高选择性色谱-分子旋转共振波谱系统和方法与流程

高选择性色谱-分子旋转共振波谱系统和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年2月18日提交的题为“用于测量气相色谱流出物的分子旋转共振波谱仪(molecular rotational resonance spectrometer for measurement of gas chromatography effluents)”的美国申请第62/977,846号；于2019年10月9日提交的题为“具有单一特异性的分子检测/分离系统(a molecular detection/separations system of singular specificity)”的美国申请第62/913,082号；以及于2019年5月7日提交的题为“质谱联用mrr波谱：作为色谱检测器的mrr波谱(hyphenated mrr spectroscopy:mrr spectroscopy as a chromatographic detector)”的美国申请第62/844,280号在35u.s.c.
§
119(e)下的优先权权益。这些申请的每一个申请通过引用其相应整体并入本文。


背景技术：

3.通常采用色谱分离技术以确定和定量化学混合物中的组分。色谱用于制备和分析目的两者。在制备色谱中，仪器物理地分离并隔离不同的化合物。在分析色谱中，仪器鉴定并定量样品中的不同组分。例如，气相色谱(gc)用于表征药物开发和批准过程中的小分子混合物以及用于测量药物产品中的杂质。美国食品与药物管理局(fda)严重依赖于气相色谱来进行监管验证。
4.常规的色谱设备包含柱，所述柱包含基于不同分析物的重量、极性或其它性质将所述分析物在柱中保留不同的时间量的固定相。这使得这些组分得以分离。常规的色谱设备还包含检测器，当化学组分从柱中洗脱出来时，所述检测器返回信号。这些检测器中的一些检测器不能获得化学信息—例如，火焰离子化检测器(fid)，其由于燃烧分析物而返回信号。其它检测器确实获得化学特异性信息—例如，质谱(ms)。然而，对于所有检测器，柱应当完全或几乎完全分离混合物的各种组分，以便可靠地定量组分。当多于一种组分同时从柱中洗脱出来时，大多数检测器不能准确地解析和定量单独组分。因此，分析化学家做出了巨大努力来开发可以更好地分离具有挑战性的混合物的新柱并且开发可以完全分离单独组分的方法。尽管付出了大量努力，但仍存在某些重要的分析，其中色谱分离是不可能的或非常困难的(需要昂贵的柱和长的运行时间)。
5.分子旋转共振(mrr)波谱(在其它方面也被称为分子旋转波谱或微波波谱)通过化合物在气相中的纯旋转角动量跃迁来表征化合物。分子的旋转能级按其3维质量分布所规定的那样被定量，所述质量分布被表示为其惯性矩i。这(在一个维度中)被定义为i＝σm
iri2
，其中mi是分子中原子i的质量，并且ri是原子i距分子的质心的距离。分子的旋转波谱由哈密顿函数(hamiltonian)描述的，所述哈密顿函数精确地取决于其在三个空间轴上的惯性矩，并且因此使用旋转波谱，分子可以通过其在结构上的差异而被明确地区分。鉴于其众多且极其窄的波谱线(典型的波谱分辨率νδν≈10-5
)，高分辨率旋转波谱因此对于每个分子结构都是绝对唯一的。
6.例如，图1示出了
13
ch3cn和ch
313
cn的mrr波谱—具有相同质量的同位素异构体，其中可以观察到每一个波谱的清晰分辨的波谱模式。另外，值得注意的是，可以高精度地计算
每种化合物的mrr波谱。因此，使用mrr，可以在没有参考样品的情况下毫无疑义地鉴定化合物。


技术实现要素：

7.将气相色谱(gc)或液相色谱(lc)与分子旋转共振(mrr)波谱组合的仪器提供了关于气相或液相中的分析物的空前水平的分子信息。所得gc-mrr或lc-mrr波谱系统(也称为gc-mrr或lc-mrr仪器)可以采用包含啁啾脉冲ft(cp-ft)技术在内的宽带mrr测量技术，以比其它mrr或旋转波谱系统快若干个数量级地测量波谱。本发明的gc-mrr或lc-mrr仪器相对于其它gc或lc检测系统，具体地质谱(ms)具有至少三个优点：(i)mrr对分子结构的差异高度敏感，并且因此可以解析所有类型的异构化合物；(ii)mrr可以在特异性或准确性没有损失的情况下解析和定量共洗脱化合物；以及(iii)定性鉴定和绝对定量两者都可以在没有参考标准物的情况下实现。
8.本发明的仪器可以采取集成色谱-波谱系统的形式，所述集成色谱-波谱系统包括气相色谱仪、mrr波谱仪以及可操作地联接到mrr波谱仪的处理器。在操作中，所述气相色谱仪用柱将分析物分离成组分。所述柱与载气源流体连通，所述载气源供应载气以推动所述组分穿过所述柱。mrr测量所述组分的色谱图。mrr包括测量室、喷嘴和微波源。所述测量室保持由所述气相色谱仪分离的所述分析物的所述组分。与所述柱和所述测量室流体连通的所述喷嘴将所述组分注入到所述测量室中。并且与所述测量室电磁通信的所述微波源用激励脉冲激励所述测量中的所述组分，所述激励脉冲在约6ghz到约18ghz的频率范围内具有至少一个波谱分量。所述处理器基于所述组分的所述mrr波谱解析所述分析物的所述组分。
9.替代性仪器包括色谱仪和与所述色谱仪流体连通的mrr波谱仪。所述色谱仪将分析物分离成组分。并且所述mrr波谱仪测量所述组分中的至少一种组分的mrr波谱。
10.另一种本发明的仪器包括气相色谱仪、mrr波谱仪和与所述气相色谱仪的柱和所述mrr波谱仪的真空室流体连通的脉冲射流膨胀源。再次，所述气相色谱仪将分析物分离成组分，并且所述mrr测量所述组分的mrr波谱。所述脉冲射流超声波膨胀源将所述组分从所述柱传送到所述真空室中。
11.在本发明的仪器中，由mrr波谱仪收集的原始数据是来自由色谱仪分离的分析物组分的一系列连续的时域自由感应衰减(fid)迹线。可以用处理器(例如，仪器处理器或单独的处理器)对这些时域fid迹线中的每个时域fid迹线进行傅里叶变换，以产生对应的分子旋转共振(mrr)波谱。所述处理器鉴定这些mrr波谱中的每个mrr波谱的谱线并且对每个mrr波谱中的所述谱线的振幅进行求和以产生与所述时域fid迹线的时间箱(time bin)相对应的振幅值。所述处理器基于所述时域fid迹线的所述振幅值和时间箱形成所述分析物组分的色谱图。所述处理器还鉴定所述色谱图中的峰并且对与和所述色谱图中的所述峰相关联的所述时间箱相对应的所述时域fid迹线进行求和、积分或平均，以产生经积分的时域fid迹线。对所述经积分的时域fid迹线进行傅里叶变换产生与所述色谱图中的所述峰相关联的mrr波谱。
12.前述概念和下文更详细论述的另外的概念的所有组合(前提是这些概念不互相不一致)被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地，在本公开的结尾处出现的所要求保护的主题的所有组合都考虑作为本文中所公开的发明主题的一部分。还应当了解，应
当赋予本文中明确使用的也可以出现在通过引用并入的任何公开中的术语与本文中公开的特定概念最一致的含义。
附图说明
13.技术人员将理解，附图主要出于说明性目的而并非旨在限制本文中描述的本发明主题的范围。附图不一定按比例绘制；在一些情况下，本文中公开的本发明主题的各个方面可以被夸大或被放大地示出在附图中以便于理解不同的特征。在附图中，相似的附图标记通常指代相似的特征(例如，功能上类似的和/或结构上类似的元件)。
14.图1示出了乙腈的两个同位素异构体的分子旋转共振(mrr)波谱，其展示了对同量异位化合物的选择性以及mrr波谱谱线的极高分辨率。
15.图2a示出了从未通过气相色谱(gc)分离但可以通过gc-mrr波谱分析的氯化二噁英异构体。
16.图2b示出了可以通过gc-mrr波谱分析的得到批准的氟化药物及其可能的脱-f降解物。
17.图2c示出了可以通过gc-mrr波谱分析的共洗脱乙腈同位素物种的色谱图。
18.图3a是gc-mrr系统的示意图。
19.图3b是适用于图3a的gc-mrr系统的mrr波谱仪的照片。
20.图3c和3d示出了适用于示出用图3a的gc-mrr系统和/或图3b的mrr波谱仪获得的mrr波谱的图形用户接口的视图。
21.图4示出了适用于gc-mrr系统的脉冲射流喷嘴的实例。
22.图5a示出了异蒲勒醇在四个不同温度下的模拟mrr波谱，其示出了随着旋转温度的降低敏感度的增加和较更低频率的偏移。
23.图5b示出了图5a中的模拟mrr波谱在频率范围6-18ghz内的特写。在室温下，这种分子在微波频率下将是完全不可检测的，因为谱线强度下降到低于10
–7单位的检测截止值。
24.图6示出了在300k的温度下具有不同分子量的分子的模拟mrr波谱。
25.图7a展示了从由集成色谱-mrr系统收集的原始时域自由感应衰减(fid)迹线计算总分子色谱图(tmc)和提取分子色谱图(emc)的方法。
26.图7b是由fid迹线计算的tmc和emc的示意图。
27.图7c是用gc-mrr系统获得的五种常见有机分子的24个同位素体的tmc。
28.图7d示出了图7a的tmc中的24个同位素体的emc。
29.图8a示出了(a)溴乙烷、(b)噻吩、(c)2-氯噻吩、(d)3-氯噻吩、(e)3-氯吡啶和(f)2-氯吡啶的tmc。
30.图8b示出了图8a中的化合物的天然同位素丰度如何通过gc-mrr emc容易地获得的两个实例。这些比率中的误差为
±
3％rsd。
31.图9示出了混合液相色谱(lc)-mrr波谱系统。
32.图10a展示了手性标记，所述手性标记是通过组合手性标签和对映异构体而具有不同波谱的不同非对映异构体的气相形成。
33.图10b展示了来自mrr波谱的对映异构体过量分析。使用手性标签的外消旋或甚至纯对映异构体进行测量。
具体实施方式
34.gc-mrr可以解决的分析问题
35.gc、lc和mrr波谱是公认的技术，尽管就用于分析应用的商业采用而言，mrr波谱仍处于早期阶段。然而，gc-mrr和lc-mrr波谱可以解决目前没有其它技术或技术组合可以解决的问题。已经显示，不具有色谱分离的直接mrr波谱鉴定出含有多达约10种组分的混合物中的组分。然而，使用gc和lc的生物化学、环境、石化和其它应用领域中的实际样品具有基质以及不同浓度的多种分析物。另外，混合物的mrr波谱是高度复杂的，部分是因为每种组分的模式彼此交错。当存在许多物种时，鉴定混合物中的未知组分(这通常通过计算机驱动的模式识别来完成)变得非常耗时，从而最终限制分析师解释复杂数据的能力。因此，gc-mrr或lc-mrr质谱联用大大扩展了可以通过mrr波谱成功分析的样品的复杂性，并且使得能够使用mrr色谱图中的色谱峰的面积对混合物组分进行准确定量。
36.同时，当用作检测器时，mrr波谱为气相和液相色谱分析带来了全新的能力。具体地，当无法或难以进行色谱分离时，mrr波谱相对于其它gc和lc检测器具有特别的优点，因为mrr波谱仍然可以容易地鉴定和定量无法进行色谱分离的单独组分。
37.峰的共洗脱或部分重叠的挑战在分离科学中是基础的。giddings使用统计重叠理论做出隐蔽预测，所述统计重叠理论陈述了当使用峰容量为n的色谱柱时，由于峰重叠而引起一个“没有真正的希望”或分离n个化合物。这种理论问题已经通过色谱的一般分辨率问题得到证实，所述问题说明了在给定条件下没有单个柱可以分离复合混合物中的所有组分。这种陈述尤其适用于当今包含异构组分的更加复杂的分离。虽然已经在异构体的gc和lc分离方面取得了非凡的进展，并且还开发了二维分离系统(例如，gc
×
gc)以提高峰容量，但mrr波谱鉴定和定量部分或完全共洗脱化合物的能力是分析化学的重大进步。
38.存在用于通过面积提取解析重叠峰的高级数学方法，如傅里叶自去卷积、小波、多变量曲线分辨率和迭代曲线拟合；然而，大多数这些化学计量技术在以下情况下会失败：(a)当峰完全重叠时或(b)当每种组分的实验测量的参考波谱不存在时。这是高度选择性检测器，如mrr波谱非常有用的情况：mrr波谱不取决于解析共洗脱的化学计量。相反，mrr波谱会产生对分析物具有特异性的信号，使得其它分子将不会与其相匹配。另外，mrr波谱是足够选择性的，使得其可以区分具有相同质量的两个分子，例如，同位素异构体、非对映异构体和对映异构体。这是甚至用于色谱的最佳质谱检测器都做不到的事情。
39.图2a-2c突出了若干实例，其中gc-mrr和lc-mrr可以解决分离科学中不能通过单独的gc或lc解决的挑战性问题。图2a示出了两种异构四氯二苯并二噁英(tcdd)，其是持久性有机污染物和人致癌物。迄今为止，没有gc柱可以分离1,2,3,8-tcdd和1,2,3,7-tcdd。这种分析性分离问题由于当前的gc检测器对这两种分析物产生难以区分的特征这一事实而加剧。然而，mrr波谱可以产生这些化合物的不同波谱。
40.作为第二实例，氟在药物中变得越来越重要，并且氟化化合物在gc中从其脱氟化对应物中解析可能非常具有挑战性。然而，通过旋转波谱区分这些化合物是简单的。图2b示出了比克替拉(bictegravir)(一种最近得到fda批准的药物)的结构，其中gc-mrr在解析氟化/脱氟化杂质中极其有用。
41.作为另一个实例，图2c示出了来自gc-mrr波谱的展示的乙腈(ch3cn)的八个同位素体的混合物的色谱图。化合物特异性同位素比率分析在许多研究领域中都是很重要的，
包含新陈代谢和环境降解研究。在色谱上，仅可以从同位素体的混合物中分离全氘化乙腈(cd3cn)。质谱仪可以用于区分具有不同质量的同位素体，但是甚至最高分辨率质谱检测器也不能区分两种
13
c取代的同位素异构体，
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ch3cn对ch
313
cn。
42.gc-mrr代谢组学研究(下文更详细地描述)示出了地下水中的不同细菌培养物对相同有机化合物可以具有非常不同的同位素选择性。另外，包含强大的多变量曲线分辨率方法在内的上述化学计量方法在这种情况下由于高重叠而失败。本研究是可以用gc-mrr波谱进行但不可能用其它方法进行的生物合成和降解研究的一个实例。
43.gc-mrr波谱测量类型和频带
44.gc-mrr波谱系统可以被配置成执行目标测量、宽带测量(例如，跨若干个波谱谱线和/或50mhz、100mhz或更高的带宽的测量)或两者。目标测量类似于质谱中的所选择的离子测量，并且通常以良好的灵敏度聚焦捕获特定物种或物种集合的mrr波谱。宽带测量类似于质谱中的总离子监测测量，并且通常被执行以表征混合物或未知化合物。在mrr波谱中，宽带测量可以基于啁啾脉冲傅里叶变换技术，所述啁啾脉冲傅里叶变换技术涉及用啁啾微波或毫米波辐射的一个或多个脉冲照射样品，并且响应于啁啾脉冲检测和傅里叶变换由样品发射的fid信号。宽带测量通常在含有一种或多种未知组分的样品上进行。关于啁啾脉冲傅里叶变换mrr波谱的更多信息，参见例如以下美国专利，所述美国专利通过引用其相应整体并入本文：题为“用于波谱的啁啾脉冲频域梳(chirped pulsed frequency-domain comb for spectroscopy)”的美国专利第9,046,462号；题为“傅里叶变换毫米波波谱的设备和技术(apparatus and techniques for fourier transform millimeter-wave spectroscopy)”的美国专利第9,921,170号；以及题为“跳频扩频(fhss)傅里叶变换波谱(frequency hopping spread spectrum(fhss)fourier transform spectroscopy)”的美国专利第10,107,744号。宽带测量可以一次跨整个频带或在整个频带的区段(例如，6-18ghz频带的2ghz或4ghz区段)上进行，以降低数据速率，如在题为“分段啁啾脉冲傅里叶变换波谱(segmented chirped-pulse fourier transform spectroscopy)”的美国专利第8,873,043号所公开的数据速率，所述美国专利通过引用整体并入本文。
45.当目标是确定样品是否含有特定化合物或化合物集合时，通常进行目标mrr测量。mrr仪器不是用啁啾脉冲照射样品，而是用一个或多个窄带(例如，单频)脉冲照射样品，并且检测样品响应于这些脉冲而发射的fid信号。由于测量是有针对性的，所以仪器可以比在宽带测量中更快地获取、处理和存储数据，例如以2hz、3hz、5hz、10hz或更大的速率。此测量速率可以通过直接对获取数据的现场可编程门阵列(fpga)执行傅里叶变换来提高。
46.目标mrr仪器可以在不具有“物种识别”能力的情况下操作，因为一个或多个激励频率和目标物种是提前已知的。目标mrr测量通常涉及查看单线时间对强度，因为所测量的强度与物种浓度成比例。如果目标物种和gc/lc分离参数是提前已知的，则可以提前编程mrr波谱仪以针对不同物种的不同波谱谱线或频段。考虑定量化合物a和b的混合物。如果化合物a在测量已经开始后10秒脱离柱并且在10ghz下具有强共振，则mrr波谱仪可以被编程成在10秒的测量时间时在10ghz下询问样品。类似地，如果化合物b在测量已经开始后15秒脱离柱并且在6.8ghz下具有强共振，则mrr波谱仪可以被编程成在15秒的测量时间时在6.8ghz下询问样品。如果在柱输出处存在辅助检测器，则辅助检测器可以基于峰/洗脱物顺序(例如，测量7ghz下的第一洗脱物、9ghz下的第二洗脱物等)或基于由辅助检测器进行的
初步分析(例如，如果辅助检测器是质谱仪或可以提供关于洗脱物的组成的信息的其它装置)来触发目标测量。
47.目标测量和宽带测量可以在不同频率范围下进行，包含微波区域(例如，在6-18ghz的频带内)或毫米波区域(例如，75-110ghz、260-290ghz或520-580ghz)中的频带。测量类型和测量频带取决于分析物和期望信息。
48.另外，微波mrr波谱测量可能由于测量条件的差异而比毫米波mrr波谱测量更敏感。毫米波mrr波谱测量通常使用流动池作为测量室来进行，这将分析物组分的分子量限制为约120amu。另外，气体移动穿过流动池通常需要几秒，从而降低gc输出的时间分辨率，所述gc输出通常在小于一秒内洗脱组分。gc载气还在流动池测量中稀释样品，从而降低灵敏度。
49.如下所述，微波mrr测量可以通过由超声波膨胀喷嘴供给的膨胀室进行。这使得能够更快地测量，从而保持gc输出的时间分辨率，并且能够测量如下所述的具有更高分子量的分子。另外，推动分析物组分穿过气相色谱仪的相同载气可以用于将样品推入到膨胀室中，因此载气不会引起样品的额外稀释或降低测量灵敏度。
50.gc-mrr波谱系统
51.图3a和3b示出了可以在单次运行中分析困难和/或复杂的混合物的质谱联用gc-mrr仪器300。其可以进行不能通过任何其它方法完成的化合物特异性同位素分析(csia)，包含同位素分馏分析和定量。例如，其可以在没有参考的情况下鉴定不能单独使用gc分离的异构体和其它化合物。
52.gc-mrr仪器300包含联接到具有温度调节的流动接口330的mrr波谱仪320的气相色谱仪310。气相色谱仪310具有载气源312，所述载气源使如氦气、氢气、氖气或氩气等载气流过柱314。载气推动分析物穿过柱314并且通过流动接口330推入到mrr波谱仪320中，所述分析物可以具有许多不同的化学成分，包含异构体、同位素、同位素异构体和同位素体。这种分析物可以(周期性地)虹吸出气体或液体的连续流或流、积聚并挥发(如果适当的话)，并且注入到柱314中，使得气相色谱仪有效地对连续流进行采样，非常像模数转换器(adc)对模拟信号进行采样。
53.分析物的成分中的一些或全部以不同的比率传播通过柱314，并且因此可能在不同的时间点出现在柱314的末端处。如果这些时间点被分离得足够宽，则可以在柱314的输出处解析成分。其它组分(例如，异构体)可能共洗脱，即，其它组分可能同时或几乎同时出现在柱314的输出处并且因此不能单独使用gc进行解析。
54.载气推动(至少部分分离的)组分穿过接口330并且推入到mrr波谱仪的测量室324中，使得mrr波谱仪320可以测量组分的mrr波谱。此接口330使得可以将样品通过gc柱314或直接注入到mrr波谱仪320中(例如，对于不需要gc分离的纯化合物或简单混合物)。换句话说，一些样品可能需要gc分离，而其它样品可能不需要gc分离。不需要gc分离的样品可以直接注入到mrr波谱仪(不通过gc)中，而其它样品可以通过gc注入。
55.例如，测量室324可以是具有允许气相组分和载气进入和离开的至少一对孔的流动池。可替代地，脉冲射流膨胀喷嘴、连续波射流或缓冲气体冷却池可以将组分引入测量室324中，同时旋转地冷却所述组分以获得更好的测量性能，如以下更详细描述的。mrr波谱仪320通过使组分经受微波和/或毫米波辐射的一个或多个激励脉冲来测量每种组分的mrr波
transform millimeter wave spectroscopy)”的美国专利第10,620,138号，所述美国专利通过引用整体并入本文。
63.图3b是gc-mrr波谱系统320中的测量室324和mrr波谱仪320的样品实例的照片。此mrr波谱仪320被描绘成被配置成进行目标测量的微波mrr波谱仪。在此图像中，样品入口332位于测量室324的左侧。两个球面反射镜328位于左端口和右端口上，即超声波膨胀喷嘴334被安装到一个端口中，而另一个端口被保持在由处理器340控制的自动控制平移台344的真空上。反射镜328使测量腔324进入共振法布里-珀罗腔(fabry-perot cavity)。平移台344调谐共振腔的长度(并且因此调谐腔的共振频率)，以便允许测量所关注的目标共振。测量目标共振增加了测量灵敏度。对于宽带测量，使用微波喇叭(未示出)代替反射镜328。这些喇叭可以正交于目标反射镜328安装。一个喇叭可以附着到最接近图6中的读取器的凸缘329，而另一个喇叭可以附着到相对侧(未示出)上。包含平移台和激励频率设置在内的测量参数以及测量结果可以通过可操作地联接到处理器340(图3a)的显示器342来示出。
64.图3c和3d展示了可以在显示器342上显示的用户接口的两个视图。图3c中所示的视图示出了显示乙腈(ch3cn)的八种同位素体的混合物的宽带、毫米波mrr波谱的接口。因为所述同位素体具有类似结构，所以可以使用gc将八种同位素体(cd3cn)中的仅一种与其它同位素体分离。其余七种物种同时脱离gc柱(即，其它七种物种被共洗脱)并且不能单独使用gc进行解析。
65.因为八种乙腈同位素体具有不同的mrr波谱，所以即使当这些乙腈同位素体同时脱离柱时，mrr波谱仪也可以解析这些乙腈同位素体。可以绘制每种同位素体的提取mrr色谱图，并且对峰求积分以提供每种物种的准确浓度。在此实例中，将八种同位素体以等浓度进行混合，并且将5nl的这种混合物直接注入到mrr波谱仪中进行分析。mrr波谱仪在1秒内测量并保存混合物的宽带mrr波谱。mrr波谱中记录的信息包含混合物中的所有同位素体的鉴定以及气室中的每种同位素体的数量。
66.用于gc/mrr波谱仪连接的分子量和旋转冷却
67.gc/mrr波谱系统的一个挑战是分析物分子量的上限。在具有在室温或更高温度下工作的流动池的gc-mrr波谱系统中，分子量的上限可以为约150amu，并且在100-150amu的分子量下的灵敏度可能是有限的，因为室温分子的mrr波谱在高于150amu时倾向于变得极弱。然而，使用脉冲射流超声波膨胀源、连续波射流或缓冲气体冷却池旋转地冷却用于mrr分析的分子，同时还将所述分子保持在气相中。具有脉冲射流膨胀源、连续波射流或缓冲气体冷却池的gc-mrr仪器由于这种旋转冷却而能够分析具有较高分子量(例如，高达400amu或更高)的分子。
68.图4示出了脉冲射流超声波喷嘴400的放大视图，所述脉冲射流超声波喷嘴适用于将分析物注入到如图3a和3b所示的gc-mrr系统中的mrr波谱仪的测量室中。有三种气体流入超声波膨胀喷嘴中：用于来自gc柱的分析物组分的gc流入口410；用于快速除去溶剂或其它挥发性基质组分的排气阀入口430；以及任选的(另外的)载气入口430。gc流入口410和排气阀入口420可以通过1/16”管制成，并且可以被加热到至少300℃以允许在一定温度下直接进入gc柱。在图4中，这些管是peek塑料，但是连接可以替代地由具有更好热性能的金属制成。用于载气的中心(1/4”)气体连接430是任选的并且可以用于吹扫气体以快速清洁样品。所有三种气体流在储器440中组合，所述储器的体积可以为约500μl或更小。减小储器体
积可以减小柱外加宽。
69.组合的气体流通过具有大约1mm直径的针孔喷嘴450与稀有载气共膨胀。针孔喷嘴450通过用特氟龙提升阀密封的电磁阀452迅速地打开和关闭。在每个气体脉冲(持续时间大约1毫秒)上，分析物组分行进穿过针孔450并且进入保持在高真空(约10
–6托)下的mrr波谱仪测量室。沿着穿过针孔450的路径，分子经历与载气的多次碰撞。这些碰撞使分析物组分的旋转温度降低到大约1-2k。
70.例如，当将由gc柱分离的分析物组分用脉冲射流超声波喷嘴注入到微波mrr测量室中时，载气(如，氖气)压力可以设定为每平方英寸表压(psig)约+2到约+5磅。喷嘴以10hz进行脉冲。在每次脉冲注射时，喷嘴将约1nmol分析物组分和1μmol的氖气注入到测量室中。这与大约10-15毫升/分钟(stp的穿过gc-mrr系统的载气相对应。这与宽孔gc柱的典型流速相当。在喷嘴处注入氖气载气(例如，通过图4中的任选载气入口430)可以增强脉冲阀操作。如果在喷嘴处注入氖气载气，则gc柱可以用不同的载气(例如，氢气或氦气)操作，因为氖气将主导由分析物组分向微波mrr测量室中的超声波脉冲注入引起的旋转冷却。这两种载气都可以注入到mrr测量室中。
71.图5a和5b示出了异蒲勒醇(单萜和薄荷醇中间体，质量154amu)在以下四个分子温度下的模拟mrr波谱：室温(300k；底部)、100k(中下部)、20k(中上部)和2k(顶部)。图5a示出了0到600ghz的微波和毫米波频率内的波谱，并且图5b示出了0到18ghz的微波频带中的波谱。这些波谱在较低温度下显示出改进的测量性能，这可以通过使用脉冲射流超声波膨胀源将gc输出注入到gc-mrr波谱系统中的mrr波谱仪的真空室中来实现。使用理想的载气(如，具有优异的冷却性质的氖气)的脉冲射流超声波膨胀可以实现在1k与2k之间的旋转温度。(使用超声波膨胀源的一种折衷是超声波膨胀源具有更大的真空室以允许膨胀。然而，仪器大小与高端质谱仪相当。)
72.图5a和5b中的mrr波谱展示了由冷却分子旋转引起的许多效应。第一，mrr波谱显著简化。对于每个分子，填充的旋转能级要少得多，并且因此跃迁也就少得多。这还意味着更多的组分可以在单一混合物中进行解析，因为每个分子具有更少的谱线。第二，mrr波谱变得更强几个数量级(如可以从图5a和5b上的y轴看出)，这可以导致更灵敏和/或具有更高信噪比(snr)的测量。不受任何特定理论的束缚，图5a和5b所示的强度增加是由于填充的振转状态数量较少导致的。第三，mrr波谱偏移到较低频率。波谱向较低频率的偏移也是有利的，因为与在毫米波区域(例如，75ghz和更高)中相比，在微波区域(具体地低于18ghz，例如，6到18ghz)中，利用更便宜的组分可以实现更高的激励功率电平。重于50amu的几乎每个分子都在微波范围(6-18ghz)内具有波谱强度峰。
73.图6示出了三种不同大小的分子在室温下的模拟mrr波谱。通常，随着分子大小增加，mrr波谱变得更复杂，因为更多的旋转和振动状态得到填充。在脉冲射流中，振动状态也被冷却，因此大分子的波谱变得较不复杂，如上所述。测量高达300amu的化合物的mrr波谱变得更加简单，并且超出此值也变得可行(其中主要限制变成使化合物进入气相并且将气相保持在此)。
74.总分子色谱图(tmc)和扩展分子色谱图(tmc)
75.图7a展示了用于处理由图3a所示的集成gc-mrr仪器300测量的原始数据的方法700(此方法700还可以用于分析lc-mrr数据)。如上所述，gc-mrr仪器300通过以下方式获得
时域数据(702)：将来自gc柱314的(至少部分地)分离的组分注入到mrr波谱仪的测量室324中，然后用微波或毫米波脉冲来激励测量室324中的组分，并且记录所得时域自由感应衰减(fid)信号。随着时间的推移，仪器300例如以5hz或10hz的速率记录一系列这些时域fid迹线。
76.对这些原始时域fid迹线中的每一个进行变换产生了一组mrr波谱(704)，所述波谱中的每一个都与测量时段中的不同时间箱相关联。对这些mrr波谱中的每一个中的波谱谱线(峰)的振幅进行鉴定(706)和求和(708)产生了与所述mrr波谱相关联的时间箱的振幅值。将振幅值作为时间的函数进行作图产生了总分子色谱图(tmc)(710)。与其它色谱图一样，tmc表示色谱仪中脱离柱的组分作为时间的函数的分离，其中每个峰与在所述时间箱从柱中洗脱的一种或多种组分相对应。
77.tmc中的每个峰可以跨若干时间箱。鉴定峰和相关联的时间箱(712)使得可以鉴定对应的原始时域fid迹线，可以对所述迹线进行求和或平均(714)，然后进行傅里叶变换以产生与所述峰相关联的mrr波谱(716)。此mrr波谱被称为提取分子色谱图(emc)并且可以用于鉴定、解析和/或定量分析物组分(718)。例如，如果组分是不能从tmc中解析的异构体，则所述异构体可以通过emc中的其mrr波谱的差异来解析。组分可以通过将emc与先前测量的emc库(mrr波谱)和/或理论emc进行比较来鉴定。
78.图7b展示了fid数据、tmc与emc之间的关系。tmc被绘制为时间序列，其中每个点(振幅值)与对应时间箱的mrr波谱中的波谱谱线的总和相对应。mrr波谱通过对用于相应时间箱的fid迹线进行傅里叶变换来计算。在一些情况下，多种分析物组分可以有助于给定峰。例如，在图7b中，分量1和2两者均有助于tmc中的左侧峰并且不能从峰自身中解析。分量1有助于时间箱1-8的振幅值，并且分量2有助于时间箱6-12的振幅值。对于左侧峰，可以从emc中解析、鉴定和定量分量1和2。通过对用于时间箱1-12的fid迹线求积分或平均，然后对积分或平均的fid迹线进行傅里叶变换来计算emc。
79.图7c和7d示出了五种常见有机分子的24种同位素物种的单一gc-mrr分析，所述分析证明了使用图7a的方法获得的gc-mrr仪器的可行性和实用性。图7c示出了tmc，其中对观察到的跃迁的峰强度进行求和。tmc指示刚好在主要丙酮和乙腈峰(分别在3.2分钟和7.6分钟)之前的五个主要峰和两个小肩峰。这些小的、部分解析的肩峰是完全氘化的丙酮(丙酮-d6)和三重氘化的乙腈(acn-d3)，将其与其相关的同位素体和同位素异构体色谱分离。
80.tmc中的每个点包含允许分离不同物种的单独贡献的宽带mrr波谱。mrr波谱的非凡选择性允许将tmc解析成24个emc，图7d中所示，其中每种同位素不同的化合物具有一个emc。在每个emc迹线中，对仅在所述同位素物种的频率下的跃迁强度进行求和。分子鉴定不需要同位素模式匹配/分析，因为同位素可以根据其惯性矩直接确定。具有相同质量的分子(例如，h c-(c＝o)-13
ch3和h
313
c-(c＝o)-ch3或
13
ch3ch2oh和ch
313
ch2oh)可以由于其不同的惯性矩而从mrr波谱中进行区分和鉴定。
81.图8a示出了通过gc-mrr波谱和图7a中的方法获得的溴乙烷和五种杂环化合物的tmc。图8b示出了显示溴乙烷和2-氯吡啶的天然同位素丰度的同位素体特异性emc。gc-mrr峰面积的积分提供了所有物种的定量信息。虽然未在图8a的tmc或图8b的emc中使用，但偶极矩和旋转常数的变化通常很小。mrr峰强度之间的比率还可以直接用作同位素比率的准确确定。
82.与质谱不同，同量异位化合物不会造成问题。另外，峰(化合物)共洗脱不会引起信号抑制或增强。这很大程度上是由于以下事实：mrr波谱检测具有非常高的分辨率并且提供对一种化合物具有高度特异性的大量谱线，即使所述化合物是另一种化合物的异构体或同位素体或同位素异构体。另外，不存在抑制效应，如在质谱中存在的抑制效应。
83.存在许多gc-mrr波谱的能力是高度有用的应用。这些应用包含代谢组学、天然产物筛选和环境分析等。举例来说，考虑以下环境降解研究。
84.同位素组成的变化的确定用于评估有机饲料/污染物在地面和天然水生系统中的生物和非生物反应。鉴于几乎所有有机污染物含有多种稳定的同位素物种，化合物特异性同位素分析(csia)和位置特异性同位素分析(psia)提供广泛适用的方法来研究复杂基质中的化学反应并且提供对污染物降解的更好理解。这种降解可以通过酶途径或通过由取代、消除或电子转移组成的光化学或有机反应发生。
85.csia通过精确定位给定痕量污染物分子中的反应性原子而提供对降解途径的更深入的见解。目前，这些问题通过碳、氢和氮的同位素比质谱来解决，但是氧、硫和氯的同位素比质谱测量是困难的。类似地，psia检查分子内同位素变化。规地，psia(对于碳)是通过将官能团离线转化成二氧化碳，随后进行gc-ms，或可替代地进行位点特异性天然同位素分馏-核磁共振(snif-nmr)来完成的。nmr是耗时、低灵敏度的技术。因此，在nmr测量之前，痕量化合物的显著预浓度是需求。相比之下，gc-mrr可以解决csia和psia的这些挑战性情况，而无需柱后转化或纯化。
86.使用gc-mrr研究环境降解的实例涉及吡啶同位素体的稀释样品的选择性生物耗尽。虽然已经广泛地研究了吡啶和其它有机碱的微生物代谢，但是据我们所知，不存在同位素特异性研究。表1示出了
14
n和
15
n吡啶标准物在三种不同的微生物培养物/溶液中的生物耗尽的gc-mrr结果。在这些情况下，两种吡啶同位素体都随着时间的推移而耗尽。大肠杆菌(e.coli)培养物示出了
14
n吡啶同位素体的选择性耗尽，而洋葱芽孢杆菌(b.cepacia)和地下水未示出显著的区别。已经注意到对于无机氮源的动力学同位素分馏，并且已经将其用于提供对除草剂的生物和酶水解的见解。
87.表2清楚地示出了两种不同细菌对乙腈的各种同位素体的生物耗尽的不同动力学。数据显示，两种不同细菌对乙腈的各种同位素同位素体的生物耗尽的不同动力学。正常物种的乙腈被大肠杆菌以最快速率耗尽，其中在三种单独取代的同位素体之间没有可检测的区别。更有趣的事实是，对于费氏弧菌(v.fischeri)，ch
313
cn同位素体被选择性地耗尽。没有其它分析方法或方法的组合能够如此容易地表征这些现象。关于位置特异性同位素分析的这些类型的广泛研究对于生物降解研究是极其信息丰富的，并且由于缺乏合适的分析工具而目前未得到充分探索。gc-mrr解决了这一缺乏。
[0088][0089]
表1：如通过gc-mrr确定的吡啶和乙腈的不同同位素的选择性微生物耗尽。误差为大约2.5％。
[0090][0091]
表2：如通过gc-mrr确定的乙腈的不同同位素的选择性微生物耗尽，这对于异构同位素体(
13
ch3cn和ch
313
cn)而言通过任何其它现有的gc方法是不可能的。
[0092]
液相色谱(lc)-mrr波谱
[0093]
图9示出了液相色谱(lc)-mrr波谱系统900，其中液相色谱仪910联接到mrr波谱仪920，如被配置成用于宽带和/或目标测量的微波或毫米波mrr波谱仪。液相色谱仪910包含柱914，所述柱通过入口916，例如从连续流动的样品源接收液体分析物。从溶剂源912流出的溶剂推动液体分析物穿过柱914，其中分析物至少部分分离成其组成组分。
[0094]
挥发接口930将至少部分分离的分析物组分联接到mrr波谱仪920中。所述挥发接口使分析物组分挥发，例如，挥发接口可以加热分析物组分直到其蒸发。来自载气源934的如氖气或氦气等载气推动挥发的分析物通过挥发接口930并到达联接到挥发接口930的脉冲射流超声波喷嘴932。喷嘴932将挥发的分析物组分注入到mrr波谱仪的测量室924中，所述测量室被真空泵925抽空至真空压力(例如，10
–6托)。类似于图3a中的微波源(未示出)的微波源用一个或多个目标或宽带激励脉冲照射测量室中的分析物组分。类似于图3a中的接收器(未示出)的接收器检测由挥发的分析物组分响应于激励脉冲发射的fid信号。电子装置(未示出)检测并处理fid信号以产生mrr波谱。mrr波谱可以连续地或按需测量，例如，响应于由辅助检测器感测的检测到lc柱输出中的峰。
[0095]
用gc-mrr波谱进行的手性分析
[0096]
手性分析是gc-mrr可以具有显著的附加值的领域，特别是使用称为手性标记的气相络合技术以在mrr中将对映异构体转化成非对映异构体进行手性分析。已经显示，少量的小的、挥发性的手性分子有效地与宽范围的化学分析物复合，并且允许精确确定混合物内的这些化合物的对映异构体过量。关于手性标记的更多信息，参见例如题为“用于手性分析
的腔增强傅里叶变换波谱(cavity-enhanced fourier transform spectroscopy for chiral analysis)”的美国预授权的公开第2019/0302015号，所述美国预授权的公开通过引用整体并入本文。
[0097]
图10a和10b示出了手性标记背后的想法。简而言之，手性标记涉及用具有已知立体化学的小手性分子(如图10a中的马鞭草烯酮/丁炔醇系统)“标记”分析物。在脉冲超声波膨胀喷嘴中，可以有效地形成通过氢键合、范德华力(van der waals)和其它力的组合稳定的弱结合复合物。所得非对映异构体复合物具有不同的惯性矩并且可以通过如上所述的并且图10b中所示的mrr波谱的能量来解析。手性分析在广泛的应用范围(包含药物、环境分析和代谢物分析)中很重要。
[0098]
更具体地，图10a示出了马鞭草烯酮(示例手性分子)的对映异构体具有相同的mrr波谱，因为所述对映异构体具有相同的惯性矩。然而，当手性标签(在这种情况下，(s)-3-丁炔-2-醇)与两种对映异构体复合时，产生惯性矩的差异，这产生具有不同惯性矩以及因此不同的mrr波谱的两种物种。这两种复合物被称为异手性的(即，(r,r)-马鞭草烯酮+(s)-3-丁炔-2-醇)或同手性的(即，(s,s)-马鞭草烯酮+(s)-3-丁炔-2-醇)。
[0099]
图10b示出了两条波谱谱线，图10a中的异手性复合物或同手性复合物中的每一个的波谱谱线。在丁炔醇标签的外消旋混合物的情况下，观察到两种复合物的强度大致相等(这两种复合物由于复杂的偶极矩、形成比率和其它因素而不同)。用纯(s)-3-丁炔-2-醇作为标签，观察到不同强度的谱线。这些谱线比率可以用于计算样品中的马鞭草烯酮的对映异构体比率和/或对映异构体过量。
[0100]
手性监测可以集成到具有附属系统的gc-mrr仪器中，所述附属系统用于在脉冲射流采样源之前在gc出口的接口处通过另外的阀引入气相手性标签。标签可以与洗脱样品在柱后混合。波谱库可以包含参考手性分子(手性标签)的条目。这种手性mrr方法可以用来代替手性gc分离或与其结合使用，从而开辟了一系列新的分离和鉴定能力。
[0101]
结论
[0102]
尽管本文已经描述和展示了本发明实施例，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得这些结果和/或这些优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一个被认为在本文中描述的本发明实施例的范围内。更一般来讲，本领域的技术人员将容易了解到，本文中描述的所有参数、尺寸、材料以及配置意味着是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教导所用于的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或者能够确定本文描述的具体的本发明实施例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例是仅通过实例方式来介绍的，并且在所附权利要求和其等效物的范围内，本发明实施例可以按与具体描述和要求不同的方式来实践。本公开的本发明实施例涉及本文中描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、成套工具和/或方法。另外，如果两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、成套工具和/或方法的任何组合并不相互矛盾，则这样的特征、系统、物品、材料、成套工具和/或方法被包含在本公开的本发明范围内。
[0103]
另外，各种发明概念可以体现为其实例已被提供的一种或多种方法。作为所述方法的一部分而执行的动作可以以任何适当方式排序。因此，可以构造这样的实施例，在所述实施例中，动作以与所示出的顺序不同的顺序执行，其可以包含同时执行一些动作，即使所
述动作在说明性实施例中被示出为连续动作。
[0104]
本文中定义和使用的所有定义都应当理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文档中的定义和/或定义术语的普通含义。
[0105]
除非明确作出相反指示，否则如本文在说明书中和权利要求中使用的，不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应当理解为意指“至少一个/种”。
[0106]
如本文在说明书中和权利要求中使用的，短语“和/或”应当理解为意指这样联合的要素中的“任一个或两个”，所述要素即在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个”。除了由“和/或”从句具体标识的要素之外，其它要素可以任选地存在，无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当连同开放式语言如“包括”使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施例中可以指仅a(任选地包含除了b之外的要素)；在另一个实施例中指代仅b(任选地包含除了a之外的要素)；在又另一个实施例中指代a和b两者(任选地包含其它要素)等。
[0107]
如本文中在本说明书和权利要求中所使用的，“或”应当被理解为具有与如上所定义的“和/或”的含义相同的含义。例如，当将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个要素，但还包含多于一个要素以及任选地另外的未列出的项。仅仅明确地指示相反的术语，如
“…
中的仅一个”或
“…
中的恰好一个”或者在权利要求中使用时，“由
…
组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语，如“任一个”、
“…
之一”、
“…
中的仅一个”、或
“…
中的恰好一个”时，本文中使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代品(即，“一个或另一个、而不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由
…
组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
[0108]
如在本说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应当被理解为是指选自要素列表中的任一个或多个要素的至少一个要素、但不一定包含要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素，而无论是否与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一个”(或等效地“a或b中的至少一个”或等效地“a和/或b中的至少一个”)在一个实施例中可以指至少一个(任选地包含多于一个)a，而不存在b(并且任选地包含除了b之外的要素)；在另一个实施例中指至少一个(任选地包含多于一个)b，而不存在a(并且任选地包含除了a之外的要素)；在又一个实施例中指至少一个(任选地包含多于一个a)和至少一个(任选地包含多于一个)b(并且任选地包含其它要素)等。
[0109]
在权利要求以及以上说明书中，所有过渡性短语，如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由
…
组成”等应被理解为是开放式的，即是指包含但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述的，仅过渡短语“由
…
组成”和“基本上由
…
组成”应分别是封闭式或半封闭式过渡性短语。