用于测量血液样品中纤维蛋白原浓度的方法和装置与流程

1.本发明涉及诊断方法和相关设备，并且更具体地涉及能够测量血液样品中纤维蛋白原浓度的诊断方法。更具体的，本发明还涉及使用装置来测试血液样品中纤维蛋白原浓度的视觉比色方法，所述装置具有能够确定样品中纤维蛋白原浓度的指示器。本发明还涉及一种使用提供给装置(如指示器条)的纤维蛋白原和凝血酶溶液并观察染色的流体洗脱来测试血液样品的方法。本发明还涉及用于测定血液样品中纤维蛋白原浓度的方法，该方法使用加载纤维蛋白原和凝血酶溶液的纤维素纤维指示器条，并将染料液滴施加到条上来观察洗脱的纵向范围。


背景技术：

2.纤维蛋白原是血液凝块形成所必需的蛋白质(凝血因子)。纤维蛋白原由肝脏产生并与几种其他凝血因子蛋白一起释放到循环中。通常，当身体组织或血管壁损伤时，一种称为止血的过程开始通过在损伤部位形成栓塞来阻止出血。称为血小板的小细胞片段粘附并聚集在该部位，并且凝血因子一个接一个地被激活，最终形成凝块。
3.纤维蛋白原是这些凝血因子之一。可以测量其浓度以确定患者在切割或冲击损伤的情况下凝血的能力。发生凝血时，纤维蛋白原转化成不溶性纤维蛋白线，其交联在一起形成在损伤部位稳定的纤维蛋白网。纤维蛋白网与血小板一起粘附在损伤部位以形成稳定的血液凝块。为了形成稳定的凝块，必须有足够的正常功能的血小板和凝血因子。如果存在功能障碍的因子或血小板，或者它们太少或太多，这可能导致出血发作和/或形成不当的血液凝块
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称为血栓。因此，确定患者的凝血能力、特别是纤维蛋白原浓度是很重要的。
4.目前存在许多可用于评价血液中纤维蛋白原浓度和评价止血的试验。一种这样的测试是纤维蛋白原活性测试，其评估纤维蛋白原在帮助形成血液凝块方面的功能有多好。称为纤维蛋白原抗原测试的第二种测试测量血液中的纤维蛋白原含量。测试旨在(但不一定)反映体内止血。实验室测试可能不反映体内行为，但其目的是指示(如果不是模拟)纤维蛋白原浓度，并且其对于评估止血的特定组分也是有用的。
5.已知的纤维蛋白原活性测试评价了其中可溶性血纤蛋白原转化成纤维蛋白线的部分止血过程。在向测试样品中加入凝血酶的情况下，纤维蛋白原测试聚焦于纤维蛋白原的功能，并测量向血浆中加入标准量的凝血酶后形成纤维蛋白凝块所花费的时间。凝块形成所需的时间与存在的活性纤维蛋白原的含量直接相关。该测试评估纤维蛋白原的功能，其转化成纤维蛋白的能力。已知延长的凝块形成时间可能是由于正常的纤维蛋白原的浓度降低或由于功能失调的纤维蛋白原引起的。
6.另一种已知的测试方法是纤维蛋白原抗原测试，其使用纤维蛋白原抗体结合血液样品中的纤维蛋白原。该测试测量的是纤维蛋白原的量而不是活性。纤维蛋白原的浓度随着引起急性组织炎症或损伤的状况而急剧升高。可以使用血液样品进行这些急性期反应物(包括纤维蛋白原)的测试，以确定体内炎症的程度。
7.包括在现有技术中的是美国申请no.20120107851a1中的公开内容，其通过引用并
入本文中。这个公开教导了一种由“接收样品流”和涂覆有凝血酶的“流动路径区”组成的装置。将血浆加入接收样品流中，并经由毛细管作用通过流动路径区行进，在那里凝结并改变流速。在设定的时间段之后，血浆停止移动，并且沿流动路径区向上的距离提供了纤维蛋白原浓度的指示。这种布置通过确定血浆在凝固时移动通过装置有多远来起作用，主要依赖于微柱挤出。该布置采用由塑料、硅或玻璃中的一种制成的基底，但没有教导纤维素纤维(纸或纸板)的任何使用。
8.例如，在现有技术中，使用塑料诊断装置，其不具有促进流体流动的固有毛细管作用。因此，由于塑料诊断装置没有毛细管作用来促进流体流动，因此必须通过包含微柱来人工诱导流体流动。此外，塑料诊断必须涂覆有siox并用聚电解质处理，以增加流动路径区的亲水性。
9.由于这种测试主要测量凝块形成时间，因此它对凝血酶动力学的变化易感。凝块形成时间越短，纤维蛋白原浓度越高。凝块形成时间越长，纤维蛋白原浓度越低。因此，具有凝血酶激活剂水平的血浆样品可能使血浆样品过早凝结并给出高纤维蛋白原浓度读数。同样，高浓度的抑制剂(如肝素或华法林)可能延迟凝血并错误地给出低纤维蛋白原水平读数。后者在西方医学中尤其是一个问题，其中这种抑制剂用作治疗心脏病发作的药物。
10.这个公开文件没有教导或暗示这样一种布置，其中将血浆加入凝血酶中以反应一段时间以及将水加入染料或颜料中后，着色溶液或染料在毛细管作用下移动通过凝结的血浆一段距离。现有技术没有教导其中水通过凝结的血浆芯吸染料的方法。也没有教导具有涂覆有凝血酶的一部分和涂覆有染料的另一部分的测试装置。
11.在以下出版物中公开了用于测量纤维蛋白原浓度的另一种装置：
12.dudek,m.m.，lindahl,t.l.和killard,a.j.，“developing a point of care lateral flow device for measuring human plasma fibringen”，analy.chem.，vol 82，5，第2029-2035页，3月1日(2010)。
13.这个出版物教导了使用热塑性树脂作为基底来测量纤维蛋白原浓度的侧流测定法。如us20120107851a1中所述的，所述测试包括接收样品流以及由热塑性树脂制成的流动路径区。流动路径区通过微柱的存在诱导毛细管作用。该测试在流动路径区中预固定250-1000mu的凝血酶，并将在37℃下预热的15μl血浆加入接收样品流中。血浆通过流动路径区迁移，在那凝固。当血浆移动停止时，测试停止。血浆沿流动路径区向上移动的距离与纤维蛋白原浓度相关，其中较高的浓度导致较低的迁移。对于》4g/l纤维蛋白原，该测试测量为0-11mm，对于2-4g/l纤维蛋白原，该测试测量为12-20mm，对于1-2g/l纤维蛋白原，该测试测量为21-27mm。该装置的长度不超过27mm。该机制似乎与凝血时间有关(与clauss测定一样)。较低浓度的纤维蛋白原溶液将花更长的时间来形成凝块，其最终停止血浆运动。这使得血浆在停止之前沿流动路径区进一步向上行进。
14.所述依赖于凝块形成时间的测试方法采用微结构化的热塑性塑料作为基底，并测量低(1-2g/l)、中(2-4g/l)和高(》4g/l)纤维蛋白原以覆盖出血和心血管疾病风险。此外，现有技术方法以mm增量分离了1-2g/l纤维蛋白原。
15.一直需要不断地寻求已知测试方案的改进和有用的替代方案，以提高测试速度、便利性和效率。还需要提供已知方法的替代方案并克服其缺点或至少改善已知方法的缺点，以提高血清学测试的效率和速度。


技术实现要素：

16.本发明提供了一种诊断方法，其能够使用视觉指示器测量血液样品中的纤维蛋白原浓度。更具体的，本发明提供了一种使用能够确定样品中的纤维蛋白原浓度的指示器来测试血液样品中的纤维蛋白原浓度的视觉比色方法。本发明还提供了一种使用向指示器条提供的凝血酶溶液并观察染色的流体洗脱来测试血液样品的方法。更具体的，本发明提供了一种用于测定血液样品中纤维蛋白原浓度的方法，该方法使用载有凝血酶溶液的纤维素纤维指示器条，并将染料施加到条上以观察芯吸(wicking)/洗脱的纵向范围。
17.对于装置方面，本发明提供了一种手持诊断指示器，其可以包括条或板，其能够利用由纤维蛋白原转化成纤维蛋白引起的疏水性的增加来视觉测量人血液样品中的纤维蛋白原浓度。对于方法方面，在第一步中，将允许发生血栓形成的纤维蛋白原和凝血酶的溶液添加到纸条上。之后，将水性染料沉积在条上，使得发生芯吸/洗脱，从而能够视觉指示溶液的纤维蛋白原浓度，其与染色的流体沿每个条向上(up each strip)芯吸(wick)/洗脱的距离相关。
18.视觉测试能够从芯吸的长度确定纤维蛋白原的浓度。染料用于提高溶液芯吸的可视性。优选，板或条由纸(纤维素纤维)构成。疏水性的增加是显著的，并取决于纤维蛋白原的浓度。如果洗脱小，则纤维蛋白原浓度高，而如果洗脱距离大(疏水性较低)，则浓度小或非常低。根据一个实施方案，指示器是具有预定长度和宽度的纸条。芯吸和毛细管流动由亲水性多孔和纤维介质和膜引起。
19.影响测试方法和结果的参数包括：纸或多孔介质的类型(包括润湿性和孔径分布)、条宽、加入的血液样品的体积、使用的凝血酶和fxiiia各自的浓度以及反应和洗脱时间。还有3个其他方面也具有主要影响：
20.1.在纸条上添加血液样品/凝血酶的位置(即，最好将样品/凝血酶进一步添加到流动接收区中)。
21.2.流动接收区的宽度(越宽越好)。
22.3.添加到条中的染料的体积(越多越好)。
23.另外，允许并定量非特异性血液蛋白对模拟血浆样条件的测试的影响。在整个说明书中，对洗脱的提及可以被认为包括对以下现象的提及，所述现象包括吸收、毛细管作用。洗脱的目的是引起抗体分子从红细胞膜释放。一旦在溶液中游离，就针对试剂红细胞测试洗脱的抗体，以确定是否存在免疫抗体特异性。洗脱是从红细胞表面去除抗体的过程。在整个说明书中，对血浆样品的提及可以认为包括对血液样品的提及，并且对血液样品的提及可以认为包括对血浆样品的提及。此外，本说明书中对洗脱的提及可以认为包括对芯吸的提及，并且对芯吸的提及可以认为包括对洗脱的提及。对试剂盒的提及可以认为包括对测试装置和任何相关联的附件的提及，或者简单地包括对测试装置的提及。对凝血的提及可以认为包括对凝固的提及。
24.在一种广义形式中，本发明包括：
25.一次性诊断装置，其能够测量血液样品中的纤维蛋白原浓度，该装置包括可润湿多孔测试基底和允许确定测试状态的观察指示器；所述基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；所述反应区预先加载凝血酶和指示染料或凝血酶和纤维蛋白原溶液和染料；其中当用于测试的样品沉积在所述流动接收区或所述反应
区中时，所述基底中的孔隙推动所述流体沿着所述基底一段距离，沿着所述基底行进的距离提供所述受测血液样品中纤维蛋白原浓度的测量。
26.根据一个实施方案，所述装置包括壳体，所述壳体包括观察窗，所述观察窗沿着所述流动路径区向用户指示纤维蛋白原浓度。
27.在另一种广义的形式中，本发明包括：
28.一次性诊断条，其能够测量施加到所述条上的血浆样品中的纤维蛋白原浓度，所述条包括：可润湿多孔测试基底，所述基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；反应区预先加载凝血酶和指示染料；其中当待测试的样品流体沉积在所述接收区或反应区中时，所述样品与所述凝血酶反应，从而诱导凝血；所述样品在沉积时产生疏水区；由此添加到染料中的水在流动路径区中沿着一定距离行进；沿着所述基底行进的距离提供所述受测血液样品中纤维蛋白原浓度的测量。
29.在另一种广义形式中，本发明包括：
30.一次性诊断指示器装置，其能够测量施加到所述装置上的血浆样品中的纤维蛋白原浓度，所述指示器包括：可润湿多孔测试基底，所述多孔测试基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；基底的反应区预先加载凝血酶和指示染料；其中当所述样品沉积在所述流动接收区或所述反应区中时，产生疏水区；并且其中当水与所述染料混合时，所述染料沿着流动路径区前进；还沿着所述基底推动所述样品一段距离，指示染料沿着所述基底行进的距离提供所述受试血液样品中纤维蛋白原浓度的测量。
31.在另一种广义形式中，本发明包括：
32.一种装置，所述装置能够通过测量在所述样品凝固开始后在所述装置中产生的疏水性来诊断血液样品的纤维蛋白原浓度；
33.所述装置包括：多孔测试基底，所述基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；反应区包括预先施加到基底的生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物。
34.在其最广泛的形式中，本发明包括：
35.一种能够测量血液样品中纤维蛋白原浓度的诊断装置，所述装置包括：可润湿测试基底，所述可润湿测试基底包括允许确定测试状态的观察指示器；所述基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；反应区预先加载至少一种试剂；其中，当待测试的血液样品沉积在所述流动接收区或所述反应区附近或之中时，与所述试剂反应，诱导样品凝固；添加到所述反应区中的染料沿着所述基底前进一段距离；染料沿着所述基底行进并穿过样品的距离提供了所述受试血液样品中纤维蛋白原浓度的测量。
36.根据优选的实施方案，多孔基底由纤维素纤维(纸)制造。根据优选的实施方案，反应区预先加载凝血酶和指示染料；其中当样品流体沉积在所述流动接收区中时，所述基底中的孔隙在毛细管作用下沿所述基底推动所述流体一段距离。与水混合的染料在流动路径区中沿着基底前进，其中与染料相关的行进距离提供了指示，从该指示可以确定所述受试血液样品中的纤维蛋白原浓度。
37.根据一个实施方案，可润湿多孔基底用物理因子和/或化学因子或生物因子改性，其将或可以增加或降低基底疏水性。在一个实施方案中，基底的化学因子修饰包括涂覆基
底。根据一个实施方案，将血浆施加在反应区外的多孔基底上。或者，将血液或血浆施加到反应区以在引发凝块形成后形成疏水区。
38.测量疏水性是指测量疏水区的疏水性。
39.所用的上述生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物牵涉凝块形成的启动、执行、扩大和/或加速。或者，所用的生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物牵涉凝块疏水性的增强或减弱。所用的生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物可以在反应区外施加和/或预先施加。所用的上述物理因子将或可以允许或防止凝块形成的开始。所用的物理因子可以增强或减弱凝块的疏水性。或者，所用的物理因子将或可能增加或减少凝块形成的执行、扩大和/或加速。
40.在另一种广义形式中，本发明包括：
41.一种在离心机中使用至少一个毛细管诊断血液或血浆样品中纤维蛋白原浓度的方法，所述至少一个毛细管各自包括施加和/或预先施加在所述至少一个毛细管内部的生物因子、化学因子和/或所述生物因子和/或化学因子的衍生物的反应混合物，所述方法包括将血液或血浆施加到所述反应混合物中以形成凝块并在样品开始凝固后测量凝固程度的步骤。测量凝固程度是指定量毛细管中凝块的质量、体积或高度。将指示染料与水混合并沿着流动路径前进，前进的距离确定血液样品中的纤维蛋白原浓度。
42.在根据方法方面的另一广义形式中，本发明包括：使用多孔基底测定测试样品中纤维蛋白原浓度的测试方法；所述基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；所述方法包括以下步骤：
43.a)在反应区中用凝血酶显色物质和指示染料预加载所述多孔基底；
44.b)将血浆/血液样品加入所述反应区中；
45.c)使血浆/血液与凝血酶反应并进行凝固；
46.d)使所述血浆形成疏水区，
47.e)向染料中加入水并使染料沿基底前进一定距离；
48.f)测量所述距离以确定所述血浆样品的纤维蛋白原浓度。
49.优选，定量疏水区/疏水性的方法包括在侧流装置中测量由至少一种显色标记物通过或离开疏水区的行进距离。
50.在方法方面的其它广义形式中，本发明包括：一种使用诊断装置测试血液样品中纤维蛋白原浓度的方法，所述诊断装置能够测量血液样品中纤维蛋白原浓度，所述装置包括；可润湿测试基底和壳体，所述壳体包括允许确定测试状态的观察指示器；所述基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；预加载有试剂的反应区；
51.所述方法包括以下步骤：
52.a)使所述多孔基底预先加载凝血酶显色底物和染料/缓冲溶液，以在反应区中提供反应混合物；
53.b)在所述接收区附近或之中或在所述反应区附近或之中添加血液或血浆样品，使得彼此结合；
54.c)使血浆与反应混合物中的凝血酶反应以形成疏水区；
55.d)使用基底中的孔隙来沿着基底并通过反应区输送染料/缓冲溶液，
56.e)观察染料/缓冲溶液沿着多孔基底通过的距离；
57.f)参照染料/缓冲溶液沿着流动路径区行进的所述距离来确定所述样品中的纤维蛋白原浓度；
58.g)允许血液或血浆样本形成凝块，并通过测量凝块的质量或体积或高度来测量样品开始凝固后的凝固程度。
59.在方法方面的另一种广义形式中，本发明包括：
60.一种使用多孔基底确定测试样品中纤维蛋白原浓度的测试方法；所述基底具有第一端和第二端以及在它们之间的流动接收区、流动路径区和反应区；所述方法包括以下步骤：
61.h)所述多孔基底预先加载凝血酶显色底物，以提供反应区和指示染料；
62.i)将血浆样品加入所述反应区中；
63.j)使血浆与凝血酶反应凝固并形成疏水区；
64.k)洗涤反应区中的染料/缓冲溶液；
65.l)观察染料/缓冲溶液沿流动路径区行进的距离和颜色变化；
66.m)参考所述距离和/或所述颜色变化来确定所述样品中的纤维蛋白原浓度。
67.在与沉积在接收表面上的凝血酶和/或fxiiia酶促反应时，通过血液样品中的纤维蛋白原聚合成纤维蛋白来引起疏水性。根据一个实施方案，诊断依赖于在与沉积在接收区中的凝血酶和/或fxiiia酶促反应时由血液样品中的纤维蛋白原聚合成纤维蛋白引起的疏水性的显著变化。定量疏水区表面疏水性的方法包括测量无孔基底表面顶部上任何沉积的液滴的形状、高度和/或接触角。根据一个实施方案，毛细管作用将血液样品分配到用凝血酶处理的接收区中，并且洗涤溶液通过接收区输送以将沉积在接收区中的染料从多孔材料中去除。洗涤后的颜色强度用于测量和可视化该区域的疏水性。因此，颜色强度与血液样品中的纤维蛋白原浓度相关。
68.根据方法方面的可选实施方案，可以使用以下组合的三种机制进行纤维蛋白原浓度的诊断。第一种机制是在与沉积在接收区上的凝血酶和/或fxiiia酶促反应时，由血液样品中的纤维蛋白原聚合成纤维蛋白引起的染料粘附性的变化。第二种机制是沉积在接收区中的染料直接(或通过染料粘合剂的辅助间接)粘附到纤维蛋白上。第三种机制是毛细管作用，其用于：1)将血液样品分配到用凝血酶处理过的接收区中，和2)将洗涤溶液通过接收表面输送以将染料从多孔材料中除去。洗涤后的颜色强度用于测量和可视化保留在该区域中的粘附纤维蛋白的染料的量。因此，颜色强度与血液样品中的纤维蛋白原浓度相关。
69.根据优选实施方案，所述指示器或所述条包括纤维素纤维或其它合适的多孔和可润湿材料。优选，血液样品沉积在指示装置的反应区中，并且允许与预加载的凝血酶反应。指示器优选预先加载了凝血酶和/或fxiiia或类似物。指示器预先加载了染料/缓冲溶液到反应区或不同的接收区。或者，在引入血液/血浆样品期间或之后添加染料。指示性染料或溶液可以含有缓冲剂。染料允许添加到流动接收区的流体行进的距离的可视化指示，该距离由疏水区决定，疏水区又由血浆样品和凝血酶之间的反应决定。由此获得基于测量的距离的纤维蛋白原浓度的诊断结果。
70.优选，所述反应区中的所述染料充当可视化指示器并且颜色为蓝色。优选，所述凝血酶是冻干的。优选，所述反应区在所述流动路径区中。血浆通过毛细管作用沿着基底前
进。
71.结果表明，反应区(和最终的疏水区)更好地分布在流动路径区和流动接收区。
72.本发明的这些和其它目的以及表征本发明的新颖性的各种特征在所附权利要求中特别指出，并形成本公开的一部分。为了更好地理解本发明、其操作优点和通过其使用获得的特定目的，应该参考附图和描述性内容，其中示出了本发明的各种内容，包括优选实施方案。
73.本发明提供了已知现有技术的可选方案和所确定的缺点。前述和其他目的和优点将从下面的描述中显现。在说明书中，参考了形成说明书的一部分的附图，并且其中通过说明的方式示出了可以实施本发明的具体实施方案。将足够详细地描述这些实施方案以使本领域技术人员能够实践本发明，并且应当理解，可以利用其他实施方案，并且可以在不脱离本发明的范围的情况下进行结构改变。在附图中，相同的附图标记在几个视图中表示相同或相似的部分。因此，以下详述不应被认为是限制性的，并且本发明的范围由所附权利要求书最佳地限定。
附图说明
74.考虑下面的详述时，将更好地理解本发明，并且除了上述那些之外的其他目的将变得显而易见。现在将根据优选但非限制性的实施方案并参考附图更详细地阐述这种描述；其中
75.图1示出了包括多孔基底的纤维蛋白原浓度诊断测试装置的示意性布置。
76.图2示出了处于第一测试阶段的图1的装置
77.图3示出了处于第二测试阶段的图1的装置。
78.图4示出了图1的测试装置，其具有完成测试试剂盒的外壳(outer casing)，并且具有指示未使用状态的视觉指示器。
79.图5示出了图4的外壳，其指示具有指示反应和有效测试的视觉指示器的第一测试阶段。
80.图6示出了处于第二测试阶段的图4的装置，其具有指示结果的视觉指示器。
81.详细描述
82.现在将根据优选实施方案而非限制性实施方案并参考附图更详细地描述本发明。本文提及的实施例是说明性的，且不应视为限制本发明的范围。虽然本文描述了本发明的各种实施方案，但是应当理解，这些实施方案能够进行修改，且因此本文的公开内容不应被解释为限制所阐述的精确细节，而是可以在说明书的范围内获得这些改变和更改。
83.术语
84.在整个说明书中，对底物的提及可以认为包括对有助于测定的诊断的活性基料/介质的提及。对因子的提及可以认为包括对影响结果的诊断组分的提及，对生物因子的提及可以认为包括对源自生物来源的因子的提及，例如，凝血酶、血小板等。对化学因子的提及，可以认为包括对源自非生物来源的因子的提及，例如氯化钙等。对物理因子的提及可以认为包括对不是由化学物质组成的因子的提及，例如uv辐射、温度、压力。
85.对施加/已施加的提及可以认为包括提及：作为测试程序的一部分向诊断中添加化学物质。对预施加的提及可以认为包括提及：将化学物质结合至诊断中作为内在设计的
一部分。对凝块的提及可以认为包括提及：由聚合的纤维蛋白单体组成的网络，并且对凝固或凝块形成的提及可以认为包括对纤维蛋白原转化成纤维蛋白网络的提及。对(凝块形成的)扩大的提及可以认为包括提及：在允许反应的时间内产生更大量级的凝块网络。
86.对显色标记物(也称为染料)的提及可以认为包括提及：肉眼清晰可见的有色化学物质。对侧向流动的提及可以认为包括提及：液体经由毛细力通过长而窄的通道的移动。对芯吸液体的提及可以认为包括提及：通过毛细力的作用移动通过基底的液体。芯吸流体也是浸透流动接收区以便通过流动路径区行进的流体。
87.对流体接收区的提及可以认为包括提及：其中可以施加芯吸液体的区域。提及流动路径区可以认为包括提及：其中芯吸液体可以从流动接收区移动到其中的区域。
88.对洗涤液的提及可以认为包括提及：用于将一种或多种显色标记物从基底中脱位出来的液体。在这种情况下，血浆/血液溶液也可以定义为洗涤液体，因为它能够将染料从纸中脱位出来(如果染料被预先加载到反应区中)。
89.对阈值结果的提及可以认为包括提及：简化的量化，其中从测量提供的结果仅可读为高于或低于某一值(即读数是正的或负的)。
90.对(基底的)表面的提及可以认为包括提及：仅可暴露于液体或气体的基底表面的固体界面；包括施加和/或预施加到该界面的任何化学改性或涂层。对毛细管的提及可以认为包括提及：可以容纳血液或血浆的细管。对离心机或离心机装置的提及可以认为包括提及：(向样品)施加向心力或离心力的装置。
91.出于说明的目的，本文参考纸条描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明具有除纤维蛋白原测试之外的应用。在整个说明书中，对芯吸的提及可以认为包括提及通过毛细管吸收或抽出液体的作用。
92.根据一个实施方案，提供了一种纸指示器，其使用凝血酶和染色溶液以使用距离增量确定血液样品中纤维蛋白原的浓度，所述距离增量可以潜在地以mm或cm测量。该指示器旨在用于测量0-2g/l以诊断低纤维蛋白原血症(特别是在出血的早期阶段)。根据方法方面，测试采用血浆并基于凝块疏水性而不是如已知技术中的凝块形成时间来测量。
93.根据优选实施方案，提供了一种纸基底，其具有涂覆了凝血酶的一部分和涂覆了蓝色染料的另一部分。将血浆加入具有凝血酶的部分以短时间反应，然后将水加入到具有蓝色染料的部分。但优选在反应区中使用蓝色染料(并使其在最终的疏水区中芯吸)。所测量的距离是水通过凝结的血浆芯吸蓝色染料有多远。实际上，它还随它在疏水区移动(同时通过它移动)。这与现有技术不同，现有技术测量血浆在凝固时通过装置移动有多远。疏水区的前部可以用作距离标记，因为它可以比通过芯吸流体通过其移动产生的距离标记更清楚。
94.根据一个实施方案，图1显示了包括多孔基底2的纤维蛋白原浓度诊断测试装置1(参见图2)的示意性布置。优选，基底2以条的形式提供，但是应当理解，其他几何形状也是可行的，只要其包括流动路径区即可。根据所示的实施方案，基底2包括第一端3和第二端4。在端3和4之间是用于分析测试结果的流动接收区5和流动路径区6。基底2在流动路径区6中包括凝血酶显色底物(例如s2238)。[显色底物是在颜色形成下与蛋白水解酶反应的肽。它们是合成制备的，并且被设计为具有类似于酶的天然底物的选择性。酶作用于显色底物，从而在底物转化为产物时增加或减少在特定波长的光吸收。]邻近用于接收水的流动接收区5
和靠近端3的是蜡边界7，其为在测试期间引入流动接收区5的水提供流动限制。基底2还包括反应区8，其优选结合冻干的凝血酶和蓝色染料。反应区8预先加载凝血酶和染料。
[0095]
图2以相应的编号显示了图1的基底装置2处于第一测试阶段以确定血浆样品中的纤维蛋白原浓度。根据一个实施方案，优选使用移液管将血浆加入反应区8中。基底2中的毛细管力在端3和/或4中的任一个的方向上侧向地芯吸血浆、蓝色染料和凝血酶。凝血酶与血浆纤维蛋白原和凝血酶显色底物反应。这形成了疏水区9。当凝血酶裂解显色底物时，指示区20经历颜色变化。
[0096]
图3显示了处于第二测试阶段的图1的装置。在该阶段期间，将水加入流动接收区5中。这可以使用移液管或可替代地将基底2放入芯吸流体(如但不限于水)的烧杯中来完成。多孔基底2中的毛细力沿着流动路径区6推动/芯吸作用于芯吸流体。芯吸流体沿着流动路径6行进的距离l是疏水区9中的疏水性水平的函数。水沿着基底行进的距离是血浆样品中纤维蛋白原浓度的视觉指示。
[0097]
图4显示了未使用的测试装置1，其在内部包括图1的基底2，基底2容纳在完成测试装置1的外层(outer)/壳体(housing)/外壳(casing)11中，并且具有指示未使用状态的视觉指示器。外壳11被分成施加指示器窗口和分析窗口。在施加窗口中，提供了指示血浆引入的指示窗口13和指示水引入位置的窗口12。在加入血浆后，窗口13经历颜色变化。提供质量检查窗口14，其用于评估血浆/血液样品和凝血酶的预反应。窗口14具有凝血酶显色底物。在添加血浆或血液样品后(来自窗口13)凝血酶扩散到其上时，其改变颜色以指示凝血酶尚未降解，从而指示测试是有效的。区6(其含有未裂解的凝血酶显色底物)位于窗口14下方。将血液或血浆样品加入窗口13时，它允许来自反应区的预加载的凝血酶扩散到区6。无活性凝血酶显色标记物可置于反应区上游的单独区域中。这可以由图4中的没有阴影的额外框(未示出)表示，以代替指示其缺少颜色。然后，添加血浆/血液样品时，其变得如图5所示变成着色的。如果凝血酶起作用，则它将裂解凝血酶显色底物，并使窗口14改变颜色以指示有效的测试。如果凝血酶不起作用，则将不会发生颜色变化，并且将向使用者指示不能使用测试装置。在测试完成时，窗口15将提供低纤维蛋白原的指示，或者窗口16将提供非常低的纤维蛋白原的指示。这优选通过出现在窗口15或16中的颜色指示来实现。
[0098]
图5以相应的编号显示了图4的壳体/外壳11，其指示具有视觉指示器质量检查窗口14的测试的第一阶段，表明样品和凝血酶显色底物之间已经发生反应并且存在有效的测试(质量检查)。窗口14中的有效测试的指示优选通过颜色变化来实现，例如但不限于白色到绿色。染料也可以掺入反应区中。区6(其含有未裂解的凝血酶显色底物)位于窗口14下方。将血液或血浆样品加入窗口13时，其允许来自反应区的预加载的凝血酶扩散到区6。如果凝血酶起作用，则它将裂解凝血酶显色底物，并使窗口14改变颜色以指示有效的测试。如果凝血酶不起作用，则不会发生颜色变化，并且它将向用户指示不能使用测试。加入血液/血浆样品时，它也将染料铺展在窗口14下方。因此，一旦凝血酶显色底物已经反应，在变为绿色之前，血浆添加后的窗口14可以最初呈现蓝色。
[0099]
图6显示了在第二测试阶段的指示。参考指示器窗口，窗口13指示添加了血浆，并且从窗口14进行了有效的测试。在这种情况下，在测试的第二阶段的图4的装置的窗口16显示没有指示(保持白色)，但窗口15显示了测试的患者具有1-2g/l之间的低浓度的纤维蛋白原，其中视觉指示器指示了结果。在这种情况下，需要纤维蛋白原浓缩物。
[0100]
本发明使用纸、纤维素或任何多孔和可润湿的材料作为血浆和水两者芯吸通过的介质。纤维素的多孔结构诱导毛细管作用，但不依赖于微柱挤出的作用。与塑料、玻璃或硅相比，纸是经济的(每次测试au$5美分，相对于每次测试au$50美分)。纸是柔性材料，可以被切割成许多不同的形状、构造和结构，并且可以容易地与疏水屏障和亲水通道结合。因此，与现有技术相比，其制造成本非常经济。
[0101]
本发明具有优于现有技术的许多优点。例如，在现有技术中，使用塑料诊断装置，其没有固有的毛细管作用来促进流体流动。因此，必须通过包含微柱来人工诱导流体流动。此外，现有技术的塑料诊断装置需要涂覆有siox并用聚电解质处理，以增加流动路径区的亲水性，如us20120107851a1中所述的。额外的制造显著增加了生产装置的成本。根据本发明，使用不需要预处理来诱导毛细管作用的纸指示器，因为材料本身具有固有的毛细管作用，不需要预处理或改性来诱导毛细管作用。本发明的一个优点是纸指示器的使用具有自然的毛细管流动，而不需要部分添加或修饰表面。
[0102]
另一个优点是消除了与凝血酶动力学相关的可变性的缺点。此外，使用诸如纸的多孔材料允许以侧流测定法之外的其他方式测量纤维蛋白原浓度。例如，可以将测试转换成流通型检测系统，其在一定次数的洗涤之后测量颜色强度。本发明的另一个优点是，对于1-2g/l纤维蛋白原的浓度范围，测试的灵敏度更高。例如，在所引用的现有技术us20120107851a1中，1和2g/l之间的血浆的行进距离在停止之前仅为0.6cm。
[0103]
根据本发明，在洗脱7分钟后，对于相同浓度，存在例如1.7cm的分离。预期基底2包括用于芯吸流体的各种用户选项，包括可润湿纤维材料，并且包括但不限于通过血浆处理、辐射、表面活性剂涂覆和/或化学反应处理以使其可润湿的不可润湿材料。基底可以是织造的或非织造的。它可以用凝血酶和/或fxiiia或这些酶的衍生物预处理或后处理。它可以用沉积的可解吸(desorbable)染料和/或可解吸染料粘合剂以及颗粒和纳米颗粒处理。在测试期间，基底加载水、缓冲溶液、染料溶液和/或洗涤溶液-总地称为芯吸流体。
[0104]
提供了用于分析测试和测试结果的替代方法。定量疏水区/疏水性的方法包括测量侧向流中由至少一种显色标记物在疏水区9中的行进距离。优选，侧向流发生在流动接收区5和流动路径区6中的多孔基底2中。根据一个实施方案，流动路径区6具有长度l1和宽度w1。流动接收区5具有长度l2和宽度w2。l1可以与l2具有相同或不同的长度。同样，w1可以与w2具有相同或不同的长度。侧向流动方案穿过流动接收区5和流动路径区6，并且如前文所述。根据一个实施方案，生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物预先加载在流动路径区6的基底2中。可替代地，那些因子可以在测试期间施加于流动路径区6和/或流动接收区5的至少一部分。在使用中，将血液或血浆样品引入流动路径区6和/或流动接收区5的至少一部分中。可以将一种或多种显色标记物在此时施加或预先施加至基底2中。
[0105]
将芯吸流体施加到流动接收区5，以便诱导一种或多种显色标记物通过流动路径区6移动。根据一个实施方案，将芯吸流体以有限储器或无限体积储器的形式施加到流动接收区。通过判定靠近流动路径区6的标记物来测量一种或多种显色标记物行进的距离。将基底2保持在壳体11中以形成装置1时，通过经由壳体11中的透明窗口12、13、14、15和16观察流动路径区6来测量一种或多种显色标记物行进的距离。窗口12、14、15和16与流动路径区6对准，并且能够实现先前参考图5和6描述的观察。指示窗口与沿流动路径区6向上的关键距离对准，并且将显示出一种或多种显色标记物已经到达了哪和/或是否经过关键距离。
[0106]
根据一个实施方案，通过在用洗涤液漂洗多孔基底后，测量反应区中(或外)施加和/或预施加的至少一种显色标记物以及所有其它生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物的保留程度来确定疏水区9的疏水性。疏水性是指无孔基底表面的疏水性。基底的表面疏水性用于影响任何沉积的液滴的形状、高度和/或接触角。疏水性可以用将或可以增加或降低基底疏水性的物理因素和/或化学因子来改变。改变疏水性的一种方法是将化学涂层施加到基底上。
[0107]
优选，所形成的凝块充当疏水性屏障，以防止洗涤液将一种或多种显色标记物从底物中脱位出来。正形成或已形成的凝块可以覆盖无孔基底的表面以改变其疏水性。物理因子可以允许或阻止凝块形成的开始。所用的物理、生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物牵涉凝块形成的启动、执行、扩大和/或加速。这些因子也影响凝块的疏水性。
[0108]
用给定体积的洗涤液洗涤基底后，通过绝对和/或相对颜色强度测量一种或多种显色标记物的保留。一种或多种显色标记物与所有其他生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物一起施加和/或预先施加在反应区中。
[0109]
在进行纤维蛋白原浓度测试的方法中存在许多变化。所述变化包括：
[0110]
将血液或血浆施加在所述反应区外的无孔基底上；
[0111]
将血液或血浆施加到反应区以在启动凝块形成后形成疏水区；
[0112]
通过物理因子从无孔基底的表面除去凝固的血液或血浆；
[0113]
使用至少一种显色标记物增强液滴的可视性。
[0114]
高度测量的阈值结果可以通过将多孔的吸收性基底直接放置在无孔基底上方并允许任何沉积的液滴与多孔的吸收性基底接触来确定。
[0115]
该方法包括测量显色染色的过程，该显色染色是指至少一种显色底物直接和/或间接与已形成的或正形成的凝块结合。在启动凝块形成后，将血液或血浆施加到反应区以形成染色的凝块区。生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物可用于增强一种或多种显色标记物的颜色强度。
[0116]
根据另一个实施方案，本发明的一种诊断血液或血浆样品中纤维蛋白原浓度的方法包括在离心机中使用至少一个毛细管，每个毛细管包括施加和/或预先施加在至少一个毛细管内部的生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物的反应混合物。将血液或血浆施加到形成凝块的反应混合物中，并测量启动凝固后的凝固程度。测量凝固程度是指定量毛细管中凝块的质量、体积或高度。
[0117]
将离心力施加到毛细管上，使得其导致凝块在远离旋转轴的方向上压缩。通过测量毛细管中离心压缩的凝块的高度来确定凝固程度。压缩凝块的高度可以用判定一个或多个毛细管的顶部和/或旁边的标记来测量。或者，通过将毛细管包含在具有透明窗口的外壳中来测量压缩的凝块，所述透明窗口与沿毛细管向上的关键高度对准，因此将显示凝块是否已经到达和/或是否超过关键高度。
[0118]
如前所述，使用显色染料或其它合适的标记物。使用生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物增强一种或多种显色染料的颜色强度，并牵涉凝块形成的启动、执行、扩大和/或加速。所用的物理因子将或可能允许或阻止凝块形成的启动，所用的生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物牵涉凝块疏水性的增强或减
弱。所用的物理因子将或可能增强或减少凝块的疏水性。所用的生物因子、化学因子和/或生物因子和/或化学因子的衍生物牵涉凝块直接和/或间接结合至少一种显色标志物的能力的增强或减弱。
[0119]
本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的整体精神和范围的情况下，可以对本文广泛描述的本发明进行许多变化和修改。