剂免疫检查点分子抗体”、“拮抗剂抗免疫检查点分子抗体”或“免疫检查点分子拮抗剂抗体”)涵盖所有先前确定的术语、名称以及功能状态和特征，其中基本上将免疫检查点分子本身、免疫检查点分子的生物学活性或生物学活性的结果在任何有意义的程度上取消、降低或中和。
52.本文的术语“抗体”是在最广泛的意义上使用的，并具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和单可变域抗体，只要它们表现出所需的生物学活性。术语“抗体”包括包含四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(h)链和两条轻(l)链)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如，igm)。每条重链包含重链可变区(其可以缩写为hcvr或v
h
)和重链恒定区。重链恒
定区包含3个结构域，即c
h1
、c
h2
和c
h3
。每条轻链包含轻链可变区(其可以缩写为lcvr或v
l
)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域(c
l1
)。v
h
和v
l
区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，v
h
和v
l
区域中散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个v
h
和v
l
由3个cdr和4个fr组成，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本发明的不同实施方案中，抗体的fr(或其抗原结合部分)可以与人种系序列相同，或者可以是天然的或经人工修饰的。基于对两个或多个cdr的并排分析，可以定义氨基酸共有序列。包括在术语“抗体”范围内的是任何类别的抗体，例如igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体不必属于任何特定类别。根据抗体重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别。免疫球蛋白主要有五类：iga、igd、ige、igg和igm，而且其中几个还可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
[0053]“抗原结合片段”可以通过在非抗体蛋白支架上排列一个或多个cdr来提供。如本文所用的“蛋白支架”，包括但不限于免疫球蛋白(ig)支架，例如igg支架，其可以是四链或双链抗体，或者其可以仅包含抗体的fc区域，或者其可以包含来自抗体的一个或多个恒定区，该恒定区可以是人类或灵长类动物来源的，或者其可以是人类和灵长类动物恒定区的人工嵌合体。蛋白支架可以是ig支架，例如igg或iga支架。igg支架可以包含抗体的一些或全部结构域(即，ch1、ch2、ch3、v
h
、v
l
)。抗原结合蛋白可以包含选自igg1、igg2、igg3、igg4或igg4pe的igg支架。例如，该支架可以是igg1。该支架可以由抗体的fc区域组成，或包含抗体的fc区域，或为其一部分。抗原结合片段的非限制性示例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如分离的互补决定区(cdr)，如cdr3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元，或限制性的fr3
‑
cdr3
‑
fr4肽。其它工程化分子，例如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr接枝抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(smip)和鲨源可变ignar结构域也包含在如本文所用的表述“抗原结合片段”中。抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可以是任何大小或氨基酸组成，并且一般包含至少一个cdr，该cdr与一个或多个框架序列相邻或符合读框。在具有与v
l
结构域缔合的v
h
结构域的抗原结合片段中，v
h
和v
l
结构域可以按照任何合适的排列方式彼此相对地进行位置配置。例如，可变区可以是二聚化的，并且含有v
h
‑
v
h
、v
h
‑
v
l
或v
l
‑
v
l
二聚体。备选地，抗体的抗原结合片段可以含有单体v
h
或v
l
结构域。在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有至少一个可变结构域，该可变结构域与至少一个恒定结构域共价连接。可以在本发明抗体的抗原结合片段中发现的可变和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)v
h
‑
c
h1
；(ii)v
h
‑
c
h2
；(iii)v
h
‑
c
h3
；(iv)v
h
‑
c
h1
‑
c
h
2；(v)v
h
‑
c
h1
‑
c
h2
‑
c
h3
；(vi)v
h
‑
c
h2
‑
c
h3
；(vii)v
h
‑
c
l
；(viii)v
l
‑
c
h
1；(ix)v
l
‑
c
h2
；(x)v
l
‑
c
h3
；(xi)v
l
‑
c
h1
‑
c
h2
；(xii)v
l
‑
c
h1
‑
c
h2
‑
c
h3
；(xiii)v
l
‑
c
h2
‑
c
h3
；和(xiv)v
l
‑
c
l
。在可变和恒定结构域的任何构型(包括上文列出的任何示例性构型)中，可变和恒定结构域可以直接相互连接，也可以通过全部或部分铰链区或接头区连接。铰链区可以至少由2个(例如，5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，这引起单个多肽分子中邻近的可变和/或恒定结构域之间形成柔性或半柔性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含上文列出的任何可
变和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，其彼此之间以非共价缔合和/或与一个或多个单体v
h
或v
l
结构域一起(例如，通过二硫键(一个或多个))形成。与完整的抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合不同的抗原或同一抗原上的不同表位。可以将任何多特异性抗原结合分子形式，包括本文公开的示例性双特异性抗原结合分子形式，适应于使用本领域现有的常规技术在本发明抗体的抗原结合片段的背景中使用。
[0054]
如本文所用的，术语“抗原”及其语法上的等同表述(例如，“抗原性”)指的是可被特定的体液或细胞免疫产物(例如，抗体分子或t细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括，例如半抗原、简单的中间代谢物、糖类(例如，寡糖)、脂类和激素，以及大分子，例如复合碳水化合物(例如，多糖)、磷脂和蛋白质。常见的抗原分类包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其它寄生生物抗原、肿瘤抗原、参与自身免疫性疾病、过敏和移植排斥的抗原、毒素和其它混杂性抗原。
[0055]
所谓“抗原结合分子”是指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解的是，该术语扩展至免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和表现出抗原结合活性的非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。可用于实施本发明的代表性抗原结合分子包括抗体和抗原结合片段。
[0056]
术语“抗原呈递细胞”或“apc”指的是一类细胞，此类细胞能够以可被免疫系统的特定效应细胞(本文也称为“免疫效应细胞”)识别的肽
‑
mhc复合物的形式呈递一种或多种抗原，并由此调节(例如，刺激/增强或降低/耐受/取消)对所呈递的一种或多种抗原的免疫应答。在本发明的特定实施方案中，apc能够激活免疫效应细胞，如t淋巴细胞，包括cd8
+
和/或cd4
+
淋巴细胞。在体内具有充当apc潜能的细胞不仅包括例如专业apc，如树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞、单核细胞和b细胞，还包括非专业apc，其说明性示例包括激活的上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、胰腺β细胞和血管内皮细胞以及癌细胞。许多类型的细胞都能在其细胞表面呈递抗原，以供免疫效应细胞(包括t细胞)识别。
[0057]
如本文所用的，术语“抗原特异性”指的是细胞群的一种特性，其使得提供特定的抗原或抗原片段会导致特异性细胞增殖，适当的是以例如t细胞(例如，ctl和/或辅助t细胞)激活为特征的t细胞增殖，这种t细胞激活适当地针对受损细胞、恶性肿瘤或感染。
[0058]
如本文所用的，术语“结合”、“特异性结合”或“对于......特异性”指的是可测量且可重现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，在异质性分子群(包括生物分子)存在的情况下，这种相互作用可以确定靶标的存在。例如，结合或特异性结合靶标(其可以是表位)的抗体是这样一种抗体，其与该靶标的结合具有比与其它靶标结合更高的亲和力、亲合力、更容易和/或具有更长的持续时间。在一个实施方案中，抗体与无关靶标的结合程度是该抗体与靶标的结合程度的不到约10％，例如通过放射免疫测定法(ria)测量的。在某些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤0.1nm的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，该表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在另一实施方案中，特异性结合可以包括但不要求专一性结合。
[0059]
如本文所用的术语“生物标志物”，指的是可在样品中检测到的指标，例如预测性、诊断性和/或预后性指标。该生物标志物可作为疾病或病症(如，癌症)的特定亚型的指标，其特征为特定的、分子的、病理的、组织学的和/或临床的特征，和/或可作为特定细胞类型
或状态(如，上皮细胞、间充质细胞等)和/或对疗法的应答的指标。生物标志物包括但不限于多核苷酸(如，dna和/或rna)、多核苷酸拷贝数变化(如，dna拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标志物。生物标志物可以存在于在生理或病理生理状态(例如，原发性癌症、转移性癌症等)发作之前从受试者获取的样品中，这些状态包括其症状(例如，对疗法的应答)。因此，从受试者获取的样品中生物标志物的存在可以指示受试者形成生理或病理生理状态或者其症状的风险增加。备选地或另外地，该生物标志物可以在个体中正常表达，但其表达可能在生理或病理生理状态(包括其症状)发作之前出现变化(即，它增加(上调；过表达)或降低(下调；表达不足))。因此，该生物标志物水平的变化可以指示受试者会形成生理或病理生理状态或者其症状的风险增加。备选地或另外地，生物标志物水平的变化可以反映受试者中特定生理或病理生理状态或者其症状的变化，从而允许在一段时间内跟踪生理或病理生理状态或者其症状的性质(例如，严重程度)。这种手段可用于例如监测治疗方案，以用于评估其在受试者中的有效性(或其它方面)。如本文描述的，对生物标志物水平的提述包括生物标志物的浓度、生物标志物的表达水平或生物标志物的活性。
[0060]
术语“生物标志物签名(signature)”、“签名”、“生物标志物表达签名”或“表达签名”在本文中可互换地使用，并且指的是一种生物标志物或生物标志物的组合，其表达是一种指标，例如预测性、诊断性和/或预后性指标。生物标志物签名可作为疾病或病症(例如，原发性癌症、转移性癌症等)的特定亚型或者其症状(例如，对疗法的应答、药物抗性和/或疾病负荷)的指标，其特征为特定的分子的、病理学、组织学的和/或临床的特征。在一些实施方案中，该生物标志物签名是“基因签名”。术语“基因签名”可与“基因表达签名”互换地使用，并且指的是一种多核苷酸或多核苷酸的组合，其表达是一种指标，例如预测性、诊断性和/或预后性指标。在一些实施方案中，该生物标志物签名是“蛋白质签名”。术语“蛋白质签名”可与“蛋白质表达签名”互换地使用，并且指的是一种多肽或多肽的组合，其表达是一种指标，例如预测性、诊断性和/或预后性指标。生物标志物签名可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100种或更多种生物标志物。
[0061]
术语“癌症”和“癌性”指的是或描述了受试者中的生理状况，其典型特征是细胞生长不受控制，有可能侵袭局部和/或扩散到身体的其它部位(转移)。本文中的术语“癌症”通常可与“肿瘤”互换地使用(除非将肿瘤具体称为“良性”肿瘤，即缺少侵袭相邻组织或转移能力的异常细胞块)，并且包括恶性实体瘤(例如，癌、肉瘤)和其中可能无法检测到实体瘤肿块的恶性生长(例如，某些血液系统恶性肿瘤)。癌症的非限制性示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的示例包括但不限于鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌症或胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、雀斑样痣恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥散性nhl；高级免疫母细胞nhl；高级
淋巴母细胞nhl；高级小无裂细胞型nhl；巨大肿块型nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性成淋巴细胞白血病(all)；毛细胞白血病；慢性髓系白血病；和移植后淋巴增生性病症(ptld)、以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(例如与脑瘤相关的那种)、meigs综合征、脑癌以及头和颈癌，和相关的转移。在某些实施方案中，适于通过本发明的抗体进行治疗的癌症包括乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌癌、头和颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自于：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结直肠癌(crc)和肝细胞癌。仍在一些实施方案中，癌症选自于：非小细胞肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移形式。在特定的实施方案中，癌症是黑色素瘤或肺癌，适宜地是转移性黑色素瘤或转移性肺癌。
[0062]
术语“细胞区室”包括细胞的部分，包括细胞器(例如线粒体、高尔基体、内质网、核糖体等)、细胞核、细胞质(任选地包括细胞器)、核膜、细胞膜和其它细胞区域。
[0063]
术语“化疗”指的是以一种或多种抑制或消除细胞生长和细胞分裂的化学治疗剂对人类或动物进行的疗法，即，该疗法被用作细胞增殖抑制剂或用于诱导细胞死亡(细胞凋亡)。与正常细胞相比，癌细胞的生长和分裂不受控制，因此化疗对癌细胞应该更加有效。
[0064]
术语“化学治疗剂”指的是有效抑制肿瘤生长的化学化合物。化学治疗剂的示例包括厄洛替尼(genentech/osi pharm.)、硼替佐米(millennium pharm.)、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯、马里佐米(salinosporamide a)、卡非佐米、17
‑
aag(格尔德霉素)、根赤壳菌素(radicicol)、乳酸脱氢酶a(ldh
‑
a)、氟维司琼(astrazeneca)、舒尼替尼(pfizer/sugen)、来曲唑(novartis)、甲磺酸伊马替尼(novartis)、非纳索特(finasunate)(novartis)、奥沙利铂(sanofi)、5
‑
fu(5
‑
氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(sirolimus,wyeth)、拉帕替尼(gsk572016,glaxo smith kline)、洛那法尼(sch 66336)、索拉非尼(bayer labs)、吉非替尼(astrazeneca)、ag1478、烷化剂例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三甲基氧蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯(尤其是泡番荔枝辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括拓扑替康和伊立替康)；苔藓虫素(bryostatin)；callystatin；cc
‑
1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；肾上腺皮质类固醇(包括泼尼松和泼尼松龙)；醋酸环丙孕酮；5α
‑
还原酶包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他、罗米地辛、帕比司他(panobinostat)、丙戊酸、莫替司他(mocetinostat)、多拉司他汀(dolastatin)；阿地白介素(aldesleukin)、滑石倍癌霉素(talc duocarmycin，包括合成类似物，kw
‑
2189和cb1
‑
tm1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊
瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素例如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素ω1i(angew chem.intl.ed.engl.1994 33:183
‑
186)；达内霉素，包括达内霉素a；双膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸、(多柔比星)、吗啉基多柔比星、氰基吗啉基多柔比星、2
‑
吡咯啉
‑
多柔比星和脱氧多柔比星)、表阿霉素、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类例如丝裂霉素c、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢类例如甲氨蝶呤和5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fu)；叶酸类似物例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6
‑
巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6
‑
氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素剂例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶(amsacrine)；布沙莫司汀；比生群(bisantrene)；伊达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类例如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamnol)；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋胺氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2
‑
乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(jhs natural products,eugene,oreg.)；雷佐生；利索新(rhizoxin)；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉毒素(trichothecenes，尤其是t
‑
2毒素、疣孢菌素a(verracurin a)、杆孢菌素a和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；噶萨托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara
‑
c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类例如taxol(紫杉醇；bristol
‑
myers squibb oncology,princeton,n.j.)、(不含聚氧乙烯蓖麻油(cremophor))、紫杉醇的经白蛋白改造的纳米颗粒制剂(american pharmaceutical partners,schaumberg,ill.)和(多西他赛、多烯紫杉醇；sanofi
‑
aventis)；苯丁酸氮芥；(吉西他滨)；6
‑
硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(vp
‑
16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；(长春瑞宾)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷；伊达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨伊班膦酸盐；cpt
‑
11；拓朴异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a例如视黄酸；以及上述任何种的药学上可接受的盐、酸
和衍生物。
[0065]
化学治疗剂还包括(i)作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括，例如他莫昔芬(包括他莫昔芬柠檬酸盐)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、碘昔芬(iodoxyfene)、4
‑
羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和(托瑞米芬柠檬酸盐)；(ii)芳香化酶抑制剂，其抑制调节肾上腺中雌激素产生的芳香化酶，例如4(5)
‑
咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦；pfizer)、福美坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、(伏氯唑)、(来曲唑；novartis)和(阿那曲唑；astrazeneca)；(iii)抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林；布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(tripterelin)、醋酸甲羟孕酮、二乙基己烯雌酚、普瑞马林(premarin)、氟甲睾酮、全反式视黄酸、芬维a胺(fenretinide)，以及曲沙他滨(1,3
‑
二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号传导通路中的基因(例如，pkc
‑
α、ralf和h
‑
ras)表达的反义寡核苷酸；(vii)核酶，例如vegf表达抑制剂(如，)和her2表达抑制剂；(viii)疫苗例如基因治疗疫苗，如和和ril
‑
2；拓扑异构酶1抑制剂，如2；拓扑异构酶1抑制剂，如rmrh；以及(ix)上述任何种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
[0066]
化学治疗剂还包括抗体例如阿仑单抗(alemtuzumab，campath)、贝伐单抗(genentech)；西妥昔单抗(imclone)；帕尼单抗(amgen)、利妥昔单抗(genentech/biogen idec)、帕妥珠单抗(2c4,genentech)、曲妥珠单抗(genentech)、托西莫单抗(tositumomab，bexxar,corixia)和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin，wyeth)。与本发明化合物联合起来具有治疗潜力可作为药剂的其它人源化单克隆抗体包括：阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、托珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、莫星
‑
比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、莫星
‑
坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西弗斯妥珠单抗(cidfusituzumab)、西地妥珠单抗(cidtuzumab)、达克珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫托珠单抗(motovizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺维珠单抗(nolovizumab)、努维珠单抗(numavizumab)、奥卡利珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕考珠单抗(pascolizumab)、派弗西妥珠单抗
(pecfusituzumab)、派妥珠单抗(pectuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、来利珠单抗(ralivizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、来丝利维珠单抗(reslivizumab)、瑞替珠单抗(reslizumab)、来西维珠单抗(resyvizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、希普利珠单抗(siplizumab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、他珠单抗四西坦(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、土库西妥珠单抗(tucusituzumab)、恩维珠单抗(umavizumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、尤特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)，以及抗白细胞介素12(abt
‑
874/j695,wyeth research and abbott laboratories)，它是一种重组的纯人序列的全长igg1λ抗体，经基因修饰可识别白细胞介素12p40蛋白。
[0067]
化学治疗剂还包括“egfr抑制剂”，其指的是与egfr结合或以其它方式与egfr直接相互作用，并防止或降低其信号传导活性的化合物，备选地也可称为“egfr拮抗剂”。此类药剂的示例包括与egfr结合的抗体和小分子。与egfr结合的抗体的示例包括mab 579(atcccrl hb 8506)、mab 455(atcccrl hb8507)、mab 225(atcccrl 8508)、mab 528(atcccrl 8509)(参见mendelsohn等人的第4,943,533号美国专利)及其变体，例如嵌合性225(c225或西妥昔单抗；)和改型人225(h225)(参见,wo 96/40210,imclone systems inc.)；imc
‑
11f8，一种全人的egfr靶向抗体(imclone)；与ii型突变体egfr结合的抗体(第5,212,290号美国专利)；如第5,891,996号美国专利中描述的结合egfr的人源化抗体和嵌合抗体；和结合egfr的人抗体，例如abx
‑
egf或帕尼单抗(参见wo98/50433,abgenix/amgen)；emd 55900(stragliotto等人,eur.j.cancer 32a:636
‑
640(1996))；emd7200(马妥珠单抗)，一种针对egfr的人源化egfr抗体，其与egf和tgf
‑
α竞争egfr结合(emd/merck)；人egfr抗体，humax
‑
egfr(genmab)；全人抗体，被称为e1.1、e2.4、e2.5、e6.2、e6.4、e2.11、e6.3和e7.6.3，并且描述于第6,235,883号美国专利；mdx
‑
447(medarex inc)；和mab 806或人源化mab 806(johns等人,j.biol.chem.279(29):30375
‑
30384(2004))。可以将抗egfr抗体与细胞毒性剂缀合，从而产生免疫缀合物(例如，参见ep659439a2,merck patent gmbh)。egfr拮抗剂包括小分子，例如描述于下列中的化合物：第5,616,582号、第5,457,105号、第5,475,001号、第5,654,307号、第5,679,683号、第6,084,095号、第6,265,410号、第6,455,534号、第6,521,620号、第6,596,726号、第6,713,484号、第5,770,599号、第6,140,332号、第5,866,572号、第6,399,602号、第6,344,459号、第6,602,863号、第6,391,874号、第6,344,455号、第5,760,041号、第6,002,008号和第5,747,498号美国专利，以及以下pct公布文件：wo98/14451、wo98/50038、wo99/09016和wo99/24037。特定的小分子egfr拮抗剂包括osi
‑
774(cp
‑
358774、厄洛替尼、genentech/osi pharmaceuticals)；pd 183805(ci 1033、2
‑
丙烯酰胺、n
‑
[4
‑
[(3
‑
氯
‑4‑
氟苯基)氨基]
‑7‑
[3
‑
(4
‑
吗啉基)丙氧基]
‑6‑
喹唑啉基]
‑
,二盐酸盐,pfizer inc.)；zd1839、吉非替尼4
‑
(3'
‑
氯
‑
4'
‑
氟苯胺)
‑7‑
甲氧基
‑6‑
(3
‑
吗啉丙氧基)喹唑啉,astrazeneca)；zm 105180((6
‑
氨基
‑4‑
(3
‑
甲苯基
‑
氨基)
‑
喹唑啉,zeneca)；bibx
‑
1382(n8
‑
(3
‑
氯
‑4‑
氟
‑
苯基)
‑
n2
‑
(1
‑
甲基
‑
哌啶
‑4‑
基)
‑
嘧啶并[5,4
‑
d]嘧啶
‑
2,8
‑
二胺,boehringer ingelheim)；pki
‑
166((r)
‑4‑
[4
‑
[(1
‑
苯
乙基)氨基]
‑
1h
‑
吡咯并[2,3
‑
d]嘧啶
‑6‑
基]
‑
苯酚)；(r)
‑6‑
(4
‑
羟基苯基)
‑4‑
[(1
‑
苯乙基)氨基]
‑
7h
‑
吡咯并[2,3
‑
d]嘧啶)；cl
‑
387785(n
‑
[4
‑
[(3
‑
溴苯基)氨基]
‑6‑
喹唑啉基]
‑2‑
丁炔酰胺)；ekb
‑
569(n
‑
[4
‑
[(3
‑
氯
‑4‑
氟苯基)氨基]
‑3‑
氰基
‑7‑
乙氧基
‑6‑
喹啉基]
‑4‑
(
‑
二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)(wyeth)；ag1478(pfizer)；ag1571(su 5271；pfizer)；egfr/her2双重酪氨酸激酶抑制剂，例如拉帕替尼(gsk572016或n
‑
[3
‑
氯
‑4‑
[(3
‑
氟苯基)甲氧基]苯基]
‑
6[5[[[2
‑
甲磺酰基)乙基]氨基]甲基]
‑2‑
呋喃基]
‑4‑
喹唑啉胺)。
[0068]
化学治疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，其包括上段中提到的egfr靶向药物；小分子her2酪氨酸激酶抑制剂，例如由takeda提供的tak165；cp
‑
724,714，一种erbb2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(pfizer和osi)；her双重抑制剂，例如ekb
‑
569(由wyeth提供)，它优先结合egfr，但同时抑制her2和egfr过表达的细胞；拉帕替尼(gsk572016；由glaxo
‑
smithkline提供)，一种her2和egfr酪氨酸激酶的口服抑制剂；pki
‑
166(由novartis提供)；广谱her抑制剂，例如卡奈替尼(canertinib)(ci
‑
1033；pharmacia)；raf
‑
1抑制剂，例如由isis pharmaceuticals提供的反义药剂isis
‑
5132，其抑制raf
‑
1信号传导；非her靶向的tk抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(由glaxo smithkline提供)；多靶向性酪氨酸激酶抑制剂，例如舒尼替尼(由pfizer提供)；vegf受体酪氨酸激酶抑制剂，例如瓦他拉尼(vatalanib)(ptk787/zk222584,由novartis/schering ag提供)；mapk胞外调节激酶i抑制剂ci
‑
1040(由pharmacia提供)；喹唑啉类，例如pd 153035、4
‑
(3
‑
氯苯胺)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，例如cgp 59326、cgp 60261和cgp 62706；吡唑并嘧啶类，4
‑
(苯氨基)
‑
7h
‑
吡咯并[2,3
‑
d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷、4,5
‑
双(4
‑
氟苯胺)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪弗斯汀(tyrphostines)；pd
‑
0183805(warner
‑
lamber)；反义分子(例如，那些与her编码核酸结合的分子)；喹喔啉类(第5,804,396号美国专利)；特弗斯汀(tryphostins)(第5,804,396号美国专利)；zd6474(astra zeneca)；ptk
‑
787(novartis/schering ag)；广谱her抑制剂，例如ci
‑
1033(pfizer)；affinitac(isis 3521；isis/lilly)；甲磺酸伊马替尼pki 166(novartis)；gw2016(glaxo smithkline)；ci
‑
1033(pfizer)；ekb
‑
569(wyeth)；塞马西尼(semaxinib)(pfizer)；zd6474(astrazeneca)；ptk
‑
787(novartis/schering ag)；inc
‑
1c11(imclone)、雷帕霉素(西罗莫司、)；或者如以下任何专利公布文件中所述的：第5,804,396号美国专利；wo 1999/09016(american cyanamid)；wo 1998/43960(american cyanamid)；wo 1997/38983(warner lambert)；wo 1999/06378(warner lambert)；wo 1999/06396(warner lambert)；wo 1996/30347(pfizer,inc)；wo 1996/33978(zeneca)；wo 1996/3397(zeneca)和wo 1996/33980(zeneca)。
[0069]
化学治疗剂还包括地塞米松、干扰素、秋水仙碱、氯苯氨啶(metoprine)、环孢霉素、两性霉素、甲硝哒唑、阿仑单抗、阿利维a酸、别嘌呤醇、氨磷汀、三氧化二砷、天门冬酰胺酶、活bcg、贝伐珠单抗、贝沙罗汀(bexarotene)、克拉屈滨、氯法拉滨、达依泊汀α(darbepoetin alfa)、地尼白介素(denileukin)、右雷佐生(dexrazoxane)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、厄洛替尼、非格司亭(filgrastim)、醋酸组氨瑞林(histrelin acetate)、替伊莫单抗(ibritumomab)、干扰素α
‑
2a、干扰素α
‑
2b、来那度胺、左旋咪唑、美司钠、甲氧沙林(methoxsalen)、诺龙、奈拉滨(nelarabine)、诺非妥莫单抗(nofetumomab)、奥普瑞白介
素(oprelvekin)、帕利夫明、帕米膦酸盐(pamidronate)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二钠、普卡霉素、卟吩姆钠(porfimer sodium)、奎纳克林(quinacrine)、拉布立酶、沙格司亭、替莫唑胺(temozolomide)、vm
‑
26、6
‑
tg、托瑞米芬、维a酸(tretinoin)、atra、戊柔比星(valrubicin)、唑来膦酸盐和唑来膦酸，以及其药学上可接受的盐。
[0070]
化学治疗剂还包括氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、新戊酸替可的松(tixocortol pivalate)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、曲安西龙醇(triamcinolone alcohol)、莫米松(mometasone)、安西奈德(amcinonide)、布地奈德(budesonide)、地奈德(desonide)、氟轻松(fluocinonide)、醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙(fluocortolone)、氢化可的松
‑
17
‑
丁酸酯、氢化可的松
‑
17
‑
戊酸酯、阿氯米松二丙酸酯(aclometasone dipropionate)、倍他米松戊酸酯、倍他米松二丙酸酯、泼尼卡酯(prednicarbate)、氯倍他松
‑
17
‑
丁酸酯、氯倍他索
‑
17
‑
丙酸酯、氟可龙己酸酯、氟可龙新戊酸酯和醋酸氟泼尼定；免疫选择性抗炎肽(imsaid)，例如苯丙氨酸
‑
谷氨酰胺
‑
甘氨酸(feg)以及其d
‑
异构形式(feg)(imulanbiotherapeutics,llc)；抗风湿药物，例如硫唑嘌呤、环孢灵(环孢菌素a)、d
‑
青霉胺、金盐(gold salts)、羟氯喹、来氟米特米诺环素(leflunomideminocycline)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、肿瘤坏死因子α(tnf
‑
α)阻断剂，例如依那西普(enbrel)、英夫利西单抗(remicade)、阿达木单抗(humira)、赛妥珠单抗(cimzia)、戈利木单抗(simponi)、白细胞介素1(il
‑
1)阻断剂，例如阿那白滞素(anakinra)(kineret)、t细胞共刺激阻断剂，例如阿巴西普(orencia)、白细胞介素6(il
‑
6)阻断剂，例如托珠单抗白细胞介素13(il
‑
13)阻断剂例如来金珠单抗(lebrikizumab)；干扰素α(ifn)阻断剂例如罗他珠单抗(rontalizumab)；β7整联蛋白阻断剂例如rhumabβ7；ige通路阻断剂例如抗m1 prime；分泌型同源三聚体lta3和膜结合型异源三聚体lta1/β2阻断剂，例如抗淋巴毒素α(lta)；放射性同位素(例如，at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素)；混杂的研究性药剂，例如硫代铂(thioplatin)、ps
‑
341、苯丁酸酯/盐(phenylbutyrate)、et
‑
18
‑
och3或法尼基转移酶抑制剂(l
‑
739749、l
‑
744832)；多酚类，例如槲皮素(quercetin)、白藜芦醇、白皮杉醇(piceatannol)、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素(theaflavin)、黄烷醇类(flavanol)、原花青素、白桦脂酸(betulinic acid)及其衍生物；细胞自噬抑制剂，例如氯喹；δ
‑9‑
四氢大麻酚(屈大麻酚、)；β
‑
拉帕酮；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱；白桦脂酸；乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪亭(scopolectin)和9
‑
氨基喜树碱)；鬼臼毒素；替加氟贝沙罗汀双膦酸盐例如氯膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐ne
‑
58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿仑膦酸盐帕米膦酸盐替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)和表皮生长因子受体(egf
‑
r)；疫苗例如疫苗；哌立福新(perifosine)、cox
‑
2抑制剂(如，塞来昔布或依托昔布)、蛋白体抑制剂(如，ps341)；cci
‑
779；替吡法尼(tipifarnib)
(r11577)；索拉非尼、abt510；bcl
‑
2抑制剂，例如奥利默森钠(oblimersen sodium)匹杉琼(pixantrone)；法尼基转移酶抑制剂，例如洛那法尼(sch 6636、sarasar
tm
)；和上述任何种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，例如chop，这是环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的联合疗法的缩写；和folfox，这是以奥沙利铂(eloxatin
tm
)联合5
‑
fu和甲酰四氢叶酸(leucovorin)的治疗方案的缩写。
[0071]
化学治疗剂还包括具有镇痛、解热和抗炎作用的非甾族抗炎药。nsaid包括酶环加氧酶的非选择性抑制剂。nsaid的具体示例包括阿司匹林、丙酸衍生物例如布洛芬、非诺洛芬、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬、奥沙普秦(oxaprozin)和萘普生、乙酸衍生物例如吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、双氯芬酸、烯醇酸衍生物例如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈噁昔康(droxicam)、氯诺昔康和伊索昔康、芬那酸衍生物例如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸，以及cox
‑
2抑制剂例如塞来昔布、依托昔布、罗美昔布、帕瑞昔布、罗非昔布(rofecoxib)和伐地昔布(valdecoxib)。nsaid可以适用于缓解疾病的症状，如类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节病、强直性脊椎炎、银屑病关节炎、reiter综合征、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛和偏头痛、术后疼痛、炎症和组织损伤引起的轻度至中度疼痛、发热、肠梗阻和肾绞痛。
[0072]
术语“临床结果”或“临床终点”指的是与患者对疗法的反应有关的任何临床观察或测量。临床结果的非限制性示例包括肿瘤应答(tr)、总体生存(os)、无进展生存(pfs)、无病生存(dfs)、肿瘤复发前时间(ttr)、肿瘤进展前时间(ttp)、相对风险(rr)、毒性或副作用。“总体生存”(os)意指与自然状态下或未接受治疗的个体或患者相比，预期寿命的延长。“无进展生存”(pfs)或“肿瘤进展前时间”(ttp)表示在治疗期间和治疗之后癌症不增长的时间长度。无进展生存包括患者经历完全应答或部分应答的时间量，以及患者经历病情稳定的时间量。如本文所用的和按照国家癌症研究所定义的“肿瘤复发”是指癌症复发了(卷土重来)，通常是在癌症无法被检测到的一段时间后。癌症可能会重新出现在与原来(原发)肿瘤相同的位置，或出现在身体的其它部位。它也被称为复发性癌症。“肿瘤复发前时间”(ttr)的定义为，从癌症确诊之日到第一次复发、死亡的时间，或者直到最后一次联系的时间(如果在最后一次联系时患者没有任何肿瘤复发)。如果患者未复发，则在死亡时或最后一次随访时对ttr进行删改。“相对风险”(rr)，在统计学和数学流行病学中指的是与暴露相关的事件(或形成疾病)的风险。相对风险是在暴露组中相比非暴露组中发生该事件的概率之比。
[0073]
如本文所用的，术语“复合物”指的是分子(如，肽、多肽等)以彼此直接和/或间接接触的方式形成的组合体或聚集体。在特定的实施方案中，“接触”，或更具体而言，“直接接触”意指两个或多个分子足够接近，以至于有吸引力的非共价相互作用(例如，范德华力、氢键结合、离子和疏水相互作用等)主导了分子的相互作用。在这类实施方案中，分子(如，肽和多肽)的复合物是在这样的条件下形成的，即复合物在热力学上是有利的(例如，与其组成分子的非聚集或非复合状态相比)。如本文所用的，术语“多肽复合物”或“蛋白复合物”指的是三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体或更高阶寡聚体。在特定的实施方案中，多肽复合物是通过eomes与对eomes特异性的抗原结合分子的结合而形成的。
[0074]
贯穿整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则“包含”、“包括”和“含有”这些词将被理解为意味着包含某个指定步骤或要素或者某组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤组或要素组。因此，术语“包含”和类似的用法表示列出的要素是必需的或强制的，但其它要素是可选的，并且可以存在或不存在。所谓“由
……
组成”意思是包括并限于短语“由
……
组成”之后的任何内容。因此，短语“由
……
组成”表示列出的要素是必需的或强制的，并且不可以存在其它要素。所谓“基本上由
……
组成”意思是包括该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中规定的所列要素的活性或行为的其它要素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示列出的要素是必需的或强制的，但是其它要素是可选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或行为。
[0075]
如本文所用的，术语“相关”或“与
……
相关”和类似的术语指的是两个或多个事物(例如事件、特征、结果、数字、数据集等，可以将其称为“变量”)之间的统计关联。应该理解的是，这些事物可以是不同类型的。通常将变量表示为数字(例如，测量值、数值、可能性、风险)，其中正相关意味着随着一个变量增加，另一个也增加，而负相关(也称为反相关)意味着随着一个变量增加，另一个变量降低。
[0076]
所谓“与
……
相对应”或“对应于
……”
意指一个氨基酸序列，其显示出与参照氨基酸序列存在实质序列相似性或同一性。一般来说，氨基酸序列会显示出与参照氨基酸序列的至少一部分存在至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性。
[0077]
如本文所用的术语“细胞毒性剂”，指的是对细胞有害的任何药剂(例如，导致细胞死亡、抑制增殖或以其它方式妨碍细胞功能)。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，at
211
、i
131
、i
125
、y
90
、re
186
、re
188
、sm
153
、bi
212
、p
32
、pb
212
和lu的放射性同位素)；化学治疗剂；生长抑制剂；酶及其片段，例如核溶酶；和毒素例如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。示例性的细胞毒性剂可以选自于抗微管剂、铂配位化合物、烷化剂、抗生素药剂、拓扑异构酶ⅱ抑制剂、抗代谢物、拓扑异构酶ⅰ抑制剂、激素和激素类似物、信号转导通路抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂、免疫治疗剂、促凋亡剂、ldh
‑
a的抑制剂、脂肪酸生物合成的抑制剂、细胞周期信号传导抑制剂、hdac抑制剂、蛋白酶体抑制剂和癌代谢的抑制剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂是紫杉烷。在这种类型的代表性示例中，紫杉烷是紫杉醇或多西他赛。在一些实施方案中，细胞毒性剂是铂剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂是egfr的拮抗剂。在这种类型的代表性示例中，egfr的拮抗剂是n
‑
(3
‑
乙炔苯基)
‑
6,7
‑
双(2
‑
甲氧基乙氧基)喹唑啉
‑4‑
胺(例如，厄洛替尼)。在一些实施方案中，细胞毒性剂是raf抑制剂。在这种类型的非限制性示例中，raf抑制剂是braf和/或craf抑制剂。在其它的非限制性示例中，raf抑制剂是维罗非尼(vemurafenib)。在一个实施方案中，细胞毒性剂是pi3k抑制剂。
[0078]
如本文所用的，术语“细胞毒性疗法”指的是诱导细胞损伤的疗法，其包括但不限于放射疗法、化疗、光动力疗法、射频消融术、抗血管生成疗法及其组合。当细胞毒性治疗剂应用于细胞时，可能诱导dna损伤。
[0079]
如本文所用的，“延迟疾病进展”或“减缓疾病进展的速度”意思是推迟、阻碍、放慢、放缓、稳定和/或展缓疾病(如，癌症)的发展。这种延迟的时间可以长短不一，取决于疾
病史和/或接受治疗的个体。对本领域技术人员来说显而易见的是，充分或显著的延迟实际上可以包括预防，即个体不会发生该疾病。例如，可以延迟进入晚期癌症，例如发生转移。
[0080]
术语“检测”包括任何检测手段，其包括直接和间接检测。
[0081]
如本文所用的术语“药物”，指的是在体内具有生物活性或可检测活性的任何物质。术语药物意在包括细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射治疗剂、靶向抗癌剂、生物应答调节剂、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。
[0082]
术语“药物抗性”指的是疾病对一种或多种药物的治疗没有应答时的情况。药物抗性可以是固有性的(或原发性抗性)，这意味着疾病从未对所述一种或多种药物产生过应答，或者可以是获得性的，这意味着疾病不再对该疾病之前有过应答的一种或多种药物产生应答(继发性抗性)。在某些实施方案中，药物抗性是固有性的。在某些实施方案中，药物抗性是获得性的。
[0083]“有效量”至少是对某一特定病症实现可测量的改善或预防所需的最低量。本文的有效量可以根据下列因素而变化，例如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望的应答的能力。有效量也是指治疗产生的任何毒性或有害影响都被治疗上的有益效果所抵消时的量。对于预防性应用，有益或期望的结果包括的结果为例如对于疾病包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发生过程中呈现的中间病理表型，消除或降低其风险、减轻其严重程度或延迟其发作。对于治疗性应用，有益的或期望的结果包括临床结果，例如减少由疾病导致的一种或多种症状、提高患有疾病的人群的生活质量、减少治疗疾病所需的其它药物的剂量、增强另一种药物(如通过靶向治疗)的效果、延迟疾病的进展和/或延长生存期。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可能具有下列效果：减少癌细胞数量；缩小肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓或期望地停止)癌细胞向周围器官的浸润；抑制(即，在一定程度上减缓和期望地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤增长；和/或在一定程度上缓解与癌症或肿瘤相关的一种或多种症状。有效量可以在一次或多次施用中进行。出于本发明的目的，有效量的药物、化合物或药物组合物是指足以直接或间接地完成预防性或治疗性治疗的量。正如在临床环境中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物一起实现。因此，“有效量”可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑，且如果与一种或多种其它药剂联合使用时可能或已经达到了预期的结果，则可以认为单一药剂是以有效量给予的。治疗的有效量可以通过评估癌症治疗中通常使用的各种终点来测量，包括但不限于：延长生存(包括总体生存(os)和无进展生存(pfs))；引起客观应答(包括完全应答(cr)或部分应答(pr))；肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、疾病进展前时间延长、生存持续期延长、pfs延长、os率改善、应答持续时间延长、和生活质量提高和/或癌症迹象或症状改善。如本文所用的，术语“病情进展”(pd)指的是以研究中最小的直径总和作为参照(如果研究中基线总和最小，则包括基线总和)，靶病灶直径总和至少增加20％。除了相对增加20％之外，还必须证明总和有至少5mm的绝对增加。出现一个或多个新的病灶也被认为是进展。如本文所用的，术语“部分应答”(pr)指的是以基线直径总和作为参照，靶病灶的直径总和至少减少30％。如本文所用的，术语“完全应答”(cr)指的是所有非结节性靶病灶都消失，任何靶淋巴结的短轴缩小至<10mm。如本文所用的，术语“病情稳定”(sd)指的是以研究中最小的直径总和作为参照，
既没有足够的缩小达到pr，也没有足够的增长符合pd的标准。
[0084]
术语“表位”指的是分子的一部分，其能够在抗体的一个或多个抗原结合部分被抗体识别并结合。表位经常由表面分子集群例如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案中，该表位可以是蛋白表位。蛋白表位可以是线性的或构象型的。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(如，抗体)之间的所有相互作用点都沿着该蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。“非线性表位”或“构象型表位”包含抗原性蛋白内被表位特异性抗体结合的非连续多肽(或氨基酸)。一旦确定了抗原上期望的表位，就有可能产生针对该表位的抗体，例如，使用本说明书中描述的技术。备选地，在探索过程中，抗体的产生和表征可以阐明关于期望表位的信息。然后根据这种信息，有可能竞争性地筛选与同一表位结合的抗体。实现这一目标的手段是进行竞争和交叉竞争研究，以找到相互竞争或交叉竞争以结合靶抗原(例如，eomes
‑
641k
‑
ac、eomes
‑
641k
‑
me、eomes
‑
373k
‑
me等)的抗体，例如，抗体竞争与抗原的结合。
[0085]
关于基因序列的术语“表达”，指的是基因的转录以产生rna转录本(例如，mrna、反义rna、sirna、shrna、mirna等)，并在适当的情况下将所得mrna转录本翻译成蛋白质。因此，从上下文中可以清楚地看出，编码序列的表达来自于编码序列的转录和翻译。相反，非编码序列的表达来自于非编码序列的转录。
[0086]
如本文所用的，关于生物标志物或生物标志物复合物水平的术语“增加”或“增加了”指的是与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平相比，该生物标志物或生物标志物复合物水平的统计学上显著的且可测量的增加。该增加优选为至少约10％的增加，或至少约20％的增加，或至少约30％的增加，或至少约40％的增加，或至少约50％的增加。
[0087]
如本文所用的，关于生物标志物或生物标志物复合物测量值的术语“高于/更高”，指的是与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或与对照水平相比，一种生物标志物或生物标志物复合物测量值的水平的统计学上显著的和可测量的差异，其中该生物标志物或生物标志物复合物的测量值大于另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平。该差异优选为至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％。
[0088]
如本文所用的，关于生物标志物或生物标志物复合物水平的术语“减少”或“减少了”指的是与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平相比，该生物标志物或生物标志物复合物水平的统计学上显著的且可测量的减少。该减少优选为至少约10％的减少，或至少约20％的减少，或至少约30％的减少，或至少约40％的减少，或至少约50％的减少。
[0089]
如本文所用的，关于生物标志物或生物标志物复合物测量值的术语“低于/更低”，指的是与另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或与对照水平相比，一种生物标志物或生物标志物复合物测量值的水平的统计学上显著的和可测量的差异，其中该生物标志物或生物标志物复合物的测量值小于另一生物标志物或生物标志物复合物的水平或对照水平。该差异优选为至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％。
[0090]
术语“表达的水平”或“表达水平”一般来说可互换使用，并且通常指的是样品中生
物标志物的量。“表达”通常指的是信息(如，基因编码的和/或表观遗传的)转化为在细胞中存在和运行的结构的过程。因此，如本文所用的，“表达”可以指的是转录成多核苷酸，翻译成多肽，或者甚至是多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸、翻译的多肽、或多核苷酸和/或多肽修饰(例如，多肽的翻译后修饰)的片段也应被视为被表达的，无论它们是源于通过可变剪接产生的转录本或降解的转录本，还是源于多肽的翻译后加工，例如通过蛋白水解。“表达的基因”包括转录成以mrna形式存在的多核苷酸，然后翻译成多肽的基因，也包括转录成rna但没有翻译成多肽的基因(如，转运rna和核糖体rna)。因此，“表达升高”、“表达水平升高”或“水平升高”指的是细胞或个体中的生物标志物相对于对照的表达增加或水平增加，该对照为例如是对疗法有应答或无应答的一个细胞或多个细胞，或者对疗法有应答或无应答的一名个体或多名个体，或者是内部对照(例如，看家生物标志物)。“表达下降”、“表达水平下降”或“水平下降”指的是个体中的生物标志物相对于对照的表达降低或水平降低，该对照为例如是对疗法有应答或无应答的一个细胞或多个细胞，或者对疗法有应答或无应答的一名个体或多名个体，或者是内部对照(例如，看家生物标志物)。在一些实施方案中，表达下降是少量表达或无表达。在特定的实施方案中，eomes
‑
641k
‑
ac水平升高指的是与eomes的大部分细胞核定位相关的水平，或者是在细胞核中的定位高于在细胞质中的定位。eomes
‑
641k
‑
ac水平升高还可以与对疗法有抗性相关。在其它实施方案中，eomes
‑
641k
‑
me水平升高指的是与eomes的大部分细胞质定位相关的水平，或者是在细胞质和/或细胞膜中的定位高于在细胞核中的定位。eomes
‑
641k
‑
me水平升高还可以与对疗法的应答性相关。
[0091]
术语“看家生物标志物”指的是一种生物标志物或一组生物标志物(如，多核苷酸和/或多肽)，其在所有细胞类型中的存在通常都是相似的。在一些实施方案中，该看家生物标志物是“看家基因”。“看家基因”在本文中指的是编码以下蛋白质的一个基因或一组基因，这些蛋白质的活性对维持细胞功能是必不可少的，并且在所有细胞类型中的存在通常都是相似的。
[0092]
当在本文中使用时，“生长抑制剂”指的是在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一个实施方案中，生长抑制剂是生长抑制性抗体，其防止或减少表达该抗体所结合的抗原的细胞增殖。在另一实施方案中，生长抑制剂可以是一种能显著降低s期细胞百分比的药剂。生长抑制剂的示例包括阻断细胞周期进程的药剂(在s期以外的阶段)，例如诱导g1期阻滞和m期阻滞的药剂。经典的m期阻断剂包括vincas(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶ⅱ抑制剂例如多柔比星、表阿霉素、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。阻滞g1期的药剂也会蔓延到s期阻滞，例如，dna烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5
‑
氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更多信息可见于mendelsohn和israel编,the molecular basis of cancer,第1章,由murakami等人所著的标题为“cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”(w.b.saunders,philadelphia,1995),例如第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)都是从红豆杉树中提取的抗癌药物。多西他赛(rhone
‑
poulenc rorer)来源于欧洲红豆杉，是一种紫杉醇(bristol
‑
myers squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体组装成微管，并通过防止解聚稳定微管，从而抑制细胞有丝分裂。
[0093]
术语“免疫检查点分子”包括作为免疫检查点发挥功能的受体和配体。免疫检查点代表免疫逃逸机制，以防止免疫系统攻击自身。免疫检查点受体存在于t细胞上，并与抗原呈递细胞(包括癌细胞)上表达的免疫检查点配体相互作用。t细胞识别呈递在mhc分子上的抗原并被激活以产生免疫反应，而与上述情况同时发生的免疫检查点受体和配体之间的相互作用则控制t细胞的激活。免疫检查点受体包括共刺激受体和抑制性受体，并且t细胞的激活和免疫反应由两种受体之间的平衡来控制。可以被靶向用于阻断或抑制的说明性免疫检查点分子包括但不限于ctla
‑
4、4
‑
1bb(cd137)、4
‑
1bbl(cd137l)、pd
‑
l1、pd
‑
l2、pd
‑
1、b7
‑
h3、b7
‑
h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、tim3、b7h3、b7h4、vista、kir、2b4(属于cd2分子家族，并在所有nk、γδ和记忆性cd8
+
(αβ)t细胞上表达)、cd160(也称为by55)和cgen
‑
15049。
[0094]
如本文所用的，术语“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”指的是总体或部分地减少、抑制、干扰或调节一种或多种免疫检查点分子的任何药剂、分子、化合物、化学品、蛋白质、多肽、大分子等。此类抑制剂可以包括小分子抑制剂，或可以包括结合并阻断或抑制免疫检查点受体的抗原结合分子，或结合并阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。说明性免疫检查点抑制剂包括抗免疫检查点分子拮抗剂抗体，例如但不限于德瓦鲁单抗(durvalumab)(抗pd
‑
l1抗体；medi4736)、派姆单抗(抗pd
‑
1单克隆抗体)、纳武单抗(抗pd
‑
1抗体)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(ct
‑
011；人源化抗pd
‑
1单克隆抗体)、amp224(重组b7
‑
dc
‑
fc融合蛋白)、bms
‑
936559(抗pd
‑
l1抗体)、阿特珠单抗(mpldl3280a；人fc优化的抗pd
‑
l1单克隆抗体)、阿维鲁单抗(msb0010718c；人抗pd
‑
l1抗体)、伊匹单抗(抗ctla
‑
4检查点抑制剂)、曲美木单抗(tremelimumab)(ctla
‑
4阻断性抗体)和抗ox40。
[0095]
在本发明上下文中的术语“免疫效应细胞”，涉及在免疫反应期间发挥效应器功能的细胞。例如，此类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子、杀灭微生物、分泌抗体、识别受感染或癌变的细胞，并任选地清除这些细胞。例如，免疫效应细胞包含t细胞(细胞毒性t细胞、辅助t细胞、肿瘤浸润性t细胞)、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。
[0096]
术语“免疫应答”指的是宿主哺乳动物的免疫系统对特定物质(如抗原或免疫原)的任何可检测的应答，例如先天免疫应答(如toll受体信号传导级联反应的激活)、细胞介导的免疫应答(例如免疫系统的t细胞如抗原特异性t细胞和非特异性细胞介导的应答)和体液免疫应答(例如b细胞介导的应答，如产生抗体并分泌到血浆、淋巴和/或组织液中)。
[0097]
关于t细胞，尤其是cd8
+
t细胞的术语“免疫功能”或“功能”指的是t细胞增殖、被激活和/或溶细胞的能力。t细胞的免疫功能可以使用众所周知的功能测定法来评估，这些测定法测量增殖、激活或细胞溶解中的任何一种或多种。在特定的示例中，将t细胞的抗肿瘤活性用于评估其免疫功能。备选地，可以评估t细胞中各种效应蛋白的表达和/或分泌，例如ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
‑
2、ki67或cd107a。例如，ifn
‑
γ、il
‑
2和tnf可作为cd8
+
t细胞激活的生物标志物；cd107a可作为脱粒的标志物；以及ki67可作为t细胞增殖的生物标志物。因此，功能性t细胞或t细胞群，特别是功能性cd8
+
t细胞或cd8
+
t细胞群，是指能够以来自健康受试者的t细胞的预期水平进行增殖、被激活和/或溶细胞的t细胞，如使用上述和本文所述的测定法和/或效应蛋白/生物标志物评估的。相反，功能失调的t细胞或t细胞群，例如功能失调的cd8
+
t细胞或cd8
+
t细胞群，其增殖、被激活和/或溶细胞的能力降低或减少，例如，其增殖、被激活和/或溶细胞的水平降低或减少，如使用上述和本文所述的测定法和/或效应蛋白/生
物标志物评估的(例如，与功能性t细胞或t细胞群相比，降低或减少了大约或至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)。
[0098]
术语“免疫疗法”指的是以下任何一种疗法，其中将人或动物的免疫系统的一种或多种组分刻意调节，以直接或间接获得一些治疗益处，包括全身和/或局部效果，以及预防性和/或治疗性效果。免疫疗法可以包括通过任何途径(例如，口服、静脉内、经皮、通过注射、通过吸入等)，无论是全身、局部或二者兼有，将一种或多种免疫治疗剂单独或以任何组合施用于人类或动物受试者。免疫疗法可以涉及激发、增加、减少、暂停、预防、阻断或以其它方式调节细胞因子的产生，和/或激活或减活细胞因子或免疫细胞，和/或调节免疫细胞的水平，和/或向身体中特定部位或特定类型的细胞或组织递送一种或多种治疗性或诊断性物质，和/或破坏特定的细胞或组织。免疫疗法可用于实现局部效应、全身效应或二者的组合。
[0099]
如本文所用的术语“免疫治疗剂”，指的是间接或直接恢复、增强、刺激或增加机体对抗癌细胞的免疫应答和/或减少其它抗癌疗法副作用的任何药剂、化合物或生物制品。因此，免疫疗法是一种直接或间接刺激或增强免疫系统对癌细胞的应答和/或减轻可能由其它抗癌剂导致的副作用的疗法。免疫疗法在本领域中也被称为免疫学疗法、生物学疗法、生物学应答调节剂疗法和生物疗法。本领域中已知的常规免疫治疗剂的示例包括但不限于细胞因子、癌症疫苗、单克隆抗体和非细胞因子佐剂。备选地，免疫治疗可以由给受试者施用一定量的免疫细胞(t细胞、nk细胞、树突细胞、b细胞等)组成。免疫治疗剂可以是非特异性的，即广泛性加强免疫系统，从而使人体更有效地对抗癌细胞的生长和/或扩散，或者它们可以是特异性的，即靶向癌细胞本身。免疫治疗方案可以联合使用非特异性和特异性免疫治疗剂。非特异性免疫治疗剂是刺激或间接改善免疫系统的物质。非特异性免疫治疗剂已被单独用作治疗癌症的主要疗法，以及作为主要疗法的补充，在这种情况下，非特异性免疫治疗剂作为佐剂发挥作用以增强其它疗法(例如，癌症疫苗)的有效性。非特异性免疫治疗剂也可以在后一种情况下发挥作用，以减少其它疗法的副作用，例如由某些化学治疗剂诱发的骨髓抑制。非特异性免疫治疗剂可以作用于关键的免疫系统细胞并引起继发性应答，如增加细胞因子和免疫球蛋白的产生。备选地，该药剂本身可以包含细胞因子。非特异性免疫治疗剂通常分为细胞因子或非细胞因子佐剂。许多细胞因子已经在癌症治疗中得到应用，可以作为旨在加强免疫系统的通用非特异性免疫疗法，或者作为与其它疗法一起提供的佐剂。合适的细胞因子包括但不限于干扰素、白细胞介素和集落刺激因子。本发明涵盖的干扰素(ifn)包括常见类型的ifn，即ifn
‑
alpha(ifn
‑
α)、ifn
‑
beta(ifn
‑
β)和ifn
‑
gamma(ifn
‑
γ)。ifn可以直接作用于癌细胞，例如，通过减缓它们的生长，促进它们发展成更具有正常行为的细胞和/或增加它们的抗原产生，从而使免疫系统更容易识别并摧毁癌细胞。ifn还可以间接作用于癌细胞，例如，通过减缓血管生成、加强免疫系统和/或刺激天然杀伤(nk)细胞、t细胞和巨噬细胞。重组ifn
‑
α可在市场上获得，如roferon(roche pharmaceuticals)和intron a(schering corporation)。本发明涵盖的白细胞介素包括il
‑
2、il
‑
4、il
‑
11和il
‑
12。市售的重组白细胞介素的示例包括 (il
‑
2；chiron corporation)和(il
‑
12；wyeth pharmaceuticals)。zymogenetics,inc.(seattle,wash.)目前正在测试一种重组形式的il
‑
21，它也被涵盖用于本发明的联合中。本发明涵盖的集落刺激因子(csf)包括粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf或非格司亭)、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf或沙格司亭)和促红细胞生成素(阿法依泊汀、达贝泊汀(darbopoietin))。在接受传统化疗的受试者中，使用一种或多种生长因子治疗有助于刺激新血细胞的生成。相应地，使用csf治疗可以有助于减少化疗相关的副作用，并允许使用更高剂量的化学治疗剂。多种重组集落刺激因子可在市场上获得，例如(g
‑
csf；amgen)、neulasta(培非司亭(pelfilgrastim)；amgen)、leukine(gm
‑
csf；berlex)、procrit(促红细胞生成素；ortho biotech)、epogen(促红细胞生成素；amgen)、aranesp(促红细胞生成素)。除了具有特异性或非特异性靶标之外，免疫治疗剂可以是主动的，即刺激身体自身的免疫应答，包括体液和细胞免疫应答，或者它们也可以是被动的，即包括免疫系统组分，如抗体、效应免疫细胞、抗原呈递细胞等，这些组分是身体外部产生的。在特定的实施方案中，被动免疫疗法涉及使用一种或多种单克隆抗体，这些抗体对在癌细胞或免疫细胞表面上发现的特定抗原具有特异性，或者对特定的细胞生长因子具有特异性。单克隆抗体可以以多种方式用于癌症治疗，例如，增强受试者对特定类型癌症的免疫应答，通过靶向特定细胞生长因子(例如参与血管生成的生长因子)来干扰癌细胞的生长，或者当与药剂(例如，化学治疗剂、放射性颗粒或毒素)连接或缀合时通过增强其它抗癌剂向癌细胞的递送。目前用作癌症免疫治疗剂的单克隆抗体包括但不限于阿仑单抗贝伐单抗西妥昔单抗帕尼单抗帕妥珠单抗(2c4)、曲妥珠单抗托西莫单抗阿昔单抗阿达木单抗阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、托珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗巴维昔单抗(bavituximab)、贝利木单抗布雷奴单抗(briankinumab)、卡那奴单抗西利珠单抗、赛妥珠单抗西弗斯妥珠单抗(cidfusituzumab)、西地妥珠单抗(cidtuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克瑞组单抗(crenezumab)、达克珠单抗达罗土珠单抗(dalotuzumab)、地诺单抗(罗土珠单抗(dalotuzumab)、地诺单抗()、依库珠单抗依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、戈利木单抗伊匹单抗(ipilimumab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、英夫利西单抗拉贝珠单抗(labetuzumab)、来金珠单抗(lebrikizumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、培戈
‑
鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫格利组单抗(mogamulizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫托珠单抗(motovizumab)、莫罗单抗(muronomab)、那他珠单抗耐昔妥珠单抗尼妥珠单抗诺维珠单抗(nolovizumab)、努维珠单抗(numavizumab)、奥洛组单抗(olokizumab)、奥马珠单抗奥那妥组单抗(onartuzumab，又名metmab)、帕利珠单抗帕
考珠单抗(pascolizumab)、派弗西妥珠单抗(pecfusituzumab)、派妥珠单抗(pectuzumab)、派姆单抗培克珠单抗(pexelizumab)、普立昔单抗(priliximab)、雷利珠单抗(ralvizumab)、兰尼单抗(ranibizumab，)、来丝利维珠单抗(reslivizumab)、瑞替珠单抗(reslizumab)、来西维珠单抗(resyvizumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、罗他珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、鲁普利珠单抗(ruplizmnab)、沙利姆单抗(sarilumab)、司库奇尤单抗(secukinumab)、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、西法木单抗(sifalimumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗希普利珠单抗(siplizumab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗托利珠单抗(toralizumab)、土库西妥珠单抗(tucusituzumab)、乌玛斯单抗(umavizmab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、尤特克单抗维多珠单抗维西珠单抗(visilizumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)。
[0100]
如本文所用的，“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的可用性的出版物、记录、图解或任何其它表达媒介。例如，本发明试剂盒的说明材料可以附在装有本发明治疗性或诊断性药剂/试剂的容器上，或与装有本发明治疗性或诊断性药剂/试剂的容器一起装运。
[0101]
在本文中使用时，术语“标记”指的是可检测的化合物或组合物。标记通常直接或间接地与试剂(如，多核苷酸探针或抗体)缀合或融合，并协助检测与之缀合或融合的试剂。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化底物化合物或组合物的化学变化，进而产生可检测的产物。
[0102]
如本文所用的，术语“定位”及其语法上的等同形式意指积聚在或局限于特定或有限的空间或区域，例如特定的细胞、组织、细胞器或细胞内区域，如细胞区室(例如，细胞核、细胞质、核膜、细胞膜等)。
[0103]
术语“多重pcr”指的是使用多于一个引物组，对获自单一来源(例如，个体)的核酸进行的单个pcr反应，目的是为了在单个反应中扩增两个或更多个dna序列。
[0104]
术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”在本文中可互换使用，指的是期望治疗或预防的任何受试者，尤其是脊椎动物受试者，甚至更具体地说是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适脊椎动物包括但不限于，脊索动物(chordata)亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如，人类、猴和猿类，并包括猴的物种例如来自猕猴属(macaca)(例如食蟹猴，如食蟹猕猴(macaca fascicularis)，和/或恒河猴(macaca mulatta))和狒狒(豚尾狒狒(papio ursinus))，以及狨猴(来自狨属(callithrix)的物种)、松鼠猴(来自松鼠猴属(saimiri)的种类)和绢毛猴(来自柽柳猴属(saguinus)的物种)，以及猿的物种例如黑猩猩(黑猩猩(pan troglodytes)))、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔类动物(如，家兔、野兔)、牛科动物(如，牛)、绵羊类动物(如，绵羊)、山羊类动物(如，山羊)、猪类动物(如，猪)、马类动物(如，马)、犬科动物(如，狗)、猫科动物(如，猫)、禽类(如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟例如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸鱼)、爬行动物(蛇、蛙、蜥蜴等)和
鱼类。优选的受试者是患有癌症的人类。
[0105]
术语“药物组合物”或“药物制剂”指的是一种制剂，其形式允许活性成分(一种或多种)的生物学活性是有效的，并且不含有对接受施用该组合物或制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加成分。这种制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)指的是可以合理地施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些物质。
[0106]
术语“预测性”及其语法形式，一般指的是生物标志物或生物标志物签名，其提供直接或间接鉴定患者对疗法有应答的可能性或获得对疗法应答的临床结果的手段。
[0107]
术语“预后性”及其语法形式，一般指的是提供关于个体中疾病或状况的可能进展或严重程度的信息的药剂/试剂或方法。在一些实施方案中，预后也指对受试者疾病或状况的疗法或其它治疗方案表现出阳性或阴性应答的能力。在一些实施方案中，预后指的是预测疾病/状况相关症状的存在或减轻的能力。预后性药剂/试剂或方法可以包括将受试者或从受试者获取的样品划分为多种类别之一，其中这些类别与受试者将经历特定结果的不同可能性相关。例如，类别可以是低风险和高风险，其中低风险类别中的受试者与高风险类别中的受试者相比，遭遇不良结果的可能性较低(例如，在给定的时间段内，如5年或10年)。不良结果可能是例如疾病进展、疾病复发或可归因于疾病的死亡。
[0108]
所谓“放射疗法”意指使用定向γ射线或β射线来诱导对细胞的足够的损害，从而限制其正常发挥功能的能力或完全摧毁细胞。应当理解，在本领域中有许多已知的方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗是以一次性施用给予，典型的剂量范围为每天10至200单位(戈瑞)。
[0109]
如本文所用的，如果根据本领域公认的一套客观标准或其合理改进，受试者显示出抗癌效果的证据，包括有临床显著性的益处，如防止癌症症状或降低癌症症状的严重程度或减缓癌症的进展，则认为接受疗法治疗的癌症患者(或患癌受试者)对该疗法“应答”、具有“应答”、具有“阳性应答”或“有应答的”。将理解的是，上述术语也可以用在癌症方面。用于评估抗癌治疗对癌症的效果的各种不同的客观标准在本领域中是已知的。世界卫生组织(who)的标准(miller,a b等人,cancer 1981；47(1):207
‑
14)和其改进版本，实体瘤应答评估标准(recist)(therasse p等人,j natl cancer inst 2000；92:205
‑
16)及其修订版本(eisenhauer e a,new response evaluation criteria in solid tumors:revised recist guideline(版本1.1).eur j cancer 2009；45(2):228
‑
47)是几套客观标准，其基于肿瘤病灶大小和数量的成像测量和新病灶的检测，例如根据计算机断层扫描(ct)、磁共振成像(mri)或常规射线照片。所选病灶(称为靶病灶)的尺寸用于计算不同时间点图像之间的肿瘤负荷变化。然后，将计算出的应答分为完全应答(cr)、部分应答(pr)、病情稳定(sd)或病情进展(pd)。cr是肿瘤的完全消失(
‑
100％)，而pd是大约20％
‑
25％或更大的增加(取决于特定的标准)和/或新病灶的出现。pr是肿瘤病灶尺寸的显著减小(至少约30％)(没有出现新的病灶)，但未达到完全应答。sd介于pr和pd之间。(详见表1和表2。)这些标准被广泛用作ii期临床试验中评估抗癌药剂疗效的主要终点，例如作为总体生存的替代指标。然而，使用who、recist和recist 1.1标准的单独的解剖成像设计为检测细胞毒性剂的早期效果，并有一定的局限性，特别是在评估稳定病情的新型癌症疗法的活性方面。接受免疫治疗性抗癌剂或分子靶向抗癌剂治疗的患者的临床应答模式可能超出细胞毒性剂的范围，并且可能在肿瘤负荷最初增加或出现新病灶后会表现出来。例如，对免疫检查点抑制剂有意义
的肿瘤应答可能在一段延迟后出现，在某些情况下是在who或recist定义的pd之后。定义了被称为免疫相关应答标准(irrc)的标准，试图去捕捉在免疫疗法中观测到的其它有利的应答模式(wolchok,j d等人.(2009)guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors:immune
‑
related response criteria.clin.care res.15,7412
‑
7420.)。鉴定了四种与有利的生存相关的模式，即基线病灶减小并且无新病灶；持久的病情稳定；肿瘤总负荷最初增加，但最终有应答；以及在新病灶(一个或多个)出现期间或之后肿瘤总负荷的降低，其中后两种不同于根据who或recist标准视为有利的应答模式。irrc包括完全应答(ircr)、部分应答(irpr)、病情稳定(irsd)和病情进展(irpd)的标准。除了别的以外，irrc将可测量的新病灶纳入“总肿瘤负荷”，并将该变量与基线测量值进行比较，而不是假设新病灶必然代表病情进展。总之，根据免疫相关应答标准，ircr是指所有病灶完全消失，无论是否可测量，且无新病灶；irpr是肿瘤负荷相对于基线减少≥50％；irsd是指不存在病情进展(irpd)的情况下，不符合ircr或irpr标准的病情；irpd是肿瘤负荷相对于最低点(记录的最小肿瘤负荷)增加≥25％(wolchok，参见上文)。ircr、irpr和irpd要求从首次记录之日起至少4周时通过重复、连续评估进行确认。ircr、irpr和irsd包括符合who标准的所有cr、pr或sd患者，以及从who pd转变为这些irrc类别的患者。然而，一些根据who或recist标准将被归类为具有pd的患者，根据irrc反而被归类为pr或sd，从而确定他们可能拥有有利生存。irrc适用于免疫检查点抑制剂和其它免疫治疗剂。本领域普通技术人员会理解，其它的应答标准在本领域是已知的，这些标准考虑多种因素，例如将肿瘤动脉强化程度和/或肿瘤密度的变化作为肿瘤存活组织的指标，动脉强化减弱和肿瘤密度减小是存活肿瘤组织减少(例如，由于肿瘤坏死)的指标。例如，改进的recist标准(mrecist)考虑了肿瘤动脉强化程度的变化(lencioni r和llovet j m.semin liver dis 30:52
‑
60,2010)。choi标准和改进的choi标准考虑了ct上肿瘤密度的减小。choi h等人,j clin oncol 25:1753
‑
1759,2007；nathan p d等人,cancer biol ther 9:15
‑
19,2010；smith a d等人,am j roentgenol 194:157
‑
165,2010。此类标准可能对某些癌症类型和/或某些类别的治疗剂特别有用。例如，尽管治疗有效，但在肿瘤例如淋巴瘤、肉瘤、肝细胞瘤、间皮瘤和胃肠道间质瘤中，肿瘤大小的变化可能最小。ct肿瘤密度、造影增强或mri特征似乎比大小更有参考价值。在某些实施方案中，可以使用功能成像，例如使用正电子发射断层扫描(pet)。例如，可以对实体瘤使用pet应答标准(percist)，其中治疗应答通过代谢变化进行评估，而代谢变化用(18)f
‑
fdg pet成像评估，并以示踪剂摄取减少作为指征(wahl r l等人,j nucl med 2009；50,增刊1:122s
‑
50s)。还应当理解，针对各种特定癌症类型如黑色素瘤、乳腺癌和肺癌而制定的应答标准在本领域是已知的。相比之下，如果疗法没有提供临床显著的益处，例如防止症状或降低症状的严重程度，或者增加了癌症的进展速率，则认为已经接受疗法治疗的癌症患者对疗法“不应答”、“缺乏应答”、具有“阴性应答”或“无应答的”。
[0110]
出于本公开的目的，对于接受以免疫疗法(例如，免疫检查点抑制剂)作为单一疗法治疗或与一种或多种其它活性剂(例如补体抑制剂、其它抗癌剂或二者兼有)联合治疗的癌症患者，至少根据免疫相关应答标准，如果患者具有完全应答、部分应答或病情稳定，则视为对治疗“应答”、具有“应答”或“有应答的”。(癌症患者根据recist、recist 1.1、who和/或其它标准如上文提到的标准也可能应答。)同样，这种情况下的癌症被称为对治疗“应答”、“有应答的”或“敏感的”。根据免疫相关应答标准，如果患者具有病情进展，则认为癌症
患者对治疗“不应答”、不具有“应答”或“无应答的”。(癌症患者根据recist、recist 1.1、who和/或其它标准如上文提到的标准，也可能无应答)。同样，这种情况下的癌症被称为对治疗“不应答”、“无应答的”、“不敏感的”或“有抗性的”。(如果在治疗存在的情况下，患者最初产生应答但随后表现出病情进展，则也认为癌症对治疗产生了抗性。)因此，例如，对于本文描述的与对癌症治疗的应答相关的方法和产品(例如，预测应答可能性的方法、根据预测的应答对患者进行分类的方法、增加应答可能性的方法)，除非另有规定，否则将应答定义为ircr、irpr或irsd，而将缺乏应答定义为irpd。在某些实施方案中，可以指定任何有用的应答标准。可能已经证明应答标准与益处相关，如总体生存的增加或其它有临床意义的益处。应当理解，将来可能会对现有的应答标准进行完善或修订，例如包括适用于免疫检查点抑制剂的临床活动的其它有利模式(例如，与总生存期的延长相关)或在其它方面有用的标准。在某些实施方案中，可以指定任何此类应答标准用于本文描述的方法中。
[0111]
如本文所用的术语“样品”，包括可以从受试者提取、未处理、经处理、稀释或浓缩的任何生物标本。样品在其范围内包括从受试者分离出来的相似流体、细胞或组织(例如，手术切除的肿瘤组织、活检，包括细针抽吸)的集合，以及存在于受试者中的流体、细胞或组织。在一些实施方案中，样品是生物流体。通常，生物流体在生理温度是液体，并且可以包括存在于受试者或生物源中、取自受试者或生物源、自受试者或生物源表达、或以其它方式从受试者或生物源提取的天然存在的流体。某些生物流体来源于特定的组织、器官或局部区域，而其它一些生物流体可能更全面或系统地位于受试者或生物源中。生物流体的示例包括血液，血清和浆膜液，血浆，淋巴，尿液，唾液，囊液，泪液滴，粪便，痰液，分泌组织和器官的粘膜分泌物，阴道分泌物，腹水如与非实体瘤相关的腹水，胸膜、心包、腹膜、腹部和其它体腔的液体，从支气管灌洗收集的液体等。生物流体还可以包括与受试者或生物源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基、灌洗液等。如本文所用的术语“样品”包括从受试者中取出的材料或受试者中存在的材料。
[0112]
如本文所用的，“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“参照水平”、“对照样品”、“对照细胞”、“对照组织”或“对照水平”，指的是用于比较目的的样品、细胞、组织、标准或水平。在一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自同一受试者或个体的健康和/或非病性身体部分(例如，组织或细胞)，但是在不同的时间点，例如治疗前后。在另一实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是接受评估的受试者或个体的健康个体。在特定的示例中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是或者包含功能性t细胞、功能失调的t细胞(例如，衰竭的t细胞)、来自对疗法有应答或敏感的受试者的t细胞或来自对疗法无应答或抗性的受试者的t细胞。在特定的实施方案中，t细胞是cd8
+
t细胞。
[0113]
本发明的各种方法学包括以下步骤，该步骤涉及将值、水平、特征、特性、属性等与“适当的对照”进行比较，所述“适当的对照”在本文中可互换地称为“合适的对照”、“对照样品”或“参照物”。“适当的对照”、“合适的对照”、“对照样品”或“参照物”是本领域普通技术人员所熟悉的用于比较目的的任何对照或标准。在一些实施方案中，“适当的对照”或“合适的对照”是在细胞、组织或患者(例如，对照细胞、细胞群、组织或患者)中确定的值、水平、特征、特性、属性等，其表现出例如特定的生物标志物谱。“适当的对照”可以是本发明的一种或多种生物标志物的水平/比率模式，其与特定的生物标志物谱相关，细胞样品可以与该生
物标志物谱进行比较。细胞样品也可以与阴性对照进行比较。此类参照水平也可以根据用于测量生物样品中生物标志物水平的特定技术(例如，lc
‑
ms、gc
‑
ms、elisa、pcr等)来定制，其中生物标志物的水平可能基于所使用的特定技术而有所不同。合适的对照可以包括，例如，功能性t细胞、功能失调的t细胞(例如衰竭的t细胞)、来自对癌症疗法有应答或敏感的受试者的t细胞、以及来自对癌症疗法无应答或抗性的受试者的t细胞。
[0114]
如本文所用的，术语“分层”和“分类”在本文中可以互换地使用，并且指的是根据特定生理或病理生理状态或状况的特征，将受试者分为不同的层次或类别。例如，根据受试者是否可能对疗法(例如，化疗或免疫疗法)应答来对受试者群体进行分层，其涉及根据在t细胞中疗法应答生物标志物(包括eomes
‑
641k
‑
ac、eomes
‑
641k
‑
me和eomes
‑
373k
‑
me)的水平，任选地与一种或多种其它生物标志物(例如，ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
‑
2、ki67、pd
‑
1或cd107a)组合，来分配受试者。
[0115]
如本文所用的，术语“治疗”指的是旨在改变临床病理学过程中接受治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗的期望效果包括降低病情进展速度、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除了与癌症相关的一种或多种症状，包括但不限于减少癌性细胞的增殖(或破坏癌细胞)、减少病原体感染、减轻疾病引起的症状、提高患有疾病的人群的生活质量、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量和/或延长个体的生存期，则个体被成功“治疗”。短语“以疗法治疗”、“用疗法进行治疗”、“以药剂治疗”、“用药剂进行治疗”等类似短语指的是向患者施用有效量的疗法或药剂，包括癌症疗法或药剂(例如，细胞毒性剂或免疫治疗剂)，或共同向患者施用有效量的两种或多种疗法或药剂，包括癌症疗法或药剂(例如，选自细胞毒性剂和免疫治疗剂的两种或多种药剂)。
[0116]
如本文所用的，“治疗结果”指的是预测癌症患者对选定疗法或治疗的应答，包括患者接受特定治疗后将经历积极或消极结果的可能性。如本文所用的，“指示积极的治疗结果”或类似短语指的是患者从选定治疗中将经历有益结果的可能性增加(例如，完全或部分应答、完全或部分缓解、肿瘤尺寸减小、病情稳定等)。相反，“指示消极的治疗结果”或类似短语意在表示患者在潜在癌症的进展(例如，病情进展、疾病复发、肿瘤尺寸增加等)方面，将不能从选定治疗中获益的可能性增加。
[0117]
如本文所用的“肿瘤”，指的是所有赘生细胞的生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性的”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”、“过多增殖性病症”和“肿瘤”在本文中所指的并不相互排斥。
[0118]
如本文所用的，基因名称的下划线或斜体应表示该基因，而不是其蛋白质产物，在没有任何下划线或斜体的情况下基因的名称表示的是其蛋白质产物。例如，“eomes”应意指eomes基因，而“eomes”应表示由eomes基因的转录和翻译和/或可变剪接产生的蛋白质产物(一种或多种)。
[0119]
除非另外特别说明，否则本文描述的每个实施方案在必要的修改后会适用于各个和每个实施方案。2.检测、诊断和预后的方法
[0120]
eomes是一种与t细胞衰竭和功能失调关联的转录因子。本发明公开了eomes多肽序列中641位的赖氨酸(包含在eomes的nls中)或eomes多肽中373位的赖氨酸(包含在eomes的dna结合结构域中)的不同翻译后修饰影响eomes定位于细胞核或细胞质，并可能还影响
蛋白:蛋白或蛋白:dna的相互作用。此外，具有这些赖氨酸的不同翻译后修饰的eomes多肽与功能性或功能失调的t细胞有关，并可以用于预测对癌症疗法的应答性。
[0121]
代表性的eomes多肽包含以下氨基酸序列：yttp[seq id no:1]，其中373位(即373k)和641位的赖氨酸(即641k)以粗体字体突出显示。
[0122]
本发明人已经发现，641位赖氨酸的乙酰化(即，eomes
‑
641k
‑
ac)将eomes大部分定位于t细胞(例如，cd8
+
t细胞)的细胞核。此外，eomes
‑
641k
‑
ac的表达与功能失调的t细胞关联，具有衰竭的、衰老的t细胞签名(例如，ki67、tnf
‑
α和/或ifn
‑
γ的低表达或表达减少)。与这一发现相一致的是，eomes
‑
641k
‑
ac的表达与对癌症疗法的抗性或无应答性关联。
[0123]
本发明人还发现，eomes中641位赖氨酸的甲基化(即，eomes
‑
641k
‑
me)或eomes中373位赖氨酸的甲基化(即，eomes
‑
373k
‑
me)，包括二甲基化(me2)，与功能性t细胞表型和对癌症疗法的应答性有关联。这些甲基化形式的eomes倾向于更多地定位于细胞质而不是细胞核，尽管也观察到一些细胞核表达。
[0124]
因此，根据本发明，eomes
‑
641k
‑
ac、eomes
‑
641k
‑
me和/或eomes
‑
373k
‑
me可以用作生物标志物，用于评估t细胞的功能，预测受试者对癌症疗法(例如，化疗和/或免疫疗法)的应答可能性，包括对疗法的抗性或敏感性的可能性，将癌症患者分层为对疗法的可能应答者或无应答者，对癌症患者用疗法的治疗进行管理，以及预测接受疗法治疗的癌症患者的治疗结果。
[0125]
用于实施本发明的t细胞可以从任何合适的含有t细胞的患者样品中获取，其说明
性示例包括液体活检、肿瘤活检、原代细胞培养物或来源于t细胞的细胞系，以及保存的肿瘤样品，例如福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻肿瘤样品。在一些实施方案中，样品在通过疗法治疗之前获得。在其它实施方案中，样品在通过疗法治疗之后获得。在一些实施方案中，样品包含组织样品，其可以是福尔马林固定和石蜡包埋的、存档的、新鲜的或冷冻的。在一些实施方案中，样品是全血。在特定的实施方案中，t细胞是cd8
+
t细胞。
[0126]
生物标志物(例如，eomes
‑
641k
‑
ac、eomes
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641k
‑
me和eomes
‑
373k
‑
me中的任何一种或多种，以及任选地一种或多种其它生物标志物，如t细胞功能的生物标志物，如ifn
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γ、tnf
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α、il
‑
2、ki67、pd
‑
1或cd107a)的存在和/或水平/量可以根据本领域已知的任何适当的标准进行定性和/或定量的确定，包括但不限于蛋白质和蛋白质片段。在某些实施方案中，第一样品中生物标志物的存在和/或表达水平/量与第二样品(例如，通过疗法治疗之前)中的存在/不存在和/或表达水平/量相比有所增加或升高。在某些实施方案中，第一样品中生物标志物的存在/不存在和/或水平/量与第二样品中的存在和/或水平/量相比有所减少或降低。在某些实施方案中，第二样品是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织。本文描述了用于确定基因的存在/不存在和/或水平/量的其它公开内容。
[0127]
在任何所述方法的一些实施方案中，水平升高指的是通过本领域已知的标准方法，例如本文描述的方法，与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比，生物标志物(例如，蛋白质或核酸)水平总体上增加大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多中的任一种。在某些实施方案中，水平升高指的是样品中生物标志物的水平/量的增加，其中的增加是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中相应生物标志物的水平/量的至少大约1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍中的任一种。在一些实施方案中，水平升高指的是与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞、对照组织或内部对照(如，看家基因)相比，总体上增加了超过约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍或约3.25倍。
[0128]
在任何所述方法的一些实施方案中，水平降低指的是通过本领域已知的标准方法，例如本文描述的方法，与参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比，生物标志物(例如，蛋白质或核酸(如，基因或mrna))水平总体上降低大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多中的任一种。在某些实施方案中，水平降低指的是样品中生物标志物的水平/量的减少，其中的减少是参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织中相应生物标志物的水平/量的至少大约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍中的至少一种。
[0129]
样品中各种生物标志物的存在和/或水平/量可以通过众多方法学进行分析，其中许多方法是本领域已知的并被技术人员理解，包括但不限于免疫组织化学(“ihc”)、western印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、elisa、elifa、荧光活化细胞分选(“facs”)、massarray、蛋白组学、基于血液的定量测定(例如，血清elisa)、生化酶学活性测定、原位杂交、southern分析、northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应(“pcr”)(包括实时定量pcr(“qrt
‑
pcr”)和其它扩增类型检测法，例如分支dna、sisba、tma等)、rna
‑
seq、fish、微阵列分析、基因表达谱、和/或基因表达系列分析(“sage”)，以及可通过蛋白质、基因和/或组
织阵列分析进行的很多种测定法中的任何一种。用于评估基因和基因产物状态的典型方案见于例如ausubel等人编,1995,current protocols in molecular biology,第2单元(northern blotting),第4单元(southern blotting),第15单元(immunoblotting)和第18单元(pcr analysis)。还可以使用多重免疫测定法，例如由rules based medicine或meso scale discovery(“msd”)提供的测定法。
[0130]
在一些实施方案中，可以使用以下方法来确定生物标志物的存在和/或水平/量，特别是对于不以翻译后修饰为特征的生物标志物(例如，ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
‑
2、ki67、pd
‑
1或cd107a)，该方法包括：(a)对样品进行基因表达谱分析、pcr(例如rt
‑
pcr或qrt
‑
pcr)、rna
‑
seq、微阵列分析、sage、massarray技术或fish；和b)确定样品中生物标志物的存在和/或表达水平/量。在一些实施方案中，微阵列方法包括使用具有一个或多个核酸分子或者一个或多个多肽(例如肽或抗体)的微阵列芯片，该核酸分子可以在严格条件下与编码上述基因的核酸分子杂交，该多肽可以与由上述基因编码的一种或多种蛋白质结合。在一个实施方案中，该pcr方法是qrt
‑
pcr。在一个实施方案中，该pcr方法是多重pcr。在一些实施方案中，通过微阵列对基因表达进行测量。在一些实施方案中，通过qrt
‑
pcr对基因表达进行测量。在一些实施方案中，通过多重pcr对表达进行测量。
[0131]
用于评估细胞中mrna的方法是众所周知的，包括例如使用互补dna探针的杂交测定法(例如使用对一个或多个基因有特异性的标记的核糖核酸探针的原位杂交、northern印迹杂交和相关技术)和各种核酸扩增测定法(例如使用针对一个或多个基因有特异性的互补引物的rt
‑
pcr和其它扩增类型检测法，例如分支dna、sisba、tma等)。
[0132]
使用northern、斑点印迹或pcr分析可以方便地对来自哺乳动物的样品进行mrna分析。此外，这类方法可以包括一个或多个步骤，允许人们确定生物样品中靶mrna的水平(例如，通过同时检查“看家”基因如肌动蛋白家族成员的比较性对照mrna序列的水平)。任选地，可以确定扩增的靶cdna的序列。
[0133]
任选的方法包括这样的方案，其中通过微阵列技术检查或检测组织或细胞样品中的mrna，如靶mrna。使用核酸微阵列，对来自测试和对照组织样品的测试和对照mrna样品进行反转录和标记，以产生cdna探针。接着，探针与固定于固相支持物上的核酸阵列杂交。将该阵列配置成使得该阵列的每个成员的顺序和位置是已知的。例如，可以在固相支持物上排列一组所选基因，这些基因的表达与疗法的临床益处的增加或减少相关。标记的探针与特定的阵列成员杂交，表明探针所源自的样品表达了该基因。
[0134]
在优选的实施方案中，通过观察蛋白质水平来测量存在和/或水平/量。在某些实施方案中，该方法包括使生物样品(例如来自癌症患者的样品)与对疗法应答的生物标志物(例如，eomes
‑
641k
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ac、eomes
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641k
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me和/或eomes
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373k
‑
me)特异性的抗原结合分子在允许结合生物标志物(一种或多种)的条件下接触，并检测抗原结合分子或分子与生物标志物(一种或多种)之间是否形成复合物。此类方法可以是体外方法或体内方法。在一些实施方案中，将一种或多种抗生物标志物抗原结合分子用于选择符合疗法(例如免疫疗法)条件的受试者。
[0135]
在某些实施方案中，使用免疫组织化学(ihc)或免疫荧光显微术(if)方案对样品中生物标志物蛋白的存在和/或表达水平/量进行检查。在一些实施方案中，在来自个体的样品中疗法应答生物标志物(例如，eomes
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641k
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ac、eomes
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641k
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me和/或eomes
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373k
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me)
的水平是升高的水平，并且在进一步的实施方案中，使用ihc或if来确定。在一个实施方案中，使用包含下列的方法来确定生物标志物的水平：(a)利用抗原结合分子进行样品(例如来自癌症患者的样品)的ihc或if分析；和b)确定样品中生物标志物的水平。在一些实施方案中，相对于参照物来确定ihc或if的染色强度。在一些实施方案中，参照物是参照值。在一些实施方案中，参照物是参照样品(例如，对照细胞系染色样品或者来自非癌性患者的样品或来自治疗之前患者的样品)。
[0136]
在特定的方法中，可以将样品与对所述生物标志物特异性的抗原结合分子在足以形成分子
‑
生物标志物复合物的条件下接触，然后检测所述复合物。生物标志物的存在可以通过多种方式检测，例如通过显微术(例如，if显微术)、western印迹和elisa程序，以用于测定很多种组织和样品，包括血液。使用这种测定形式的范围广泛的免疫测定技术可获自参见例如第4,016,043号、第4,424,279号和第4,018,653号美国专利。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法还包括使标记的抗体与靶生物标志物直接结合。
[0137]
在某些实施方案中，针对所测定的生物标志物的量的差异和所使用的样品质量的可变性，以及测定运行之间的可变性，对样品进行标准化。这种标准化可以通过检测和并入某些标准化生物标志物的表达(包括众所周知的看家基因的表达产物)来实现。备选地，标准化可以基于所有测定基因或其大子集的平均或中位信号(全局标准化方法)。在逐个基因的基础上，将所测量的受试者肿瘤mrna或蛋白质的标准化量与参照集合中发现的量进行比较。每名受试者的每个所测试肿瘤的每个mrna或蛋白质的标准化表达水平可以表示为参照集合中所测量的表达水平的百分比。在待分析的特定受试者样品中测量的存在和/或表达水平/量将落在该范围内的某个百分点，这可以通过本领域熟知的方法来确定。
[0138]
在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自同一受试者或个体的单个样品或组合的多个样品，所述样品是在一个或多个与获取测试样品时不同的时间点获取的。例如，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是在比获取测试样品更早的时间点从同一受试者或个体获取的。如果在治疗之前获取参照样品而随后在治疗之后获取测试样品，则此类参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织可能有用。
[0139]
在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自并非受试者或个体的一名或多名健康个体的多个样品的组合。在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自并非受试者或个体的一名或多名患有疾病或病症(如癌症)的个体的多个样品的组合。
[0140]
在一些实施方案中，样品是临床样品。在一些实施方案中，样品是液体活检，例如血液。在其它实施方案中，样品是组织样品，例如含有t细胞的肿瘤组织样品(例如，活检组织)。在一些实施方案中，组织样品是肺组织。在一些实施方案中，组织样品是肾组织。在一些实施方案中，组织样品是皮肤组织。在一些实施方案中，组织样品是胰腺组织。在一些实施方案中，组织样品是胃组织。在一些实施方案中，组织样品是膀胱组织。在一些实施方案中，组织样品是食管组织。在一些实施方案中，组织样品是间皮组织。在一些实施方案中，组织样品是乳腺组织。在一些实施方案中，组织样品是甲状腺组织。在一些实施方案中，组织样品是结直肠组织。在一些实施方案中，组织样品是头颈部组织。在一些实施方案中，组织
样品是骨肉瘤组织。在一些实施方案中，组织样品是前列腺组织。在一些实施方案中，组织样品是卵巢组织、hcc(肝脏)、血细胞、淋巴结和/或骨/骨髓组织。在一些实施方案中，组织样品是结肠组织。在一些实施方案中，组织样品是子宫内膜组织。在一些实施方案中，组织样品是脑组织(如胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤等)。
[0141]
在一些实施方案中，肿瘤是恶性癌性肿瘤(即癌症)。在一些实施方案中，肿瘤和/或癌症是实体瘤或非实体或软组织肿瘤。软组织肿瘤的示例包括白血病(例如，慢性髓性白血病、急性髓性白血病、成人急性成淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、成熟b细胞急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、幼淋巴细胞白血病或毛细胞白血病)或淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤或霍奇金病)。实体瘤包括除血液、骨髓或淋巴系统以外的任何身体组织癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞源的和非上皮细胞源的那些。上皮细胞实体瘤的示例包括胃肠道、结肠、结直肠(例如，基底样结直肠癌)、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢(例如，子宫内膜样卵巢癌)、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官(例如，尿路上皮癌、异型增生尿路上皮癌、移行细胞癌)、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤、脑肿瘤和骨肿瘤。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(nsclc)。在一些实施方案中，癌症是二线或三线局部晚期或转移性的非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是腺癌。在一些实施方案中，癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(nsclc)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌(crc)或肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是原发性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是源自任何上述类型癌症的位于第二部位的转移性肿瘤。
[0142]
在一些实施方案中，使用选自下组中的方法来检测样品中的至少一种疗法应答生物标志物：facs、western印迹、elisa、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、hplc、表面等离子体共振、光学光谱学、质谱法、hplc、qpcr、rt
‑
qpcr、多重qpcr或rt
‑
qpcr、rna
‑
seq、微阵列分析、sage、massarray技术和fish，以及其组合。在一些实施方案中，使用facs分析或免疫荧光显微术来检测至少一种疗法应答生物标志物。在一些实施方案中，在血液样品中检测至少一种疗法应答生物标志物。在一些实施方案中，在从血液样品获取的cd8
+
t细胞中检测了至少一种疗法应答生物标志物。可以使用任何适当的方法来分离/富集这种细胞群，包括但不限于细胞分选。在一些实施方案中，在来自对用疗法治疗产生应答的个体的样品中，eomes
‑
641k
‑
ac的表达降低，适当地该疗法为免疫疗法(例如，包含抗免疫检查点分子抗体的疗法)。在一些实施方案中，在来自对用疗法治疗不应答或应答微弱的个体的样品中，eomes
‑
641k
‑
ac的表达升高，适当地该疗法为免疫疗法(例如，包含抗免疫检查点分子抗体的疗法)。在一些实施方案中，在来自对用疗法治疗不应答或应答微弱的个体的样品中，eomes
‑
641k
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me和/或eomes
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373k
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me的表达降低，适当地该疗法为免疫疗法(例如，包含抗免疫检查点分子抗体的疗法)。在一些实施方案中，在对用疗法治疗产生应答的来自个体的样品中，eomes
‑
641k
‑
me和/或eomes
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373k
‑
me的表达升高，适当地该疗法为免疫疗法(例如，包含抗免疫检查点分子抗体的疗法)。在特定的示例中，评估了生物标志物的比率，例如eomes
‑
641k
‑
ac与eomes
‑
641k
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me的比率，或者反之。
[0143]
在一些实施方案中，可以将一种或多种生物标志物的表达水平与参照物进行比较，该参照物可以包括例如，包含功能性或活性t细胞的样品、包含功能失调或衰竭的t细胞
的样品、来自未患癌症的受试者的样品、或者来自患有癌症但未接受治疗(例如，细胞毒性疗法或免疫疗法)的受试者的样品。在一些实施方案中，参照物可以包括来自多个受试者或样品的参照值。例如，作为一个整体，可以从健康受试者群体、对疗法应答的受试者群体或对疗法不应答的受试者群体，或从已知免疫功能的t细胞的多个样品中产生至少一种疗法应答生物标志物的表达水平的均值、平均值或中位值。可以从人群研究从具有共同特征(例如，相同的癌症类型和/或阶段，或接受常规疗法)的癌症获取的一组样品，例如用临床结果研究。这种组可用于衍生出参照物，例如参照数值，可将受试者的样品与之进行比较。
[0144]
本公开的某些方面涉及测量包含t细胞的样品中一种或多种生物标志物(例如，基因表达产物，包括mrna和蛋白质)的表达水平。在一些实施方案中，样品可以是外周血样品(例如，来自患有癌症的患者)。在一些实施方案中，样品是肿瘤样品。在一些实施方案中，可以处理样品以分开或分离一种或多种细胞类型(例如，cd8
+
t细胞)。在一些实施方案中，可以在不分开或不分离细胞类型的情况下使用样品。
[0145]
可以通过本领域已知的任何方法从受试者获取肿瘤样品，包括但不限于活检、内镜检查术或外科手术。在一些实施方案中，肿瘤样品可以通过方法例如冷冻、固定(如，通过使用福尔马林或类似的固定剂)和/或包埋于固体石蜡中来制备。在一些实施方案中，肿瘤样品可以切片。在一些实施方案中，可以使用新鲜的肿瘤样品(即，未经过上述方法进行制备的样品)。在一些实施方案中，可以通过在溶液中孵育来制备外周血样品，以保持mrna和/或蛋白质的完整性。
[0146]
在一些实施方案中，样品可以是外周血样品。外周血样品可以包括白细胞、pbmc等。可以使用本领域中已知的用于从外周血样品分离白细胞的任何技术。例如，可以抽取血液样品，可以裂解红细胞，而且可以分离出白细胞沉淀并用于样品。在另一示例中，密度梯度分离可用于从红细胞中分离出白细胞(如，pbmc)。在一些实施方案中，可以使用新鲜的外周血样品(即，没有经过上述方法制备的样品)。在一些实施方案中，可以通过在溶液中孵育来制备外周血样品，以保持mrna和/或蛋白质的完整性。
[0147]
在一些实施方案中，对疗法的应答性可以指以下任何一项或多项：延长生存期(包括总生存期和无进展生存期)；导致客观应答(包括完全应答或部分应答)；或改善癌症的迹象或症状。在一些实施方案中，应答性可指根据已公布的用于确定癌症患者中肿瘤状态的recist指南组的一个或多个因素的改善，即应答、稳定或进展。有关这些指南的更详细论述，参见eisenhauer等人(2009eur j cancer 45:228
‑
47),topalian等人(2012n engl j med 366:2443
‑
54),wolchok等人(2009clin can res 15:7412
‑
20)和therasse等人(2000j.natl.cancer inst.92:205
‑
16)。应答性受试者可以指其癌症(一种或多种)显示出改善的受试者，例如，根据基于recist标准的一个或多个因素。无应答性受试者可以指其癌症(一种或多种)没有显示出改善的受试者，例如，根据基于recist标准的一个或多个因素。
[0148]
常规的应答标准可能不足以描述本发明的治疗剂的抗肿瘤活性，它可能产生延迟性应答，这种应答可能出现在最初明显的放射学进展(包括出现新的病灶)之后。因此，已经制定了改进的应答标准，其考虑到可能出现的新病灶并允许在随后的评估中确认放射学进展。相应地，在一些实施方案中，应答性可以指根据免疫相关应答标准(irrc)的一个或多个因素的改善。参见，例如wolchok等人(2009,同上)。在一些实施方案中，将新的病灶添加到定义的肿瘤负荷中并在随后的评估中随访，例如针对放射学进展。在一些实施方案中，将非
靶病灶的存在包括在完全应答的评估中，但没有包括在放射学进展的评估中。在一些实施方案中，放射学进展可以仅基于可测量的疾病来确定和/或可以通过从首次记录之日起≥4周的连续评估来确认。
[0149]
在一些实施方案中，应答性可以包括免疫激活。在一些实施方案中，应答性可以包括治疗功效。在一些实施方案中，应答性可以包括免疫激活和治疗功效。3.生物标志物组
[0150]
可以将本发明的生物标志物用于预测性和/或预后性测试，以评估、确定和/或定性(本文可互换地使用)患者中疗法应答签名的状态，从而指导患者的治疗。短语“疗法应答签名的状态”包括高疗法应答签名(高rt)和低疗法应答签名(低rt)。根据此状态，可以指定进一步的程序，包括另外的测试或者治疗程序或方案。
[0151]
疗法应答签名组适当地包括eomes
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ac、eomes
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641k
‑
me和/或eomes
‑
373k
‑
me中的一种或多种。可以理解的是，任何一种或多种其它生物标志物也可以包括在该组中，例如，ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
‑
2、ki67、pd
‑
1和/或cd107a。
[0152]
测定法正确预测对疗法的应答的能力通常以测定法的敏感性、测定法的特异性或接受者操作特征("roc")的曲线下面积来衡量。敏感性是指真阳性被测试预测为阳性的百分比，而特异性是指真阴性被测试预测为阴性的百分比。roc曲线提供了作为1
‑
特异性函数的测试敏感性。roc曲线下面积越大，测试的预测价值就越大。测试效用的其它有用度量是正预测值和负预测值。正预测值是测试呈阳性的人实际为阳性的百分比。负预测值是测试呈阴性的人实际为阴性的百分比。
[0153]
在特定的实施方案中，本发明的生物标志物签名可以显示不同疗法应答状态中的统计学差异，至少为p<0.05、p<10
‑2、p<10
‑3、p<10
‑4或p<10
‑5。使用这些生物标志物的预测性或预后性测试可以显示roc为至少0.6、至少约0.7、至少约0.8或至少约0.9。
[0154]
在某些实施方案中，使用本文所述的方法测量患者样品中的生物标志物，并计算疗法应答签名的状态。在特定的实施方案中，然后可以将测量值与相关的预测或预后量、截留值或多变量模型评分进行比较，其将高疗法应答签名(高rt)状态与低疗法应答签名(低rt)状态区分开来。预测或预后量代表生物标志物(一种或多种)的测量量，根据高于或低于该量，将患者分类为具有特定的疗法应答签名的状态。如本领域所熟知的，通过调整测定中使用的特定预测或预后截留值(一个或多个)，可以根据技术人员的偏好提高测定法的敏感性或特异性。在特定的实施方案中，例如，可以通过测量来自具有不同疗法应答签名状态的患者的统计学上显著数量的样品中生物标志物的水平或量，并得出适合所需的特异性和敏感性水平的截留值，来确定特定的预测或预后截留值。
[0155]
而且，在某些实施方案中，对生物标志物组的生物标志物测量值进行数学组合，并将组合值与高或低的疗法应答签名的潜在预测或预后问题相关。可以通过本领域已知的任何适当的数学方法对生物标志物的值进行组合。用于将生物标志物组合与疾病状态相关联的众所周知的数学方法采用下列方法，例如判别分析(da)(例如，线性的、二次的、正则化da)、判别函数分析(dfa)、kernel方法(例如，svm)、多维标度(mds)、非参数方法(例如，k
‑
最近邻分类器)、pls(偏最小二乘法)、基于树的方法(例如，逻辑回归、cart、随机森林算法、boosting/bagging法)、广义线性模型(例如，逻辑回归)、基于主成分的方法(例如，simca)、广义加性模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。本领域技术人员在
选择适当的方法来评估本发明的生物标志物组合方面不会有问题。在一个实施方案中，在关联本发明的生物标志物组合中使用的方法选自da(例如，线性的、二次的、正则化判别分析)、dfa、kernel方法(例如，svm)、mds、非参数方法(例如，k
‑
最近邻分类器)、pls(偏最小二乘法)、基于树的方法(例如，逻辑回归、cart、随机森林算法、boosting法)或广义线性模型(例如，逻辑回归)和主成分分析。与这些统计学方法相关的详细信息，请参见以下参考文献：ruczinski等人,12j.of computational and graphical statistics 475
‑
511(2003)；friedman,j.h.,84j.of the american statistical association 165
‑
75(1989)；hastie,trevor,tibshirani,robert,friedman,jerome,the elements of statistical learning,springer series in statistics(2001)；breiman,l.,friedman,j.h.,olshen,r.a.,stone,c.j.classification and regression trees,california:wadsworth(1984)；breiman,l.,45machine learning 5
‑
32(2001)；pepe,m.s.,the statistical evaluation of medical tests for classification and prediction,oxford statistical science series,28(2003)；以及duda,r.o.,hart,p.e.,stork,d.g.,pattern classification,wiley interscience,第二版(2001)。4.产生用于定性疗法应答签名状态的分类算法
[0156]
在一些实施方案中，使用样品例如“已知样品”生成的数据可以用于随后“训练”分类模型。“已知样品”是已经预先分类的样品。用于形成分类模型的数据可以称为“训练数据集”。用于形成分类模型的训练数据集可以包括原始数据或预处理数据。一旦经过训练，分类模型就可以识别使用未知样品生成的数据中的模式。接着，分类模型可用于将未知样品分类成类别。例如，这在预测特定生物样品是否与特定生物状况相关时可能是有用的。
[0157]
可以使用任何合适的统计学分类或学习方法来形成分类模型，这些方法试图基于数据中存在的客观参数将数据体分离成类别。分类方法可以是有监督的也可以是无监督的。监督和无监督分类过程的示例描述于jain,“statistical pattern recognition:a review”,ieee transactions on pattern analysis and machine intelligence,第22卷,第1期,2000年1月，其教导通过引用方式并入本文。
[0158]
在监督分类中，含有已知类别示例的训练数据被提交给学习机制，该学习机制学习定义每个已知类别的一组或多组关系。然后可以将新数据应用到学习机制，该学习机制再使用所学到的关系对新数据进行分类。监督分类过程的示例包括线性回归过程(例如，多元线性回归(mlr)、偏最小二乘(pls)回归和主成分回归(pcr))、二元决策树(例如，递归分区过程，如cart)、人工神经网络例如反向传播网络、判别分析(例如，贝叶斯分类器或fischer分析)、逻辑分类器和支持向量分类器(支持向量机)。
[0159]
另一种监督分类方法是递归分区过程。递归分区过程使用递归分区树来对源自未知样品的数据进行分类。有关递归分区过程的更多详细信息在公布号为2002 0138208a1的美国专利申请中提供，发明人为paulse等人，名称为“method for analyzing mass spectra”。
[0160]
在其它实施方案中，所创建的分类模型可以使用无监督学习方法形成。无监督分类试图基于训练数据集中的相似性来学习分类，而不会对从中导出训练数据集的谱进行预分类。无监督学习方法包括聚类分析。聚类分析试图将数据划分为“簇”或组，理想情况下“簇”或组应该具有彼此非常相似的成员，并且与其它簇的成员完全不同。然后使用一些距
离度量来测量相似性，这些距离度量测量数据项之间的距离，并将彼此更接近的数据项聚集在一起。聚类技术包括macqueen的k均值算法和kohonen的自组织映射算法。
[0161]
公开为用于生物学信息分类的学习算法描述于，例如公布号为wo 01/31580的pct国际申请(barnhill等人,“methods and devices for identifying patterns in biological systems and methods of use thereof”)，公布号为2002/0193950的美国专利申请(gavin等人,“method or analyzing mass spectra”)，公布号为2003/0004402的美国专利申请(hitt等人,“process for discriminating between biological states based on hidden patterns from biological data”)，和公布号为2003/0055615的美国专利申请(zhang和zhang,“systems and methods for processing biological expression data”)。
[0162]
分类模型可以在任何合适的数字计算机上形成和使用。合适的数字计算机包括使用任何标准或专用操作系统的微型、小型或大型计算机，例如基于unix、或linux
tm
的操作系统。在采用质谱仪的实施方案中，所使用的数字计算机可以与用于创建感兴趣的图谱的质谱仪物理分离，或者其可以与质谱仪耦合。
[0163]
根据本发明的实施方案的训练数据集和分类模型可以由数字计算机执行或使用的计算机代码来实现。计算机代码可以存储在任何合适的计算机可读介质上，包括光盘或磁盘、记忆棒、磁带等，并且可以用任何合适的计算机编程语言编写，包括r、c、c
++
、visual basic等。
[0164]
上述学习算法对于开发已经发现的生物标志物的分类算法以及寻找新的生物标志物都是有用的。分类算法继而通过为单独或组合使用的生物标志物提供诊断值(例如截留点)来形成诊断测试的基础。
[0165]
在一些实施方案中，本文公开的任何分类方法可以至少部分地由一个或多个计算机执行，和/或可以存储在非瞬时性计算机介质上的数据库中。在一些实施方案中，本文公开的任何分类方法可以至少部分地体现或存储在其上具有计算机可执行指令的计算机可读介质上。在一些实施方案中，计算机可读介质包括任何非瞬时性和/或有形的计算机可读介质。5.抗体和细胞系
[0166]
本发明公开了使用与这些生物标志物特异性结合的抗原结合分子来定位、检测和定量疗法应答生物标志物，特别是对eomes
‑
641k
‑
ac、eomes
‑
641k
‑
me和/或eomes
‑
373k
‑
me的。这种抗原结合分子通常是分离的乙酰化或甲基化位点特异性抗原结合分子，仅当641k被乙酰化或甲基化时或当373k被甲基化时才与eomes特异性结合。使用本文提供的乙酰化和甲基化位点序列信息并如示例中所述，这种抗原结合分子可以通过标准抗体生产方法例如抗肽抗体方法来产生。例如，特异性结合eomes
‑
641k
‑
ac、eomes
‑
641k
‑
me或eomes
‑
373k
‑
me的抗体可以通过以肽抗原免疫动物来产生，该肽抗原包含以下氨基酸序列的全部或部分，所述氨基酸序列涵盖相应的乙酰化或甲基化残基(例如，包含seq id no:3、4或5中所示序列的肽抗原(其涵盖eomes中641位的乙酰化或甲基化赖氨酸(适当地，二甲基赖氨酸)和eomes中373位的甲基化赖氨酸(适当地，二甲基赖氨酸))，以产生一种仅在641位乙酰化或甲基化或者373位甲基化时才结合eomes的抗体。
[0167]
本发明的多克隆抗体可以根据标准技术产生，其通过按照标准程序，用对应于感
兴趣的蛋白质乙酰化或甲基化位点的肽抗原免疫适当的动物(例如，兔、山羊等)，从动物中收集免疫血清，并从免疫血清中分离出多克隆抗体。例如，如果期望仅在641k处乙酰化或甲基化时才结合eomes的抗体，则肽抗原包括赖氨酸的乙酰化或甲基化形式(例如，分别是k(ac)或k(me2))。相反，如果期望仅在641k处未乙酰化或甲基化时才结合eomes的抗体，则肽抗原包括非乙酰化和非甲基化的常规赖氨酸形式。
[0168]
适用于产生本发明抗体的肽抗原可以根据众所周知的技术来设计、构建和使用。参见，例如antibodies:a laboratory manual,第5章,第75
‑
76页,编者为harlow&lane,cold spring harbor laboratory(1988)；czernik,methods in enzymology,201:264
‑
283(1991)；merrifield,j.am.chem.soc.85:21
‑
49(1962)。
[0169]
本领域技术人员将理解，可以使用更长或更短的乙酰化肽或甲基化肽抗原。例如，肽抗原可以包含seq id no:3、4或5中任一项所示的氨基酸序列，或者其可以包含该序列侧翼的其他氨基酸，或者可以仅包含紧邻乙酰化或甲基化赖氨酸侧翼的所公开序列的一部分。通常，期望的肽抗原会包含侧接可乙酰化或可甲基化氨基酸的每侧的四个或更多个氨基酸并涵盖所述可乙酰化或可甲基化氨基酸。如本文所述产生的多克隆抗体可如下文进一步所述进行筛选。
[0170]
本发明的单克隆抗体可根据kohler和milstein的众所周知的技术在杂交瘤细胞系中产生。参见nature 265:495
‑
97(1975)；kohler和milstein,eur.j.immunol.6:511(1976)；另见，current protocols in molecular biology,编者为ausubel等人(1989)。如此产生的单克隆抗体具有高度的特异性，并提高了本发明提供的诊断性测定法的选择性和特异性。例如，可以将含有适当抗原的溶液注射到小鼠或其它物种中，然后在足够长的时间后(按照常规技术)，处死动物并获得脾细胞。然后，通常在聚乙二醇的存在下通过将脾细胞与骨髓瘤细胞融合使得脾细胞永生化，产生杂交瘤细胞。例如，兔融合杂交瘤可以如第5,675,063号美国专利，c.knight，1997年10月7日授权中所述产生。然后将杂交瘤细胞在合适的选择培养基中生长，如次黄嘌呤
‑
氨基蝶呤
‑
胸腺嘧啶核苷(hat)，并对上清液进行筛选以获得具有所需特异性的单克隆抗体，如下所述。分泌的抗体可以通过常规方法如沉淀、离子交换或亲和层析等从组织培养上清液中回收。
[0171]
单克隆fab片段也可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌中产生。参见，例如w.huse,science 246:1275
‑
81(1989)；mullinax等人,proc.nat'l acad.sci.87:8095(1990)。如果一种同种型的单克隆抗体对于特定的应用是优选的，那么可以通过从最初的融合选择来直接制备特定的同种型，或者通过使用sib选择技术来分离类别转换变体，从分泌不同同种型的单克隆抗体的亲本杂交瘤中二次制备(steplewski等人,proc.nat'l.acad.sci.,82:8653(1985)；spira等人,j.immunol.methods,74:307(1984))。
[0172]
本发明的乙酰化位点特异性抗体或甲基化位点特异性抗体的优选表位是基本上由约8至17个氨基酸组成的肽片段，包括可乙酰化或可甲基化的赖氨酸，其中约3至8个氨基酸位于可乙酰化赖氨酸的每一侧，因此本发明的抗体特异性结合包含这种表位序列的翻译后修饰的eomes多肽。由本发明抗体结合的特别优选的表位包含可乙酰化或可甲基化位点序列的全部或部分，包括可乙酰化或可甲基化的氨基酸。
[0173]
包括在本发明范围内的是等同的非抗体分子例如抗原结合片段，其以乙酰基或甲
基特异性方式结合到与本发明的乙酰基或甲基特异性抗原结合分子结合的基本相同的可乙酰化或可甲基化表位。参见，例如neuberger等人,nature 312:604(1984)。这种等同的非抗体试剂可适当地用于下文进一步描述的本发明的方法中。
[0174]
本发明所涵盖的抗原结合分子可以是任何类型的抗体，包括免疫球蛋白，包括igg、igm、iga、igd和ige，以及其抗原结合片段。抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以是任何物种来源，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马或人，或者可以是嵌合抗体。参见，例如m.walker等人,molec.immunol.26:403
‑
11(1989)；morrision等人,proc.nat'l.acad.sci.81:6851(1984)；neuberger等人,nature 312:604(1984)。抗体可以是根据第4,474,893号美国专利(reading)或第4,816,567号美国专利(cabilly等人)中公开的方法生产的重组单克隆抗体。抗体也可以通过根据第4,676,980号美国专利(segel等人)中公开的方法制备的特异性抗体进行化学构建。
[0175]
本发明还提供了产生本发明的抗体的永生化细胞系。例如，还提供了如上文所述构建的杂交瘤克隆，其产生针对本文公开的eomes乙酰化或甲基化位点的单克隆抗体。同样，本发明包括产生本发明抗体的重组细胞，该细胞可以通过众所周知的技术来构建；例如，可以通过pcr克隆单克隆抗体的抗原结合位点，并且产生单链抗体为噬菌体展示的重组抗体或大肠杆菌中的可溶性抗体(参见，例如antibody engineering protocols,1995,humana press,编者为sudhir paul)。
[0176]
本发明的乙酰化或甲基化位点特异性抗体，无论是多克隆的还是单克隆的，都可以根据标准技术筛选表位和乙酰基或甲基特异性。参见，例如czemik等人,methods in enzymology,201:264
‑
283(1991)。例如，抗体可以通过elisa针对乙酰基和非乙酰基肽库进行筛选，以确保对所需抗原的特异性以及仅对乙酰化或甲基化(或非乙酰化、非甲基化)形式的抗原的反应性。可以进行肽竞争测定以确认与给定的蛋白质乙酰化信号传导蛋白上的其它乙酰基表位缺乏反应性。抗体也可以通过western印迹针对含有信号传导蛋白的细胞制备物(例如过表达靶蛋白的细胞系)进行测试，以确认与期望的乙酰化表位/靶标的反应性。
[0177]
针对期望的乙酰化或甲基化表位的特异性也可以通过构建在已知要乙酰化的期望表位之外的位置缺少可乙酰化或可甲基化残基的突变体，或通过突变期望的乙酰化或甲基表位并确认缺乏反应性来检查。本发明的乙酰化或甲基化位点特异性抗原结合分子可能对非靶蛋白中的相关表位表现出一些有限的交叉反应性。这并不意外，因为大多数抗原结合分子都表现出一定程度的交叉反应性，并且抗肽抗体经常会和与免疫活性肽具有高度同源性的表位发生交叉反应。参见，例如czemik,同上。与非靶蛋白的交叉反应性很容易通过western印迹和已知分子量的标志物来表征。可以检查交叉反应蛋白的氨基酸序列以鉴定与eomes表位(本发明的抗原结合分子对其具有特异性)高度同源的位点。
[0178]
在某些情况下，多克隆抗血清可能对乙酰赖氨酸或甲基赖氨酸(适宜地，二甲基赖氨酸)本身表现出一些不期望的一般性交叉反应性，这可以通过进一步纯化抗血清，例如通过乙酰酪胺或甲基酪胺柱纯化而去除。本发明的抗原结合分子仅在641k或373k处乙酰化或甲基化时(或仅在未乙酰化和未甲基化时，视情况而定)特异性结合eomes，而不(基本上不)结合另一形式(与抗原结合分子所特异性的形式相比)。
[0179]
抗原结合分子可以使用正常和功能失调的(例如衰竭的)t细胞经由ihc或if进一
步表征，来检查eomes乙酰化或甲基化。ihc或if可以根据众所周知的技术来进行。参见，例如antibodies:a laboratory manual,第10章,编者为harlow&lane,cold spring harbor laboratory(1988)。例如，简言之，制备石蜡包埋组织(例如肿瘤组织)以用于免疫组织化学染色，其通过用二甲苯对组织切片进行脱蜡再用乙醇处理；先在水中后在pbs中进行水合；通过在柠檬酸钠缓冲液中加热载玻片以暴露抗原；在过氧化氢中孵育切片；在封闭液中进行封闭；在一抗和二抗中孵育载玻片；最后根据厂家说明书使用abc亲和素/生物素法进行检测。例如，可以基本上如下文实施例中所述来进行if。
[0180]
抗原结合分子可以通过按照标准方法进行的流式细胞术来进一步表征。参见chow等人,cytometry(communications in clinical cytometry)46:7205
‑
238(2001)。简单地举例来说，可采用以下方案进行细胞术分析：可以将样品在ficoll梯度上离心以去除红细胞，然后可以在37℃以2％多聚甲醛固定细胞10分钟，随后在冰上在90％甲醇中透化30分钟。然后可以用本发明的乙酰化或甲基化位点特异性的抗原结合分子一抗(例如，其检测eomes
‑
641k
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ac、eomes
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641k
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me或eomes
‑
373k
‑
me)对细胞染色，洗涤并用荧光标记的二抗进行标记。此时还可以加入其它的荧光染料缀合的生物标志物抗体(例如，ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
‑
2、ki67、pd
‑
1和/或cd107a)，以协助评估t细胞功能。接着，可以根据所用仪器的具体方案在流式细胞仪上对细胞进行分析。
[0181]
抗原结合分子可以有利地与荧光染料(例如，alexa fluor 488)缀合用于多参数分析。
[0182]
本发明的乙酰化或甲基化位点特异性抗原结合分子仅在641k处乙酰化或甲基化或者在373k处甲基化时与人eomes多肽特异性结合，但并不仅限于结合人类物种本身。本发明包括抗原结合分子，其除了结合人乙酰化或甲基化位点外，还结合来自其它物种(例如，小鼠、大鼠、猴、酵母)的相应eomes蛋白中的保守和高度同源或相同的乙酰化或甲基化位点。其它物种中高度同源或相同的保守位点可以通过标准序列比较很容易地鉴定，例如使用本文公开的人eomes乙酰化和甲基化位点使用blast鉴定。6.试剂盒
[0183]
本发明还扩展到试剂盒，其用于确定生物标志物包括本文公开的疗法应答生物标志物和其它生物标志物的表达，其包含允许检测和/或定量生物标志物的试剂。这种试剂包括，例如化合物或材料或化合物组或材料组，它们允许对生物标志物进行定量。在特定的实施方案中，化合物、材料或化合物组或材料组允许确定蛋白质的表达水平或基因的表达水平，包括但不限于抗原结合分子(例如抗体)、用于提取rna的材料、用于合成相应cdna的引物、用于扩增dna的引物、和/或能够与由基因编码的rna(或相应的cdna)特异性杂交的探针、taqman探针等。
[0184]
试剂盒还可以任选地包括用于检测标记的合适试剂、阳性和阴性对照、洗涤液、印迹膜、微滴定板、稀释缓冲液等。例如，基于蛋白质的检测试剂盒可包括(i)至少一种eomes多肽，其适当地选自eomes
‑
641k
‑
ac、eomes
‑
641k
‑
me和/或eomes
‑
373k
‑
me，或其包含641k
‑
ac、641k
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me或373k
‑
me的片段，以及未乙酰化或甲基化的eomes多肽(其可用作对照)，和(ii)一种或多种特异性结合eomes多肽(例如，eomes
‑
641k
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ac、eomes
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641k
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me和/或eomes
‑
373k
‑
me，和/或未乙酰化或甲基化的eomes多肽)的抗原结合分子。抗原结合分子经适当地可检测地标记。该试剂盒还可以具有多种装置(例如，一种或多种)和试剂(例如，一种或多
种)，用于进行本文所述的测定法中的一种；和/或印刷的说明材料，用于使用试剂盒来对t细胞功能生物标志物基因的表达进行定量。
[0185]
适于包装诊断性试剂盒组分的材料可以包括水晶玻璃、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸类、袋子等。此外，本发明的试剂盒可以包含说明材料，用于同时、顺次或分别使用试剂盒中含有的不同组分。说明材料可以是印刷材料的形式或者是能够存储指令的电子载体的形式使得它们能够被对象阅读，例如电子存储介质(磁盘、磁带等)、光学介质(cd
‑
rom、dvd)等。备选地或另外地，介质可以包含提供说明材料的互联网地址。7.患者分类和治疗管理
[0186]
本发明扩展至选择或鉴定哪些个体是将疗法(例如，细胞毒性疗法、免疫疗法等)用于治疗癌症的合适治疗候选者的方法。这类个体包括预测为对疗法有应答的患者，因此相对于具有不同特征(一种或多种)(例如，对疗法无应答性)的其他患者而言，从施用疗法中获益的可能性增加。在某些实施方案中，合适的候选者是有合理可能性从治疗中获益或至少有足够可能性获益以至于考虑到其风险和副作用而有理由施用治疗的候选者。本发明还包括选择或鉴定哪些个体不是将疗法(例如，细胞毒性疗法、免疫疗法等)用于治疗癌症的合适治疗候选者的方法。这类个体包括预测为对疗法无应答或有微弱应答的患者，因此相对于具有不同特征(一种或多种)(例如，对疗法有应答性)的其他患者而言，从施用该疗法中获益的可能性降低，或从这种治疗中获益的可能性较低或基本没有，使得可能期望使用不同或其它的治疗。在一些实施方案中，根据从受试者获取的样品中至少一种疗法应答生物标志物的测定来确定受试者是否是用疗法进行治疗的合适候选者。
[0187]
在一些方面，本文描述了确定需要癌症治疗的受试者对用疗法(例如，细胞毒性疗法、免疫疗法等)产生应答的可能性，和/或鉴定和/或选择接受这种治疗的受试者的方法，例如基于对至少一种疗法应答生物标志物的测定。在特定的实施方案中，疗法是一种免疫疗法，适当地使用抗免疫检查点抑制剂。短语“用免疫检查点抑制剂治疗”，也称为“免疫检查点抑制剂治疗”、“使用免疫检查点抑制剂的疗法”或“免疫检查点抑制剂疗法”，包括涉及以单一免疫检查点抑制剂治疗的实施方案和涉及以两种或多种免疫检查点抑制剂联合治疗的实施方案。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂治疗包括使用单一药剂或使用两种或多种分别的药剂来抑制两种或多种不同的免疫检查点通路。
[0188]
本发明还包括在选择或鉴定免疫功能受损或下降的个体以用刺激或增强免疫功能的疗法(例如，免疫疗法，如过继性免疫疗法)进行治疗的方法中，使用用于评估本文所述受试者的t细胞功能或免疫功能的方法。
[0189]
为了使本发明易于理解并付诸实施，现在将通过以下非限制性实施例来描述特定的优选实施方案。实施例实施例1eomes在t细胞中的表达
[0190]
为了量化来自iv期转移性黑色素瘤癌症的cd8
+
t细胞的功能性质，从根据recist 1.1(它基于肿瘤块的变化对疗法的应答分类；eisenhauer等人,eur j cancer.2009,45(2):228
‑
47)分层的黑色素瘤患者、转移性乳腺癌患者和健康个体中获取了液体活检，液体活检是量化血液中免疫细胞表型的重要工具。患者亚组包括划分为具有完全应答(cr)、部
分应答(pr)、病情稳定(sd)或病情进展(pd)的患者。简言之，在基线采血后的24个月内，每3个月从健康供体(hd)、转移性乳腺癌患者或黑色素瘤患者的液体活检中分离出cd8
+
t细胞。根据对免疫疗法治疗(使用帕博利珠单抗、纳武单抗和/或伊匹单抗的单一或双重疗法)的客观应答，将黑色素瘤患者进一步划分为完全应答(cr)、部分应答(pr)、病情稳定(sd)或病情进展(pd)。
[0191]
在刺激cd8
+
t细胞以促进效应标志物的表达之前或之后进行分析，并且通过高分辨率免疫荧光分析蛋白质表达。功能失调的/衰竭的cd8
+
t细胞不能表达效应蛋白(huang等人,2017,nature,545(7652),60
‑
65；wherry和kurachi 2015,nat rev immunol,15(8),486
‑
499；bengsch等人,2018,immunity,48(5),1029
‑
1045；catakovic等人,2017,cell commun signal,15(1),1；woroniecka等人,2018clin cancer res,24(17),4175
‑
4186)。本研究中对t细胞的分析表明，相对于cr和sd黑色素瘤队列，pd队列中ki67、tnf
‑
α和ifn
‑
γ的表达较低，刺激后未观察到效应(图1a)。
[0192]
接着，对源自上述被证明为功能失调的同一患者队列的cd8
+
t细胞进行了探查，以了解所提出的衰竭签名、pd
‑
1和eomes的表达。pd
‑
1被包括在内，因为它是功能失调的t细胞中显示的主要抑制性检查点。分析显示，源自黑色素瘤pd队列的cd8
+
t细胞比hd、cr、pr队列的cd8
+
t细胞具有显著且突出地更高的细胞核eomes表达(图1b)。
[0193]
由于eomes在衰竭的、功能失调的t细胞中的重要性，利用nls mapper和用于鉴定潜在的甲基化残基的在线工具，对eomes序列进行了检查以确定推定的细胞核定位信号。在c
‑
末端处的序列被鉴定为有很大可能介导细胞核定位(图1c)。该区域被鉴定为
635
vytsackrrrlsp
647
，并且根据物种特异性甲基化位点和乙酰化位点的工具预测，641位的赖氨酸(k)(641k)被鉴定为甲基化/去甲基化的潜在靶标和乙酰化的靶标(wen等人,2016,bioinformatics,32(20),3107
‑
3115)。许多研究已经证明了多种翻译后修饰对控制蛋白质
‑
靶标相互作用和定位的重要性。因此，据推测，eomes nls内这个赖氨酸的甲基化、去甲基化和乙酰化可能在调节其细胞核定位和动力学中是关键性的。
[0194]
为了理解eomes在641k处的翻译后修饰的重要性，制备了3个质粒构建体(图1d)。e
‑
wt，代表野生型eomes序列；e
‑
mut1，其中将641k突变为精氨酸(r)，从而模拟处于未甲基化、未乙酰化状态的赖氨酸；和e
‑
mut2，其中将641k突变为苯丙氨酸，从而模拟赖氨酸的高甲基化状态。由于e
‑
mut1不能被甲基化或乙酰化，该构建体被用来表明乙酰化和甲基化在核进入中的重要性(假设这种突变会改变核进入动力学)。e
‑
mut2中的突变应该使eomes多肽不能进行细胞核定位。
[0195]
观察到在641位可以去甲基化的功能性赖氨酸是eomes向细胞核的核转位所必需的，而在641k位eomes的高甲基化导致细胞核eomes的减少。具体而言，检查了以e
‑
wt、e
‑
mut1和e
‑
mut2转染jurkat细胞对eomes、tbet和pd
‑
1的影响，结果如图1e所示。高分辨率显微术发现，相对于e
‑
wt，以e
‑
mut1或e
‑
mut2转染的细胞中eomes的定位明显更偏向于细胞质，同时细胞核eomes显著降低，细胞核偏向也更低(如用细胞核相对于细胞质中的荧光比率表示:fn/c)(图1e)。与仅用载体的对照相比，以e
‑
mut1转染的细胞中eomes的表达略低但不显著，而与仅用载体的对照相比，eomes的fn/c仍偏向细胞质。在以e
‑
mut2转染的细胞中，平均nfi和eomes fn/c显著低于仅用载体的对照中观察到的结果。通过转染e
‑
wt，tbet表达略有增加，而转染e
‑
mut1或e
‑
mut2与仅用载体的对照和e
‑
wt相比诱导了细胞核tbet的更高
表达。以e
‑
wt转染pd
‑
1表达未受影响，而e
‑
mut1和e
‑
mut2转染两者均显著削弱pd
‑
1表达。
[0196]
这些数据表明，641k的构成性甲基化(以e
‑
mut2为代表)对细胞定位和蛋白质表达的影响不同于641k的非甲基化/非乙酰化(以e
‑
mut1为代表)。这可能是由于641k处的甲基化可能对eomes的蛋白质相互作用产生影响，从而导致不同的相互作用和对蛋白质表达产生不同的影响。这表明641k的去甲基化在影响eomes的细胞核靶向和蛋白质:蛋白质的相互作用方面的重要性。
[0197]
如上所述，在同一组转染的jurkat细胞中检查了转染e
‑
wt、e
‑
mut1和e
‑
mut2对ki67、ifn
‑
γ和tnf
‑
α表达的影响。高分辨率显微术分析显示，与仅用载体的对照或e
‑
wt相比，转染e
‑
wt显著削弱了ki67、ifn
‑
γ和tnf
‑
α的表达。相对于对照，转染e
‑
mut1诱导ki67和ifn
‑
γ但并非tnf
‑
α的表达显著升高，然而与e
‑
wt转染的细胞相比时，这些蛋白的表达均显著升高。转染e
‑
mut2对所有这三种蛋白的表达都有显著和强烈的影响，观察到的表达远高于以对照、e
‑
wt或e
‑
mut1转染的细胞(图1f)。
[0198]
这些数据表明，eomes的细胞核定位对于削弱效应标志物的表达是必需的，正如e
‑
wt削弱ki67、ifn
‑
γ和tnf
‑
α所示。然而，还发现高甲基化eomes能够诱导ki67、ifn
‑
γ和tnf
‑
α的强表达。这表明，eomes在关键残基上的不同翻译后修饰除了对定位有影响外，还可以诱导不同的蛋白质相互作用，这从e
‑
mut1和e
‑
mut2诱导的效应蛋白表达的差异就可以看出。因此可以得出结论，eomes中存在于641k处的特定翻译后修饰对于调节eomes的蛋白质靶标以及蛋白质:靶标相互作用和核定位是重要的。实施例2翻译后修饰的eomes的特异性抗体可以预测对疗法的应答性
[0199]
为了研究eomes多肽中641k翻译后修饰的作用，针对641k甲基化和641k乙酰化的eomes蛋白(即，eomes
‑
641k
‑
me和eomes
‑
641k
‑
ac)，生成了对nls基序特异性的兔多克隆抗体。图2示出了抗体的特异性。
[0200]
除了已鉴定的eomes nls，在eomes多肽中还鉴定了位于的eomes dna结合结构域，其中373位的中心赖氨酸(373k)对控制靶标结合特异性至关重要。根据转录因子t
‑
bet内的dna结合结构域的x射线结构，生成了eomes:dna复合物的同源模型，以便评估eomes和dna/染色质/启动子区域之间的潜在相互作用区域。在dna结合结构域内eomes和t
‑
bet之间的高度序列同一性(72％)提供了该模型中100％的置信水平，eomes和t
‑
bet的覆盖证实了这些区域的高度相似性。eomes中373位的赖氨酸在t
‑
bet(373k)中是保守的，后者被证明与dna上的磷酸根缔合。预测这个赖氨酸残基的甲基化会干扰dna结合(图3a)。还生成了针对含有该残基甲基化(即，eomes
‑
373k
‑
me)的eomes的兔多克隆抗体(图2和3b)。
[0201]
本发明人假定eomes
‑
641k的乙酰化在衰竭程度较高的cd8
+
t细胞样品中更为普遍。还预测在应答性更强的cd8
+
t细胞中eomes
‑
641k
‑
me的普遍性会更高，与eomes
‑
373k
‑
me一样。因此，在取自两个队列的黑色素瘤患者(在治疗开始后被分类为对免疫疗法有应答或对免疫疗法有抗性的那些患者)的基线福尔马林固定、石蜡包埋(ffpe)组织中检查了eomes
‑
641k
‑
me和eomes
‑
641k
‑
ac的概况。在治疗开始之前采集基线ffpe组织。通过高分辨率成像对蛋白表达的分析显示，两个队列的t细胞中都存在eomes
‑
641k
‑
me，但应答者队列中的水平显著高于抗性者队列。抗性者队列是唯一观察到显著强度的eomes
‑
641k
‑
ac的队
列，而应答者队列几乎没有观察到eomes
‑
641k
‑
ac(图3c；未显示代表性图像)。
[0202]
基线组织中eomes
‑
641k
‑
me和eomes
‑
641k
‑
ac的相对存在可能代表患者样品的基础衰竭特征，以及其是否有能力对单独的免疫疗法应答。如果eomes
‑
641k
‑
ac的普遍性很高，那么这表明仅靠免疫疗法是不够的，可能需要其它的治疗方式，例如靶向eomes
‑
641k
‑
ac翻译后修饰的表观遗传药物。
[0203]
然后通过高分辨率显微术对源自健康供体、对免疫疗法应答的患者和对免疫疗法抗性的患者的cd8
+
t细胞检查eomes
‑
641k
‑
ac的普遍性。分析显示，只有来自抗性、难治性患者的cd8
+
t细胞具有任何显著水平的eomes
‑
641k
‑
ac，并且这种eomes
‑
641k
‑
ac也主要偏向于细胞核定位(图3d；未显示代表性图像)。
[0204]
还通过高分辨率显微术对源自健康供体、对免疫疗法应答的患者或对免疫疗法抗性的患者的cd8
+
t细胞分析eomes
‑
641k
‑
me概况。分析显示，来自应答性队列的cd8
+
t细胞中的eomes
‑
641k
‑
me水平显著高于抗性、难治性患者队列或健康供体队列。在所有三个队列中，eomes
‑
641k
‑
me主要偏向于细胞质定位，仅在源自应答者的cd8
+
t细胞中检测到显著的eomes
‑
641k
‑
me核表达(图3e；未显示代表性图像)。
[0205]
来自同一患者队列的cd8
+
t细胞中的eomes
‑
373k
‑
me普遍性也通过高分辨率显微术进行评估。分析显示，来自应答性队列的cd8
+
t细胞中的eomes
‑
373k
‑
me水平显著高于抗性、难治性患者队列，并且在更低的程度上也高于健康供体队列。还发现仅在应答者队列中，eomes
‑
373k
‑
me主要偏向于细胞核定位(图3f；未显示代表性图像)。
[0206]
对源自三阴性乳腺癌(tnbc)患者的cd8
+
t细胞中的eomes
‑
641k
‑
me和eomes
‑
641k
‑
ac的分析显示，这些细胞也具有与来自抗性黑色素瘤患者的cd8
+
t细胞相匹配的eomes签名，这表明来自tnbc患者的这些t细胞也衰竭了(图3g；未显示代表性图像)。值得注意的是，tnbc对免疫疗法的应答不佳。
[0207]
总之，eomes
‑
641k
‑
ac与对免疫疗法无应答的患者相关，因此可以预测或将患者分类为免疫疗法无应答者。相反，eomes
‑
641k
‑
me和eomes
‑
373k
‑
me与对免疫疗法有应答的患者相关，因此可以预测或将患者分类为免疫疗法应答者。
[0208]
数据表明，eomes的细胞核定位对于衰竭表型是重要的，使其在641和373位保持乙酰化形式和去甲基化。对于效应器功能，一种在健康t细胞中可见的状态是，eomes经甲基化并在细胞质中表达，尽管也存在于细胞核内。
[0209]
该数据也表明了eomes的新作用。根据在641k和373k处存在的特定翻译后修饰，该因子可以具有积极和消极的功能。eomes的细胞核定位也受到641k处翻译后修饰的影响，eomes
‑
641k
‑
me在来自对疗法有抗性的患者的cd8
+
t细胞中完全在细胞质中，但在来自对疗法应答的患者的细胞中还定位于细胞核。实施例3来自患有转移性脑癌的患者的cd8
+
t细胞中的eomes定位
[0210]
通过自动化asi mif系统检查来自转移性脑癌患者的转移性脑病灶的ffpe组织，目标是表达eomes
‑
641k
‑
ac或eomes
‑
641k
‑
me的浸润性cd8
+
t细胞。有意思的是，分析发现肿瘤病灶内表达eomes
‑
641k
‑
ac的cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞群的大约60％，而表达eomes
‑
641k
‑
me的cd8
+
t细胞仅占cd8
+
t细胞群的不到18％。此外，病灶内cd8
+
t细胞中，eomes
‑
641k
‑
ac的表达强度显著高于eomes
‑
641k
‑
me的表达强度。这表明在脑转移事件中，癌转移病灶内cd8
+
t细胞中eomes
‑
641k
‑
ac上调，其表示衰竭的cd8
+
t细胞签名。(图4；未显示代表性图像)。实施例4材料和方法分离cd8
+
t细胞
[0211]
使用rosettesep
tm
方法对转移性黑色素瘤活检进行预富集以分离cd8
+
t细胞。将rosettesep
tm
人cd8富集试剂盒(15063,stemcell technologies)用于分离cd8
+
t细胞并去除红细胞，以sepmate
tm
‑
50(ivd)密度梯度管(85450,stemcell technologies)和lymphoprep
tm
密度梯度介质(07861,stemcell technologies)进行密度梯度离心。免疫荧光显微术
[0212]
将分离的cd8
+
t细胞或jurkat细胞离心到以多聚l
‑
赖氨酸预处理的盖玻片上并固定，然后保存在pbs中用于染色。通过与1％triton x
‑
100孵育20分钟来透化细胞，并用相关抗体(包括抗cd8、抗tnf、抗ifn
‑
γ、抗ki67、抗pd1、抗eomes、抗tbet和抗细胞角蛋白抗体)来探测细胞。还使用了定制的多克隆兔抗eomes
‑
641k
‑
ac、抗eomes
‑
641k
‑
me和抗eomes
‑
373k
‑
me。使用与alexa fluor 488(抗兔)、568(抗小鼠)或647(抗大鼠)缀合的二抗来对一抗进行显现。
[0213]
使用bond rx对来自转移病灶肿瘤活检的ffpe样品进行处理用于opal染色(perkin
‑
elmer)，其使用仪器方案：使用表位修复液1(epitope retrieval solution 1，基于edta的ph 6.0的修复液)，在100℃执行er2 20分钟，接着以兔抗eomes
‑
641k
‑
ac或抗eomes
‑
641k
‑
me以及小鼠宿主cd8进行探测，并以opal试剂盒520、570和690进行显现。
[0214]
使用prolong diamond antifade试剂(life technologies)将盖玻片嵌放在显微镜载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微术定位蛋白质靶标。使用leica dmi8显微镜，使用100x油浸镜头，运行lax软件，获单个0.5μm区域。最终图像是通过对同一区域的四个连续图像进行平均而获得的。使用imagej软件(imagej,nih,bethesda,md,usa)分析数字图像，以确定总荧光强度(tfi)，细胞核荧光强度(nfi)，细胞质荧光强度(cfi)。曼
‑
惠特尼(mann
–
whitney)非参数检验(graphpad prism,graphpad software,san diego,ca)用于确定数据集之间的显著差异。eomes抗体的产生
[0215]
针对以下肽产生抗体：eomes nls：vtysckrrrlsp(seq id no:2)；eomes
‑
641k
‑
ac:vtysck(ac)rrrlsp(seq id no:3)；eomes
‑
641k
‑
me:vtysck(me)rrrlsp(seq id no:4)；和eomes
‑
373k
‑
me:rquisfgklk(me)ltnnkgann(seq id no:5)。由于短肽本身通常不具有免疫原性，因此经常需要将其与免疫原性载体蛋白偶联。为了促进这种偶联，在上述肽序列的c
‑
末端掺入半胱氨酸，并反应使肽与免疫原性载体蛋白即匙孔血蓝蛋白(klh)缀合。产生抗二甲基化或抗乙酰化肽抗体不需要特殊的免疫方案。每个肽序列使用2或4只兔子间隔几周免疫。第一次免疫是用含完全弗氏佐剂的肽缀合物的乳剂，第二次使用不完全弗氏佐剂。几周后获得了有效的抗肽血清(参见palfreyman等人(1984)j immunol meth,75:383)。
[0216]
使用酶联免疫吸附测定法(elisa)进行二甲基化和乙酰化肽抗血清的测试，其中在用非翻译后修饰肽、二甲基化肽或乙酰化肽包被的微滴定板上滴定血清。
[0217]
按照制造商说明书，通过使用现有的半胱氨酸残基将未修饰肽偶联至凝胶sulfo link coupling树脂(thermo scientific,产品编号20401)，来进行抗体增强。将所得凝胶
与抗血清的等分试样一起孵育以吸附特异于未修饰肽的抗体。所得抗血清对二甲基化多肽或乙酰化多肽序列的特异性增强。
[0218]
为了产生仅对二甲基化或乙酰化肽有特异性的亲和纯化的抗体，首先进行增强程序以从血清中除去对未修饰肽特异性的抗体。通过elisa测试亲和纯化抗体的特异性。如图2所示，所产生的抗体对各种形式的肽显示出高度特异性。asi系统方法(高通量，高分辨率显微术)
[0219]
asi的mif系统是用于多重免疫荧光样品的通用扫描和分析系统。其设计为扫描用dapi染色和多达6种抗体染色的载玻片，去除自发荧光，解决滤光片之间的不混合，并对获得的数据进行基于细胞的分析。自动分割接触的细胞，定量测量信号表达，并显示每个细胞和整个扫描区域的结果。支持多种自动和半自动扫描模式，包括：1.对悬浮样品进行有效的基于密度的扫描—基于细胞群扫描样品以获得最快的细胞评分；2.扫描选定的区域/范围；以及3.交互式扫描感兴趣的特定位置。
[0220]
在所有模式下，可以在几分钟内导出成千上万个具有抗体共定位的细胞的综合统计数据。3d层叠、自动曝光、自动对焦和其它成像参数是每次扫描的固有部分。图像用于确定平均细胞核荧光强度(nfi)或总体荧光强度(fi)。使用自动平台和asi软件(用于自动选择细胞和测量荧光强度)，在定义的区域内计数细胞总数。随后，将所得数据用于计算ctc群动态，表示为总细胞群的％。
[0221]
本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用方式全文并入。
[0222]
本文引用的任何参考文献不应被解释为承认这种参考文献可作为本技术的“现有技术”使用。
[0223]
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域的技术人员会理解，根据本公开可以对列举的特定实施方案进行各种修改和改变，而不脱离本发明的范围。所有这些修改和改变都意图包括在所附权利要求的范围内。