用于检测样品中的分析物的装置及其使用方法

用于检测样品中的分析物的装置及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月3日提交的美国申请号62/882,481和2020年3月4日提交的美国申请号62/985,015的优先权，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
发明领域
3.本发明涉及用于检测样品中目的分析物的装置和方法。
4.发明背景
5.医学诊断测试方法是病理状况早期检测的关键筛查工具。早期检测允许在更有可能成功治疗的阶段识别此类状况。早期治疗还经常涉及破坏性较小或侵入性较小的治疗方法，并减少对患者的影响。除了常规筛查外，诊断测试还用于多种其他应用，包括活检分析和监测正在进行的医学治疗结果。
6.可从样品中获得的诊断信息量的限制包括可获得且易于操作的样品大小、执行多个测试所需的处理时间、在不丢失信号的情况下样品在多个处理步骤中的耐受性，以及执行多种分析方法的成本。通常，成本是诊断装置的限制因素。例如，神经成像技术价格昂贵，并且需要复杂的仪器和临床环境，生化分析缺乏灵敏度并且需要繁琐的准备步骤、昂贵的标签和操作时间。已经提出电化学技术作为检测的无标记备选。然而，由于肽在电极表面的非特异性吸附以及某些分析物中其他电活性基团的电化学干扰，这种检测方法的选择性较差。有机电化学晶体管(oect)已用于检测特定种类。对于特定种类的检测，oect通道或栅电极应使用生物识别元件(如核苷酸或蛋白质)进行功能化。通过这种功能化途径，oect可以检测ph、金属阳离子、代谢物、神经递质、病原体和抗体，以及疾病特异性抗原和蛋白质。然而，微米级oect表面的生化修饰缺乏所需的精度，并且非常复杂且成本高效益低。还已知识别单元的固定导致下面的电子材料退化，损害晶体管的固有增益。此外，由于表面上有这种直接的生物涂层，所述装置通常是一次性使用的，尽管成本很高。
7.本领域仍然需要用于分析样品的改进程序，以及用于这种方法的组合物和制品。
8.本发明的目的是提供用于检测样品中分析物的存在和/或量化分析物的装置。
9.本发明的另一个目的是提供用于检测和/或定量样品中的分析物的方法。
10.本发明的其他目的是提供用于检测和/或定量样品中的分析物的试剂盒。
11.发明概述
12.提供了用于检测怀疑含有分析物的样品中的分析物的装置。所述装置包括生物功能化、纳米结构化、等孔膜(bnim)集成的有机电化学晶体管(oect)，在此为bnim-oect，用于快速和灵敏地检测样品中目的分析物的存在。oect包括源电极、漏电极、通道和栅电极。膜(即bnim)与oect通道在物理上是分离的，因此电子装置可以多次使用。该装置的设计所呈现的一个主要优点是oect可以与具有识别部分(即结合配偶体)功能化的膜集成，所述识别部分捕获其他目的生物标志物/分析物，使得oect不再化学功能化以包括任何识别部分(即结合配偶体)。传感机制基于1)将生物标志物/分析物捕获到等孔膜上2)捕获的生物标志物/分析物堵塞膜的孔和3)堵塞的孔改变晶体管电流。这个概念可用于感知样品中的任何
分析物/生物标志物，只要膜具有识别所述分析物/生物标志物的正确生物识别单元。因此，优选将等孔膜进行功能化以包括用于被检测分析物的结合配偶体。在特别优选的实施方案中，基于其大小来选择结合配偶体，使得结合配偶体小于等孔膜中的孔。等孔膜优选是聚合的，并且在特别优选的实施方案中，其由嵌段共聚物聚(苯乙烯-b-4-乙烯基吡啶)、ps-b-p4vp制成。
13.所公开的bnim-oect可用于检测样品，优选生物样品，例如血液、血清、脑脊液、唾液等中分析物的存在。通过其检测生物样品中分析物的能力，所公开的bnim-oect可通过以下用于疾病检测，优选地，早期疾病检测：使用与疾病相关的分析物的结合配偶体使bnim-oect功能化，从怀疑患有所述疾病的受试者收集生物样品，并将收集到的生物样品应用到bnim-oect，其中由于分析物与等孔膜上其结合配偶体结合而导致的通道电流减少用于检测样品中分析物的存在。在优选的实施方案中，所述装置使用刚果红(congo red)作为结合配偶体来结合从受试者获得的生物样品中的β淀粉样蛋白聚集体而用于阿尔茨海默氏病的早期检测。在其他实施方案中，样品不是生物样品。它可以是来自任何来源的样品，只要所述样品包含待检测的分析物。
14.还提供了包括用于执行所公开的检测方法的所公开装置和试剂的试剂盒。
15.附图简述
16.图1a-1e显示了纳米结构化的等孔膜的功能化和表征。(图1a)ps-b-p4vp膜的sem图像。比例尺为500nm。(图1b)用aptes对ps-b-p4vp膜进行分子功能化以在表面上产生氨基封端基团并随后通过ga接头固定cr的示意图。在其用aptes(nh
2-功能化膜)和cr(cr-功能化膜)修饰后的膜的高分辨率s2p(图1c)、n1s(图1d)和o1s(图1e)xps光谱。图1f是刚果红修饰后的等孔膜的sem图像。
17.图2a-2c显示了oect生物传感器的配置和特性。(图2a)在膜上的结合事件后，受损的阳离子漂移到pedot:pss通道中。将cr功能化膜放置在通道和电解质溶液之间。oect在与功能化膜集成之前和之后以及在将膜与aβ聚集体溶液(pbs,22.1nm)温育时的转移特性(图2b)和瞬态特性(图2c)。通道的宽度为10μm，长度为100μm。对于瞬态，vg＝0.1v，长度为15ms。图2d-g显示了结合事件后传感层的表面表征。图2d显示了cr功能化膜在与aβ聚集体溶液(pbs中22.1nm)温育后的3d呈现。比例尺为400nm。结合事件之前和之后cr功能化表面的高分辨率c1s(图2e)、n1s(图2f)和o1s(图2g)xps光谱。图2h-2j显示了在添加膜(无膜)之前、添加功能性膜之后(有膜)和分析物吸附在后者之后(有aβ聚集体)pedot:pss通道的cv曲线(图2h)、阻抗相位(图2i)和奈奎斯特图(nyquist plot)(图2j)。在含有10mm(fe(cn)6)
3-的pbs(ph 7.4)中获得cv曲线和阻抗电化学光谱。图2k-2m显示了在cr功能化膜集成之前(图2k)和之后(图2l)以及在与aβ聚集体结合事件之后(图2m)oect的输出特性。电解质为10mm pbs，栅电极为ag/agcl。
18.图3a-3c显示了传感器对aβ聚集体的剂量曲线和特异性。与cr功能化膜(图3a)和裸ps-b-p4vp膜(图3b)集成的oect通道的传输特性。每个膜都暴露于不同浓度的aβ聚集体溶液(从2.21pm到221nm)。(图3c)这些装置对aβ聚集体的电流响应。黄色曲线显示了生物传感器(即与cr功能化膜集成的oect)对aβ肽的响应。误差条表示来自在-0.6v的vd和0v的vg下运行的至少三个通道的测量结果的sd。
19.图4a-4b显示了oect生物传感器在复合培养基中的特异性和选择性。(图4a)oect
对pbs中的aβ聚集体(aβ：22.1nm)和潜在干扰物(葡萄糖：10mm；白蛋白：3.5mg/ml)以及商业人血清样品中的aβ聚集体的响应。蓝色和红色条分别代表pbs和血清样品，作为培养基。(图4b)用于体外分析在人血清样品中掺加(spiked)的aβ聚集体的oect生物传感器的转移曲线，以及相应的校准图。对于(a)和(b)的插图，误差条表示来自在-0.6v的vd和0v的vg下运行的至少三个通道的测量结果的sd。
20.图5a-5d显示了在晶体管通道的源极和漏电极触点之间流动的pedot:pss薄膜的电流。在膜集成之前(没有膜)和之后以及在用aβ聚集体进行传感测量之后观察到相同的电流(图5a)。通道的电流在与三种不同的膜集成后不改变。一旦装置已经运行并且已经获得i-v曲线(图5b)，就将膜一个接一个地拆开。典型oect(图5c)和膜集成oect(图5d)在连续方形脉冲超过15分钟时的操作稳定性。
21.图6显示了oect对pbs中玻璃珠(0.1μg/ml)和aβ聚集体(22.1nm)的响应。误差条表示从三个通道收集的数据的sd。
22.图7a-7e是说明使用聚对二甲苯-c剥离工艺通过光刻法制造oect的示意图。
23.图8a是显示在玻璃基板上以阵列形式图案化的源电极和漏电极以及通道的配置的示意图。图8b是图8a中描绘的源电极和漏电极以及对应的通道之一的放大图。
24.图9a是显示oect阵列配置的示意图。图9b是与图9a中描绘的通道连接的一对源电极和漏电极的侧视图。图9c是在图9a中描绘的具有置于顶部的bnim的栅电极的侧视图。图9d是用图9a中描绘的aβ-42抗体功能化的栅电极的侧视图。图9e是用图9a中描绘的aβ-40抗体功能化的栅电极的侧视图。
25.图10是显示oect的转移曲线图，所述oect包含与微流体集成的pedot:pss通道用于检测aβ聚集体。
26.图11a-11b是显示含有p(g0t2-g6t2)通道(图11a)的oect和含有p-90通道(图11b)的oect用于检测aβ聚集体的转移曲线的图。
27.发明详述
28.i.定义
29.如本文所用，“分析物”或“目的分析物”是指可以被分析物特异性结合剂结合的任何分子。
30.如本文所用，“分级膜”是指具有表面等孔层和本体/支撑层的膜，其中本体层可具有不对称孔隙率。
31.如本文所用，“等孔的”是指具有窄孔径分布的膜表面层。
32.使用术语“约”旨在描述高于或低于所述值约+/-10％范围内的值；在其他实施方案中，所述值可以在高于或低于所述值约+/-5％范围内；在其他实施方案中，所述值可以在高于或低于所述值约+/-2％范围内；在其他实施方案中，所述值可以在高于或低于所述值约+/-1％范围内。前述范围旨在通过上下文变得清楚，并且不暗示进一步的限制。
33.ii.组合物
34.公开了用于检测样品中分析物的装置，其整合了生物功能、纳米结构化、等孔膜(bnim)和有机电化学晶体管(oect)，在此为bnim-oect，用于快速灵敏地检测样品中已知分析物的存在。
35.通过选择用于本文所公开的等孔膜和有机电化学晶体管的材料，采用所公开组件
的装置已表现出高达260μa/dec的超级灵敏度。下面的实施例证明示例性装置优于先前报道的系统，并在相关肽淀粉样蛋白-β(aβ)浓度的灵敏度和检测范围方面展示出最佳的报道性能，具有延长的保质期和提高的操作稳定性。
36.如本文所用，“保质期”是指oect在电化学信号变化小于约5％的情况下保持其检测灵敏度的能力。“延长的保质期”是指oect在重复使用3次后电化学信号变化小于约5％的情况下保持其检测灵敏度的能力。本文使用的“操作稳定性”是指oect在受到栅电极电压压力时保持其漏电极电流的能力。“提高的操作稳定性”用于指oect在栅电极受到5秒长的连续方形电压脉冲压力至少15分钟时保持其漏电极电流的能力(即漏电极电流的变化小于约5％)。
37.a.等孔膜
38.可以整合到本文公开的装置中的等孔膜可以由适合制造等孔膜的任何材料制成。等孔膜优选是聚合的，并且在特别优选的实施方案中，其由嵌段共聚物制成。嵌段共聚物是由两个或多个聚合单体嵌段组成的聚合物。所公开的等孔膜优选地被功能化以包括用于被检测分析物的结合配偶体。例如，其中目的分析物是aβ聚集体时，则膜被功能化以包括结合配偶体，例如刚果红。然而，任何结合配偶体都可以附着在膜的表面上，选择的结合配偶体在尺寸上小于膜的等孔层的孔。结合配偶体可以是例如识别所需分析物的适体。如在分析物特异性结合剂的上下文中使用的“适体”可以是短的单链核酸分子，例如能够结合分析物或肽适体的rna、dna、分子或本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式。肽适体是能够特异性结合蛋白质、多肽或肽的包含特定氨基酸序列的适体。通常，肽适体具有肽环，包含例如10至20个氨基酸。
39.用于进化与目的分析物结合的适体的方法在本领域中是已知的。在rusccito,等人,front chem.,4:14(2016)中概述了针对小分子进化的适体，包括z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮(dfhbi)、17β-雌二醇、17β-雌二醇、黄曲霉毒素b1、b2和m1、类毒素(anatoxin)-a、阿特拉津(atrazine)、苄基鸟嘌呤、双鞭甲藻毒素(brevetoxin)-2、除草定(bromacil)、cd(ii)、丹氟沙星(danfloxacin)、伏马菌素(fumonisin)b1、卡那霉素a、卡那霉素a、氯胺酮(ketamine)、麦角胺(lysergamine)、马拉硫磷(malathion)、甲基苯丙胺、n-甲基、埃希卟啉(esoporphyrin)(nmm)、赭曲霉毒素(ochratoxin)a.、冈田酸(okadaic acid)、冈田酸、有机磷杀虫剂、土霉素(oxytetracycline)、pd ii、多氯联苯、多氯联苯、孕酮、t-2毒素、戊唑醇(tebuconazole)、抗倒胺(inabenfide)和苯噻草胺(mefenacet)。ota-sense是由neoventures biotechnology inc.开发的基于适体的传感技术，用于检测赭曲霉毒素a(ota)，这是由生长在农产品，包括但不限于葡萄、干果、谷物、咖啡等上的真菌(曲霉(aspergillus)和青霉(penicillium)种类)产生的毒素。ota是最常见的真菌毒素之一，具有已知的致癌特性。用于检测循环肿瘤细胞的适体在本领域中是已知的并且被公开于例如tasi等人，biomicrofluidics，11(3):034122(2017)中。
40.在一些实施方案中，结合配偶体可以是抗体、有机分子或碳水化合物。识别所需分析物的抗体、有机分子和碳水化合物是本领域技术人员已知的，例如，在https://www.invivogen.com/antibodies-list,baltzer,analytical and bioanalytical chemistry,400(6):1653-1664(2011),和galanina,等人,analytical biochemistry,265
(2):282-289(1998)。
41.在一些实施方案中，等孔膜是分级膜。在特别优选的实施方案中，结合配偶体基于其尺寸进行选择，使得所述结合配偶体小于等孔膜中的孔，例如，对于分级膜，小于在分级膜的至少一个表面上的孔。此类膜是通过嵌段共聚物的自组装和非溶剂诱导的相分离形成的，即由于浸入非溶剂浴中引起的宏观相分离和由于嵌段共聚物的自组装引起的微相分离的组合。后者导致高度有序的表面层的形成。
42.具有等孔表面的分级膜例如公开于2014/0217012中，其公开了通过形成薄膜产生具有等孔表面的膜，所述薄膜包含具有氢键嵌段的多嵌段共聚物(例如，聚((4-乙烯基)吡啶、聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(环氧乙烷)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(丙烯酸)和聚(羟基苯乙烯))，其可以使用包含多嵌段共聚物和溶剂系统(例如，1,4-二噁烷)的沉积溶液在基板上自组装；从薄膜中除去至少部分溶剂系统；以及使来自步骤b)的薄膜与相分离溶剂体系接触，以便形成等孔分级膜。由该方法得到的薄膜具有可识别的表面层和可识别的本体层。在表面层和本体层之间有可识别的过渡层。过渡层具有兼具表面层和本体层的特征的结构。表面层、过渡层和本体层形成连续薄膜。
43.在上面公开的分级膜中，表面层可以具有从20nm到500nm的厚度，包括到nm到其间的所有值。表面层具有延伸穿过表面层深层的多个孔。所述孔可以具有诸如圆柱形、圆锥形和/或螺旋形的形态。所述孔可具有3nm至100nm的大小(例如直径)，包括到nm和其间范围内的所有值，例如，5nm到100nm、5nm到95nm、5nm到15nm、10nm到90nm、15nm到85nm、20nm到80nm、20nm到70nm、25nm到75nm、30nm到70nm、35nm到65nm nm，或40nm到60nm之间。在一些实施方案中，分析物在其发展的不同阶段可以具有不同的大小。例如，aβ聚集体呈寡聚形式时具有在5nm到15nm之间的大小，呈原纤维形式时具有在20nm到70nm之间的大小。选择孔的大小因此可以检测其发展的不同阶段的aβ聚集体。
44.表面层可以具有一定范围的孔密度。例如，表面层孔密度可以是从1x 10
14
个孔/m2到1x10
15
个孔/m2。表面层是等孔的，即孔具有窄孔径分布。例如，窄孔径分布(定义为最大孔直径与最小孔直径之比(d
max
/d
min
))可以为1到3，包括0.1和其间范围内的所有值。在多个实施方案中，(d
max
/d
min
)是1、1.5、2、2.5或3。在实施方案中，等孔表面层具有至少1
×
10
14
孔/m2的孔密度和小于3的孔径分布(d
max
/d
min
)。
45.美国专利号9,914,099中还公开了具有“分级”形态的膜，所述专利公开了具有等孔表面层和支撑层的聚合物膜。顶层具有自组装等孔形态的等孔膜，而通过斯皮诺达分解的宏观相分离导致远离膜表面形成较大的孔。这个过程被称为嵌段共聚物的自组装和非溶剂诱导的相分离。
46.本体/支撑层可以具有一定范围的厚度。例如，本体层的厚度可以为5微米到500微米，包括到微米和其间范围内的所有值。本体层中的孔的大小(例如直径)可以是10nm到100微米。在一些实施方案中，表面中的孔小于本体层中的孔。本体层可以具有不对称结构。例如，所述层可以具有海绵状或指状结构。从该层的顶部(例如，与表面层接触的表面)移动到该层的底部(例如，自由表面)，孔的大小增加。例如，本体层可以在本体层的顶部(与表面层接触的层)具有大小为10nm的孔，并且在本体层的底部孔的大小增加到100μm。通过膜的深度(例如，从与表面层接触的本体膜的表面到与基板接触的薄膜的表面)移动的孔径的增加
提供了不对称结构。该本体层是因薄膜接触(例如，浸入)非溶剂浴(例如，nips工艺)而形成的。
47.具有调节孔径的自组装等孔嵌段共聚物膜，例如yu等人，angew chem int ed engl.，53(38):10072-6(2014)中公开的那些。可以将孔径精确地控制在3到20nm之间，导致可调节的尖锐大小区分。
48.i.膜材料
49.合适的材料包括但不限于铝(铝的电解氧化)、聚合物，包括均聚物、共聚物，例如嵌段共聚物。多嵌段共聚物可具有一定范围的多分散性(mw/mn)。例如，多嵌段共聚物可具有1.0至2.0的多分散指数(pdi)，包括0.1和其间范围内的所有值。希望多嵌段共聚物具有1至1.4的pdi。
50.优选的嵌段聚合物包括聚(苯乙烯-b-4-乙烯基吡啶)、ps-b-p4vp、ps-b-p2vp(聚苯乙烯-b-聚-2-乙烯基吡啶)和ps-b-peo(聚苯乙烯-b-聚环氧乙烷)。
51.合适的二嵌段共聚物的其他实例包括聚(苯乙烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(苯乙烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(苯乙烯)-b-聚(羟基苯乙烯)、聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚((4-乙烯基)吡啶)、聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)、聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(羟基苯乙烯)、聚(异戊二烯)-b-聚((4-乙烯基)吡啶)、聚(异戊二烯)-b-聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(异戊二烯)-b-聚(环氧乙烷)、聚(异戊二烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(异戊二烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(异戊二烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(异戊二烯)-b-聚(羟基苯乙烯)、聚(丁二烯)-b-聚((4-乙烯基)吡啶)、聚(丁二烯)-b-聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(丁二烯)-b-聚(环氧乙烷)、聚(丁二烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丁二烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(丁二烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)和聚(丁二烯)-b-聚(羟基苯乙烯)。
52.合适的三嵌段共聚物的实例包括聚(异戊二烯-b-苯乙烯-b-4-乙烯基吡啶)、聚(异戊二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚((4-乙烯基)吡啶)、聚(异戊二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(异戊二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)、聚(异戊二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(异戊二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(异戊二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(异戊二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(羟基苯乙烯)、聚(异戊二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚((4-乙烯基)吡啶)、聚(异戊二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(异戊二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)、聚(异戊二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(异戊二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(异戊二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚((4-乙烯基)吡啶)、聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)、聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基)甲基丙烯酸酯)、聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(羟基苯乙烯)、聚(丁二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚((4-乙烯基)吡啶)、聚(丁二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚((2-乙烯基)吡啶)、聚(丁二
烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)、聚(丁二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丁二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)、聚(丁二烯)-b-聚(α-甲基苯乙烯)-b-聚(二甲基乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯)和聚(丁二烯)-b-聚(苯乙烯)-b-聚(羟基苯乙烯)。
53.ii.表面功能化
54.等孔膜优选地被功能化以包括用于被检测分析物的结合配偶体。在特别优选的实施方案中，结合配偶体基于其大小进行选择，使得结合配偶体小于等孔膜中的孔，即膜的等孔表面上的孔。在一个特别优选的实施方案中，膜被功能化以在膜表面上引入氨基封端基团，然后可以通过交联剂如戊二醛将其交联到含有氨基的结合配偶体(例如刚果红、肽适体、肽等)。例如，如实施例中所示，优选通过与3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应将氨基引入膜的表面上。例如，在erli等人，clinical chemistry，50(10)：1819-1821(2004)中描述了核酸在纳米孔膜上的定位。在kumar等人，journal of membrane science(2017)529 185-194公开了半胱氨酸表面修饰的等孔膜。
55.b.有机电化学晶体管(oect)
56.所公开的装置包括分子功能化的、优选纳米结构化的和等孔的膜及其与高增益、离子-电子转换装置oect的集成。本文可以使用的oect是包括源电极、漏电极、通道和栅电极的三端装置。源电极和漏电极分开放置并通过相应的通道电连接。在一些实施方案中，源电极、漏电极和通道可以在诸如玻璃基板、硅基板或塑料基板的支撑基板上图案化。栅电极与源电极、漏电极和通道分开放置，以防止栅电极和通道之间的电子流动。通道与测量(电解质)溶液直接接触，栅电极也浸入其中。通过将等孔膜垂直插入在通道和电解质之间，可以将等孔膜与微型oect集成。由于膜选择性地捕获溶液中的分析物，因此分析物固定在其表面，因为与表面层中的孔相比，它们的大小更大。在图2a中举例说明典型的bnim-oect装置。所述装置可以整合到微流体配置中。
57.在一些实施方案中，oect含有多个可独立寻址的源电极和漏电极、相应的通道和用于同时检测多种分析物的一个或多个栅电极。在这样的配置中，每个通道都具有放置在上面的相应的bnim，其含有用于被检测分析物的结合配偶体。在一些实施方案中，相应的bnim可以具有相同或不同的孔径。例如，一个或多个相应的bnim可以具有第一孔径，例如5nm到15nm之间，并且至少一个相应的bnim具有第二孔径，例如20nm到70nm之间。具有不同孔径的相应的bnim可以用相同或不同的结合配偶体进行功能化。
58.通道通常由离子可渗透的有机电子材料制成，孔或电子通过所述材料从源电极流到漏电极。oect依赖于从电解质注入离子渗透性有机电子材料中的离子，从而改变其掺杂状态，并且因此改变其导电性。oect的操作由施加到栅电极(栅电极电压，vg)和漏电极(漏电极电压，vd)的电压控制，所述电压参考源电极。漏电极电压诱导与通道中可移动的孔或电子的数量成比例的电流(栅电极电流，id)，并因此探测有机电子材料的掺杂状态。栅电极电压控制离子注射到通道，并因此控制有机电子材料的掺杂状态，导致id发生变化。
59.oect中的掺杂变化发生在通道的整个体积上，这是因为注射电解质离子的无障碍地渗透到有机通道的本体中，引起其中的载流子密度的大幅调控。所述装置将电解液中的小离子流转化为来自通道的大电读数。因此，转换事件与放大偶联，并赋予oect在低电压(《1v)下的高增益。
60.i.源电极和漏电极
61.源电极和漏电极由能够传导电流的材料制成。电极材料本质上可以是有机的或无机的，只要它能够通过材料传导电子。电极可以是聚合物电极、金属电极、半导体、碳基材料、金属氧化物或修饰电极。在一些实施方案中，源电极和漏电极由诸如金、铂或碳的导电形式的电化学惰性材料制成，以防止在操作时与电解质溶液接触时发生电化学腐蚀。在一些实施方案中，电极是金电极，其部分涂覆有额外的绝缘层，例如parylene c。
62.在一些实施方案中，电极由金属导体制成。合适的金属导体包括但不限于金、铬、铂、铁、镍、铜、银、不锈钢、汞、钨和适用于电极构造的其他金属。金属导体可以是由上述金属的组合制成的金属合金，例如金/铬。此外，作为金属导体的导电基板可以由由金、钴、金刚石和其他合适金属制成的纳米材料构成。
63.在其他实施方案中，电极由碳基材料制成。示例性的碳基材料是导电聚合物(薄膜或纤维的形式)碳布、碳纸、碳丝网印刷电极、碳纸、炭黑、碳粉、碳纤维、单壁碳纳米管、双壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纳米管阵列、金刚石涂层导体、玻璃碳和中孔碳。此外，其他示例性的碳基材料是石墨烯、石墨、未压缩的石墨蠕虫、分层的纯化片状石墨、高性能石墨和碳粉、高度有序的热解石墨、热解石墨和多晶石墨。
64.电极可以是半导体。合适的半导体由硅和锗制成，其可以与其他元素掺杂(即为了调节其电学和结构特性目的而有意将杂质掺入本征半导体)。半导体可以掺杂有磷、硼、镓、砷、铟或锑，或其组合。
65.其他电极材料可以是金属氧化物、金属硫化物、主族化合物和修饰材料。这种类型的示例性材料是纳米多孔氧化钛、氧化锡涂层玻璃、玻璃、氧化铈颗粒、硫化钼、氮化硼纳米管、用导电材料例如金修饰的气凝胶、用导电材料如碳、钌碳气凝胶修饰的溶胶凝胶(solgel)和用导电材料如金修饰的中孔二氧化硅。
66.在一些实施方案中，电极含有一种或多种导电材料。在其中电极含有两种或更多种导电材料的实施方案中，第一导电材料可以是导电聚合物并且第二导电材料可以是上面公开的材料。导电聚合物包括但不限于聚(氟)、聚亚苯基、聚芘、聚薁、聚萘、聚(吡咯)、聚咔唑、聚吲哚、聚氮杂聚苯胺、聚(噻吩)、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)、聚(对苯硫醚)、聚(乙炔)、聚(对苯乙炔)和聚酰亚胺。第二导电材料可以溅射涂覆在导电聚合物的顶部，两者的聚集体构成导电基板。优选的导电基板是涂覆cr/au的kapton(聚酰亚胺)薄膜溅射。
67.源电极和漏电极可以是任何合适的形状，例如矩形、正方形、圆形和圆柱形。在优选的实施方案中，电极是矩形金电极，其具有涂覆parylene c的部分。
68.ii.通道
69.通常，配置通道以在一对源电极和漏电极之间建立电化学连接，使得孔或电子从源电极流向漏电极。
70.通道通常由离子可渗透的有机电子材料制成，例如在rivnay,等人,nature reviews,3:17086(2018)和sun,等人,j.mater.chem.c,6:11778-11784(2018)中公开的导电聚合物。用于通道的示例性导电聚合物是掺杂有聚(苯乙烯磺酸酯)(pedot:pss)的聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)。导电pedot是p型掺杂(氧化)的，其导致可移动的空穴可以从一条链跳到另一条链，一旦施加漏电极电压就会产生空穴电流。这些空穴由pss的磺酸根阴离子补偿。由pedot:pss制成的通道可以在耗尽模式oect下工作。例如，在没有栅电极电压的情况
下，空穴电流在通道中流动。一旦施加正栅电极电压，来自电解质的阳离子被注入通道并且阴离子得到补偿，导致通道中的空穴数量减少。这导致漏电极电流减小。或者，通道可以由在累积模式oect下工作的材料制成，例如基于聚噻吩的半导体，其磺酸基团通过己基链附着到主链上(pths)(inal,等人,adv.mater.,26:7450-7455(2014))。在累积模式oect中，施加负栅电极电压引起阴离子注入通道和相应的空穴累积，导致漏电极电流增加。
71.用于oect通道的活性聚合物不限于pedot:pss。用于通道的其他合适的导电聚合物包括但不限于基于具有侧链磺酸基的pedot(pedot-s)的导体、掺杂甲苯磺酸酯的pedot(pedot:tos)、pedotoh:clo4、pedot-co-pedotoh:clo4(schmode,等人,chem.mater.,31(14):5286-5295(2019))、聚(2-(3,3
′‑
双(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基))-[2,2
′‑
并噻吩]-5-基)噻吩并[3,2-b]噻吩)p(g2t-tt)、聚((乙氧基)乙基-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酸酯)-萘-1,4,5,8-四羧酸-二酰亚胺-共-3,3
′‑
双(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-(并噻吩))p(gndi-g2t)、p3ht(聚(3-己基噻吩-2,5-二基))、bbl(聚苯并咪唑并-苯并异喹啉)、pths-tma
+-co-p3ht(聚[(6-噻吩-3-基)己烷-1-磺酸酯-共-3-(己基噻吩)])、聚(n,n'-双(7-乙二醇)-萘-1,4,5,8-双(二甲酰亚胺)-共-2,2'-并噻吩-共-n,n'-双(2-辛基十二烷基)-萘-1,4,5,8-双(二甲酰亚胺)、萘-1,4,5,8-四羧酸-二酰亚胺-并噻吩(ndi-t2)聚合物，其乙二醇链百分比为90％(p-90)和p(g0t2-g6t2)。
[0072]
通道可以在1μm和1000μm之间、1μm和100μm之间、或5μm和50μm之间，例如大约10μm。通道的宽度可以在10μm和1000μm之间、20μm和500μm之间、或20μm和200μm之间，例如大约100μm。
[0073]
通常，通道保持不被修饰，即，它没有被化学修饰以锚定结合配偶体。分析物识别发生在bnim，其与通道没有物理接触。这种配置允许装置的延长保质期和提高的操作稳定性。在至少3次重复使用后，oect可以保留其检测灵敏度，其电化学信号变化小于约5％。当在栅电极处用5秒长的连续方形电压脉冲施压至少15分钟时，oect还可以保留其漏电极电流(即漏电极电流的变化小于约5％)。
[0074]
iii.栅电极
[0075]
栅电极被配置以控制离子注入通道，通常与源电极、漏电极和通道一起放置在测量溶液中，但不与这些组件接触。
[0076]
栅电极可以是任何合适的形状，例如矩形、正方形、圆形和圆柱形。
[0077]
通常，栅电极可以由上述用于源电极和漏电极的任何材料(例如，pt或au)制成，或者它可以是公共参考电极，例如银/氯化银(ag/agcl)参考电极。其他示例性参考电极包括但不限于标准氢电极、正常氢电极、可逆氢电极、饱和甘汞电极、硫酸铜-铜(ii)电极、钯-氢电极、动态氢电极和汞-硫酸亚汞电极。
[0078]
iv.电解质溶液
[0079]
电解质溶液与通道和栅电极以及源电极和漏电极的至少一部分电接触。电解质溶液是含有已失去或获得电子的离子或分子的溶液，并且是导电性的。电解质溶液包括但不限于缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、盐水、mes缓冲液、bis-tris缓冲液、ada、aces、pipes、mopso、bis-tris丙烷、bes、mops、tes、hepes、dipso、mobs、tapso、氨基丁三醇(trizma)、heppso、popso、tea、epps、tricine、gly-gly、bicine、hepbs、taps、ampd、tabs、ampso、ches、capso、amp、caps、cabs和其组合；生物体液，例如全血、血清、尿液、唾液、汗液；
以及上述任何缓冲液与任何生物体液的组合。电解质溶液可具有约5.5至约8.5、约6至约8、或约6.5至约7.5、优选约7.4的ph。
[0080]
电解质溶液可以包含分析物。分析物优选具有大于等孔膜表面层中的孔的尺寸，因此可以在与等孔膜中的结合配偶体结合时堵塞孔。选择相对于孔具有更大尺寸的分析物在本领域中是已知的。例如，aβ聚集体具有约50nm的尺寸，并因此可以堵塞直径小于50nm的孔。sehlin等人，plos one 7(2)：e32014(2012)。
[0081]
v.支撑基板
[0082]
支撑基板可用于支撑源电极、漏电极和通道。
[0083]
支撑基板通常由非导电材料形成。示例性支撑基板包括但不限于玻璃、硅、塑料和纸(包括纸、涂层纸、树脂涂层纸、纸层压板、纸板和瓦楞纸板)。用于支撑基板的材料包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、硅石、二氧化硅、石英和纤维。
[0084]
上文鉴定的组件可以在支撑基板上被图案化。所述组件可以与支撑基板物理和/或化学连接。例如，组件通过诸如溅射涂布、旋涂或滴铸的涂布与支撑基板物理连接。
[0085]
在一些实施方案中，上文鉴定的组件在支撑基板的单层上被图案化。图7e中示出了示例性配置。栅电极也可以在同一支撑基板上被图案化，例如参见图9a。
[0086]
c.oect阵列和微流体配置
[0087]
在一些实施方案中，多个可独立寻址的源电极和漏电极以及相应的通道在支撑基板上被图案化以形成阵列。在图8a-8b中示出了用于阵列(100)的示例性配置。如图8a所示，一对源电极(参见例如，103a)和漏电极(参见例如，104a)被分开放置并且通过相应的通道(参见例如，101a)电连接。每个相应的通道可以与含有用于特定分析物的结合配偶体的等孔膜(参见例如，105)偶联。任选地，阵列中的相应通道可以各自与含有不同结合配偶体和/或表面层中不同孔径的不同等孔膜偶联，用于同时检测多种分析物。在一些实施方案中，多种分析物指示相同疾病，由此提高该疾病的诊断/预后准确性。
[0088]
所述阵列可以包括在同一支撑基板上被图案化的一个或多个栅电极。一个或多个栅电极中的每一个可控制离子注入阵列中的一个或多个相应通道。例如，阵列中的所有通道都可以由一个公共栅电极控制。或者，至少一个相应通道的第一组由第一栅电极控制，一个或多个相应通道的第二组由第二电极控制。任选地，阵列含有与相应通道相同数量的栅电极，其中每个栅电极控制离子注入相应通道之一。
[0089]
在一些实施方案中，阵列中的一个或多个栅电极可以用不同于bnim中的结合配偶体的结合配偶体，例如抗体(例如，针对aβ-42和aβ-40肽的抗体)功能化。分析物在栅电极处的结合将改变栅电极和/或其双层电容的工作函数(work function)，由此改变相应通道中的电流和/或oect阈值电压。通常，一个或多个栅电极中的至少一个保持不被功能化。阵列中的每个功能化栅电极可以含有彼此不同的结合配偶体。例如，该阵列含有第一组一个或多个对应通道，其与用第一结合配偶体功能化的bnim和控制离子注入这些未功能化通道的第一栅电极偶联；第二组一个或多个对应通道，其与用不同于第一结合配偶体的第二结合配偶体功能化的第二栅电极偶联；第三组一个或多个对应通道，其与用不同于第一和第二结合配偶体的第三结合配偶体功能化的第三栅电极偶联。
[0090]
在一些实施方案中，oect阵列与微流体配置集成。例如，oect阵列在含有微流体通
道的支撑基板上被图案化，用于引导样品和/或电解质溶液的流动，和/或保持oect的组件。当整合到微流体配置中时，bnim可以放置在栅电极的顶部。例如，基板含有微流体通道，其中oect的源电极、漏电极、通道和栅电极/bnim放置在微流体通道内，使得样品被引导流入通道并流过栅电极/bnim并进入oect通道。微流体配置可以改善通道和bnim之间的对齐，并允许分析物结合在bnim中更均匀地发生，产生增加的灵敏度和重现性。与微流体通道集成的阵列可以检测多种分析物，其中bnim被不同的结合配偶体功能化和/或在顶层上具有不同的孔径，和/或栅电极被如上所述的不同结合配偶体功能化。
[0091]
在图9a-9e中示出了示例性多模式oect阵列配置(200)。如图9a中所示，oect的阵列(210)在支撑基板(220)中被图案化。每个oect含有分开放置并通过相应的通道(参见例如，图9b，201)电连接的一对源电极(参见例如，图9b，203)和漏电极(参见例如，图9b，204)。阵列210还含有六个栅电极(202a-202f)。栅电极202a和202b保持不被功能化并且每个都具有放置在顶部的bnim(参见例如，图9c，205a)。两个bnim可以包括相同或不同的结合配偶体，和/或在顶层具有相同或不同的孔径。栅电极202c和202d被抗体aβ-42功能化(参见例如图9d)。栅电极202e和202f被抗体aβ-40功能化(参见例如图9e)。栅电极202c-202f可以被与bnim中的结合配偶体不同的任何想要的结合配偶体，例如aβ-40、aβ-42和plasma neur0filament light功能化。六个栅电极中的每一个都可以控制离子注入到一个或多个相应通道中。
[0092]
iii.制备和使用方法
[0093]
a.制备方法
[0094]
i.制备等孔膜的方法
[0095]
制备具有所需孔径的等孔膜的方法是本领域已知的。等孔膜可以通过多种方法制备，包括但不限于微细加工、阳极氧化和先进的材料合成。
[0096]
通过铝的电解氧化可以产生其孔径分布变化很小的膜，参见furneaux等人nature,337,1989,147-149页。例如，这些膜以其商品名提供。等孔过滤膜也可以通过光刻方法，例如干涉光刻产生，参见kuiper等人:journal of membrane science 150,1998,1-8页。在这种情况下，微滤膜也称为微筛。
[0097]
用于产生等孔膜的最新方法基于嵌段共聚物的自组织能力(russel等人：advanced materials 18,2006,709-712页)。嵌段共聚物是由一种以上类型的单体组成并且其分子以嵌段线性连接的聚合物。嵌段直接互连或通过不是嵌段部分的结构单元互连。在这种方法中，a-b二嵌段共聚物与一定量的均聚物b一起溶解在溶剂中。通过溶剂的受控蒸发，薄膜可以在固体衬底上形成，例如硅晶片，其具有规则地垂直于表面排列的圆柱体，其由嵌段b和均聚物b组成。均聚物b通过选择性溶剂从这些薄膜中溶解出来，以便形成纳米多孔薄膜。所述薄膜现在可以被水释放并转移到多孔载体上。这产生了具有等孔分离层的复合膜。
[0098]
美国专利号9,914,099(通过引用并入本文)描述了由聚合物材料制备等孔膜的方法。总而言之，所述方法包括将一种或多种聚合物(其中至少一种是嵌段共聚物)溶解在流体中以产生浇铸溶液。在某些方面，嵌段共聚物可由两种或三种不同的聚合物嵌段组成，其中至少两种嵌段不相容并导致微相分离。在另一方面，一个嵌段是疏水的而另一个是亲水的。嵌段共聚物应具有窄的分子量分布。聚合物分散指数(pdi)应小于1.5、1.4、1.3或更小。
在某些实施方案中，聚合物嵌段之一包含与金属离子形成配位化合物或盐的官能团。这种聚合物嵌段的实例包括但不限于聚乙烯基吡啶、聚苯胺、聚吡咯、聚三唑、聚酰肼、聚乙二醇和聚丙烯酸。上述浇铸溶液中嵌段共聚物的浓度应高于或约为5、10、15或20wt％至15、20或25wt％之间，包括其间的所有值和范围。浇铸溶液包括用于至少一种嵌段共聚物的至少一种溶剂。浇铸溶液可以包括一种或多种溶剂。溶剂通常是极性溶剂并且包括与水混溶的那些溶剂。此类溶剂的实例包括但不限于二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜和四氢呋喃。在制备好浇铸结构后，将其浸入非溶剂浴中，优选水中。非溶剂是嵌段共聚物在其中不能充分溶解的溶液或液体，因此浇铸结构中聚合物的相分离是通过浸入非溶剂中诱导的。通过非溶剂诱导的相分离，形成不对称聚合物材料。这种聚合物材料由多孔子结构(支撑层)组成，所述子结构被具有高度有序的孔结构(等孔层)的薄层覆盖，所述高度有序的孔结构含有垂直于膜表面取向的圆柱体或对齐的互连球体。圆柱形结构由嵌段共聚物的亲水嵌段形成。由这种结构形成的孔的直径在直径上变化很小。
[0099]
例如在zhu,等人,j.membrane science,566(15)；25-34(2018)中公开了从超分子相互作用促进的嵌段共聚物组装制备的具有亚10nm孔的等孔膜。
[0100]
例如，在yu等人，angew chem int ed engl.,53(38):10072-6(2014)中公开了用于制备具有调谐孔径的自组装等孔嵌段共聚物膜的方法。另参见，madhavan等人，acs appl.mater.interfaces,6:18497-18501(2014)。例如在20140217012中公开用于制备具有等孔表面的分级膜的方法，其方法通过引用并入本文。
[0101]
ii.制备oect的方法
[0102]
制备具有所需配置的oect的方法在本领域中是已知的，例如，使用如以下实施例中所述的聚对二亚苯基二甲基-c剥离工艺的光刻制造和ferro等人的us 9,530,976中描述的方法，其通过引用并入本文。
[0103]
b.使用方法
[0104]
所公开的装置可用于检测样品中分析物的存在，例如怀疑具有所述分析物的生物样品。为了定量，该装置可用于使用已知量的目标分析物生成剂量反应曲线。所公开的装置可以以低功率运行。例如，所公开的装置的操作消耗小于10μw功率、小于9μw功率、小于8μw功率、小于7μw功率、小于6μw功率、小于5μw功率、小于4μw功率，小于3μw功率、小于2μw功率或小于1μw功率。在一些实施方案中，用于检测分析物存在的公开装置的操作消耗小于1μw功率。
[0105]
通常，检测样品中分析物存在的方法包括：(i)使电解质溶液与装置接触，(ii)施加漏电极电压和栅电极电压，和(iii)测量漏电极电流、跨导，和/或响应时间。与没有分析物测量的那些相比，漏电极电流、跨导和/或响应时间的变化(增加或减少)表明样品中存在分析物。例如，与没有分析物测量的那些相比，漏电极电流的降低、跨导的降低和/或增加的响应时间表明样品中存在分析物。
[0106]
检测依赖于相对于孔具有较大尺寸的分析物堵塞膜表面孔，这部分地阻断了从电解质到通道的离子传输。因此，测量了可以进入通道的离子总数及其通量的减少(即跨导较低和响应时间较慢)。
[0107]
例如，将含有可疑分析物或已知量的分析物(其中正在生成剂量反应曲线)的电解质溶液的等分试样引入结合配偶体功能化膜集成晶体管中，并且允许发生分析物与其结合
配偶体之间的反应。然后冲洗集成oect的膜(例如用pbs)并干燥(例如用n2)，以去除任何非特异性吸附和非结合分子。
[0108]
在一些形式中，样品含有人类或非人类动物体液、人类或非人类动物组织或其组合。可以收集包括细胞成分的样品和裂解细胞并将所有分子成分溶解到溶液中的培养基。所公开的装置可用于检测怀疑存在于收集的样品中的分析物的存在。分析物的实例包括核酸(dna或rna)分子、肽、蛋白质、药物分子、激素等。在一些优选的实施方案中，已知分析物与特定疾病或病理状态相关，例如β淀粉样蛋白聚集体(与ad相关)、前列腺表面抗原(与前列腺癌相关的升高的水平)、循环肿瘤细胞等。在其他实施方案中，分析物可以是样品中待检测的已知毒素。装置的表征和操作可以如并入本文的实施例中所证明的那样进行(参见下面标题为“生物传感器的表征和操作”的标题)。
[0109]
所公开的方法可用于检测淀粉样变性中的淀粉样原纤维，所述淀粉样变性是由蛋白质的错误折叠和异常组装成淀粉样原纤维引起的一系列人类疾病。淀粉样变性与细胞外淀粉样蛋白原纤维和/或具有交叉β结构的细胞内淀粉样蛋白样包涵体的形成有关。淀粉样蛋白疾病包括神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、克雅氏病和亨廷顿病(hd)；非神经性局部淀粉样变性，包括ii型糖尿病(t2dm)、透析相关淀粉样变性和家族性淀粉样神经病变；和全身性淀粉样变性，例如轻链淀粉样变性(al)(在young等人的current opinion in chemical biology,39:90-99(2017)中进行了综述)。
[0110]
在特别优选的实施方案中，所公开的装置用于早期检测阿尔茨海默氏病。在该实施方案中，样品是生物样品，例如体液。体液可以是脑脊液；组织可以是脑组织。在一些形式中，样品中的蛋白质或肽的淀粉样蛋白、斑块或两者含有蛋白质或肽的线状聚集体，其以β-折叠构象排列。
[0111]
阿尔茨海默氏病(ad)是神经退行性疾病，其损害记忆和认知功能，身体和心理健康逐渐下降。2018年，估计全球有超过4500万人患有这种疾病，由于延长护理和生产力损失，每年造成超过6000亿美元的经济损失。非营利组织alzheimer’s disease international预测，被诊断患有ad的人数到2050年将达到约1.5亿，增加两倍(alzheimer’s disease international,2018)。虽然目前没有阻止ad进展的治疗方法，但早期诊断对于帮助患者适应症状并受益于可以减缓对健康细胞的不可逆损伤的现有治疗至关重要。
[0112]
现在普遍接受的是肽淀粉样蛋白-β(aβ)在ad的发展中发挥作用(laferla等人,2007)。从其规则的短链多肽状态(即“单体”，长度约40-42个残基)，aβ可以组装成多种聚集形式，称为寡聚体、原纤维(可溶性、拉长的聚集体)和纤丝(hardy等人，2002)。在其单体状态下，aβ没有神经毒性；然而，aβ的聚集体在大脑的特定区域中逐渐积聚成斑块。这些斑块被认为负责阻断神经元之间的交流，导致神经元丢失，其是ad的标志(walsh等人，2002)。目前，ad的诊断并不直接，并且主要依赖于认知测试，其与筛查大脑或脑脊液中aβ的这些神经毒性组件的方法组合。为了监测aβ聚集体并定量它们的浓度，通常利用荧光方法(dalal等人，2012；pinotsi等人，2013)。
[0113]
所公开的等孔膜可用于检测从受试者收集的aβ聚集体的存在。在这些实施方案中，用对aβ聚集体有选择性的结合配偶体对所用的等孔膜进行功能化，并且等孔层的孔径应该小于聚集体的尺寸，例如，具有小于50nm的孔径。合适的结合配偶体的实例包括刚果红、硫代黄素t。在特别优选的实施方案中，所述装置包括用刚果红功能化的表面，即对aβ聚
集体的交叉β结构具有强亲和力的配体。刚果红功能化的膜通过垂直插入在通道和电解质之间与微型oect集成。由于膜选择性地捕获溶液中的aβ聚集体，因此蛋白质被固定在其表面上。aβ聚集体的尺寸大于膜孔的尺寸，其阻止了离子从电解质传输到通道中，抑制了oect的门控。因此，oect信号根据溶液中aβ聚集体的浓度而变化。所述装置已展示出高达260μa/dec的灵敏度和从约2.21pm到约221nm的宽aβ聚集体检测范围，其是aβ聚集体传感器获得的最佳性能。该装置显示出延长的保质期和改进的操作稳定性。此外，可以以低功耗(即小于1μw功率)进行检测。
[0114]
分别在图4b、图11a和图11b中显示了用于检测aβ聚集体的含有pedot:pss通道的oecs、含有p(g0t2-g6t2)通道的oect和含有p-90通道的oect的示例性转移曲线。在图10中显示了含有与用于检测aβ聚集体的微流体集成的pedot:pss通道的oect的示例性转移曲线。
[0115]
通过以下编号的段落可以进一步理解所公开的装置和方法。
[0116]
1.用于检测怀疑含有分析物的样品中的分析物的装置，其包含等孔膜(bnim)和有机电化学晶体管(oect)，其中所述bnim包含对所述分析物特异的结合配偶体。
[0117]
2.段落1所述的装置，其中所述oect包含源电极、漏电极、通道和栅电极，其中所述源电极和漏电极通过所述通道电连接。
[0118]
3.段落1或2所述的装置，包含支撑基板，其中所述源电极、所述漏电极和所述通道在所述支撑基板上被图案化。
[0119]
4.段落3所述的装置，其中所述基板选自玻璃、硅、纸、涂层纸、树脂涂层纸、纸层压板、纸板和瓦楞纸板。
[0120]
5.段落2-4中任一项所述的装置，其中所述通道由导电聚合物制成。
[0121]
6.段落5所述的装置，其中所述导电聚合物选自pedot:pss、pedot-s、pedot:tos、pedotoh:clo4、pedot-co-pedotoh:clo4、p3ht、pths、bbl、p(g2t-tt)、pths-tma
+-co-p3ht、p(gndi-g2t)、p(g0t2-g6t2)和p-90。
[0122]
7.段落1-6中任一项所述的装置，其中等孔膜由嵌段共聚物聚(苯乙烯-b-4-乙烯基吡啶)制成。
[0123]
8.段落1-7中任一项所述的装置，其中与所述膜的等孔表面的孔径相比，对所述分析物特异的结合配偶体的尺寸更小。
[0124]
9.权利要求1-8中任一项所述的装置，其中所述装置包含刚果红或硫代黄素t。
[0125]
10.段落1-8中任一项所述的装置，其中所述等孔膜包含适体，任选地肽适体。
[0126]
11.段落1-10中任一项所述的装置，其中用于分析物的结合配偶体交联到膜的等孔表面。
[0127]
12.段落1-11中任一项所述的装置，其中所述bnim被放置在所述通道上方并且与所述源电极和漏电极接触。
[0128]
13.检测样品中分析物存在的方法，包括
[0129]
(i)使电解质溶液与权利要求1-12任一项所述的装置接触，
[0130]
(ii)施加漏电极电压和栅电极电压，以及
[0131]
(iii)测量漏电极电流、跨导和/或响应时间，
[0132]
其中，与没有分析物测量的那些相比，漏电极电流的降低、跨导的降低和/或响应
时间的增加表明样品中存在分析物。
[0133]
14.段落13所述的方法，其中所述电解质溶液包含生物样品或者是生物样品。
[0134]
15.段落14所述的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、脑脊液和唾液。
[0135]
16.段落13-15任一项所述的方法，其中所述装置的bnim被垂直插入通道和电解质溶液之间。
[0136]
17.段落13-16任一项所述的方法，其中所述装置的bnim包含刚果红。
[0137]
18.段落13-17任一项所述的方法，其中所述电解质溶液包含或怀疑包含β淀粉样蛋白聚集体。
[0138]
19.段落13-18任一项所述的方法，其中所述电解质溶液包含已知浓度的β淀粉样蛋白聚集体，所述方法还包括产生剂量反应曲线。
[0139]
20.段落13-19任一项所述的方法，其包括通过与剂量反应曲线比较，在怀疑含有β淀粉样蛋白的样品中因β淀粉样蛋白结合至等孔膜上的刚果红而获得的电流的降低来定量怀疑含有β淀粉样蛋白的样品中的β淀粉样蛋白的量。
实施例
[0140]
实验方法
[0141]
材料
[0142]
嵌段共聚物聚(苯乙烯-b-4-乙烯基吡啶)(p10900-s4vp,188000-b-64000g/mol)购自polymer source,inc.,canada。二甲基甲酰胺、1,4-二噁烷、丙酮、4-氯-1-丁醇、乙醇(etoh)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)、戊二醛(ga)、刚果红(cr)、乙二醇(eg)、十二烷基苯磺酸(dbsa)、(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷(gops)、氢氧化铵、来自人男性ab血浆的人血清和磷酸缓冲盐水(pbs)购自sigma-aldrich。导电聚合物聚(乙撑二氧基噻吩)：聚(苯乙烯磺酸盐)(pedot：pss，ph1000)水溶液购自heraeus clevios gmbh，重组人β淀粉样蛋白1-42肽(#ab82795)购自abcam(cambridge，ma，usa),并且玻璃珠购自polysciences,inc.。所有水溶液均用超纯水(milli-q,millipore)制备。
[0143]
纳米孔膜的功能化
[0144]
根据madhavan等人,acs appl.mater.interfaces,6:18497-18501(2014)描述的程序，从嵌段共聚物聚(苯乙烯-b-4-乙烯基吡啶)制备原始纳米孔膜。这个过程被称为嵌段共聚物的自组装和非溶剂诱导的相分离。
[0145]
为了将识别单元共价附着到膜表面，第一步涉及使用4-氯丁-1-醇对4vp嵌段进行季铵化。在室温下将膜浸入烧杯中2.5％(v/v)的4-氯丁-1-醇的乙醇溶液中24小时。取出膜并用水洗涤。然后将季铵化膜暴露于水中5％(v/v)的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)的溶液中30分钟，然后用超纯水冲洗。下一步是使用戊二醛(ga)作为交联剂将刚果红分子固定在季铵化膜上。将t胺封端的膜浸入5％(w/v)ga溶液中30分钟，然后用pbs冲洗并用n2喷雾干燥。通过将膜在其溶液(1μg/ml)中温育1小时，刚果红缀合到ga功能化膜表面上。最后，用pbs轻轻冲洗膜并用n2喷雾干燥以从表面去除任何低分子量和未反应的分子。
[0146]
膜的表面表征
[0147]
以5kv加速电压，160000x放大倍数进行使用fei magellan
tm sem的场发射扫描电子显微术(fesem)。使用bruker dimension icon spm在76-263khz的共振频率范围内在轻
敲模式下进行原子力显微镜(afm)分析。使用装配有消色差al kαx射线源(1468.6ev)的amicus/esca 3400 kratos仪器进行x射线光电子光谱(xps)分析。源在10kv的电压和10ma的电流下运行。以0.1ev的步长获取元素窄扫描区域。使用284.8ev的参考c1s校准获得的光谱。使用高斯和洛伦兹(gaussian and lorentzian)方法对光谱进行去卷积，并使用tougaard方法进行背景扣除。
[0148]
有机电化学晶体管(oect)的制造
[0149]
聚对亚苯基二甲基-c剥离工艺用于在玻璃基板上光刻制作通道宽度为100μm且通道长度为10μm的oect，其过程如图7a-7e所示。简而言之，以溅射开始制造以在玻璃晶片上沉积铬(10nm)/金(100nm)。使用双层抗蚀结构(s1813光刻胶，microchemicals gmbh；lor 5b microchem corp.westborough，ma)通过剥离工艺对金属进行图案化。在适当的溶剂中进行剥离，然后通过二聚体的蒸发将晶片封装在聚对亚苯基二甲基c中(pds 2010labcoater 2，specialty coating systems，indianapolis，in)。抗粘附层被旋涂在封装的晶片上用于沉积牺牲的聚对亚苯基二甲基c层，其允许聚合物在所需的通道几何形状中形成图案。金属触点和通道最终通过使用o2进行反应离子蚀刻(plasma lab 100-icp 380，oxford instruments)暴露出来。然后旋涂含有eg、dbsa和gops的pedot:pss分散体以形成通道。剥离牺牲的聚对亚苯基二甲基c层后，将装置在140℃下退火1小时并在去离子水中浸泡过夜。
[0150]
淀粉样蛋白-β单体和聚集体溶液的制备
[0151]
将蛋白质溶解在含有0.5％氢氧化铵的10mm pbs中，最终浓度为2.21μm。该储备溶液用pbs稀释至范围为2.21pm至221nm的所需浓度。为了使肽(单体)生长为聚集体形式，将溶液在37℃下温育3天，然后将它们储存在-20℃。对于传感实验，将30μl相应的aβ溶液滴入cr功能化膜集成晶体管上，并允许aβ和cr之间的反应发生3小时。然后将膜集成的oect用pbs冲洗并用n2干燥以去除任何非特异性吸附和非结合分子。
[0152]
oect的表征和生物传感器的操作
[0153]
使用具有三电极配置的恒电位仪(metrohm autolab)进行循环伏安法(cv)和电化学阻抗谱(eis)测量：oect的pedot:pss通道作为工作电极，pt网作为对电极和ag/agcl作为参比电极。电解质溶液是含有10mm k3fe(cn)6的pbs(0.01m)溶液。使用由定制的labview程序控制的national instruments-pxi数字万用表来评估oect性能。oect的稳态测量是通过获得在0和0.6v(步长0.05v)之间变化的栅电极电压(vg)下的通道电流(id)相对于漏电极电压(vd)来进行的。传感器响应由转移特性(预设vd＝-0.6v时的id相对于vg)确定。在vg＝0v时计算id的变化，因为该装置在含有不同aβ浓度的溶液中运行。通过从特定浓度的电流中减去空白缓冲液和血清样品的电流来计算电流变化的定量。所有电测量均在环境条件下并在接地的法拉第笼内进行。
[0154]
结果和讨论
[0155]
功能膜的设计
[0156]
该传感器的关键元件是用刚果红(cr)分子功能化的纳米结构化的等孔膜(ps-b-p4vp)。这种等孔膜很容易通过自组装共聚化和非溶剂诱导的相分离制造(madhavan等人，2014)(数据未显示)，其平均纳米孔径约为50nm(图1a)。cr的固定化是选择性和灵敏检测aβ聚集体的关键步骤。cr因其在多种介质中的稳定性和对aβ聚集体的强亲和力而被选为识别
单元(nilsson,2004；pedersen等人,2013)。图1b显示了聚合物膜的分子结构及其用于固定cr的功能化途径。通过用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)对膜进行修饰以在表面上提供氨基封端基团来起始纳米结构化的等孔膜的功能化。随后使这些基团与双功能接头戊二醛(ga)反应。ga与表面的氨基以及另一端的cr的那些氨基缀合(wustoni等人，2015)。
[0157]
为了验证膜表面上cr的存在并在每个修饰步骤后分析表面，进行了xps研究。aptes修饰后和cr固定后表面的s2p、o1s和n1s光谱的高分辨率揭示了膜表面化学组成的显著差异。仅在cr功能化后(图1c)在膜的s2p光谱上观察到特征峰，即在其结构中-so3官能团上含有硫原子的cr分子的指纹。在图1d所示的n1s光谱中，nh2功能化膜在398.5ev和399.2ev处显示两个去卷积峰，其分别属于aptes和吡啶单元的末端氨基中的氮原子(barber等人,1973)。添加cr后，在399.8ev处观察到额外的小峰，其对应于来自cr分子的二氮烯基官能团的n＝n键(camalli等人，1990)(表1)。
[0158]
表1.图1d和s5e中所示的xps n 1s光谱的去卷积，用于用nh2，然后cr功能化的膜，以及在后者与aβ聚集体相互作用之后功能化的膜(castle等人，1984；oswald等人,2013)。
[0159][0160][0161]
表面上存在cr的进一步证据来自o1s光谱(图1e)。对于nh2功能化膜，在530.8ev、531.8ev和533.3ev处对三个峰进行去卷积，分别指定为o-h、o-si、o-c键(barr,1983)。cr固定后，535.1ev和536.7ev处出现了新峰，这归因于cr的
–
so3基团中的氧(表2)。
[0162]
表2.图1e和图s5f中所示的xps o 1s光谱的去卷积，用于用nh2，然后cr功能化，以及在后者与aβ聚集体相互作用之后功能化。
[0163][0164][0165]
深入的xps表征证明首先使用aptes，然后使用cr已成功修饰了膜表面。重要的是，在用cr修饰后，膜维持其孔隙率(图1f)。
[0166]
用于检测aβ聚集体的基于oect的传感器
[0167]
为了了解所公开传感器的操作机制，了解耗尽模式oect是如何工作的至关重要。在该装置中，pedot:pss薄膜用于源极和漏电极触点之间的通道铸件，并将ag/agcl颗粒作为顶部栅电极浸入测量溶液中(图2a，左)。在没有栅电极电压(vg)的情况下，由于pedot:pss的导电性质，记录流过通道的高源-漏电流(id)。栅电极(vg)上的正电压使电解质的阳离子漂移到通道中，而阴离子则向栅电极移动。id随着vg的增加而减小，当vg为约0.1v时，装置的增益(跨导)最大化(图2b)。这是垂直漂移和阳离子渗透到通道中以及随后其中的孔耗尽的结果。
[0168]
所公开的oect生物传感器的配置涉及放置在pedot:pss通道顶部的功能化膜(图2a，中间)。然后用一滴电解质(pbs)覆盖装置，并将ag/agcl顶栅浸入其中。膜的存在不干扰oect操作：由于其多孔性质，膜对电解质离子是可渗透的，因此允许有效地门控通道。然而，当在含有aβ聚集体(22.1nm，离子强度没有变化)的溶液中操作膜集成装置时，观察到通道电流和跨导显著降低(图2b)。这种效应在低栅电极电压下更为明显。后者是预期的，因为在低偏压下离子上的电泳力较小，因此渗透到通道中的离子较少。图2k-m中显示了每个阶段的oect各自的输出特性。
[0169]
结合事件也影响装置的瞬态特性。对于瞬态响应，记录了在栅电极处应用方形脉冲(vg＝0.1v,15ms)后id的变化。然后从图2c中所示的这些瞬态计算响应时间，其给出了注射的(提取的)阳离子对通道进行去掺杂(掺杂)的速度。通道顶部的膜的存在略微降低了电
流，响应时间的变化可以忽略不计。另一方面，在将膜与aβ聚集体温育后，装置开启和关闭速度更慢，伴随着电流调制的显著降低。虽然稳态下的id与可以进入薄膜的离子数量成正比，但晶体管的速度由离子通量控制(jimison等人，2012)。由于aβ与cr的相互作用不是电化学活性的，并且不能直接诱导电信号，因此很明显，装置特性受膜渗透性的调节。
[0170]
与aβ聚集体相互作用后膜的afm和xps光谱的变化证明cr单元捕获蛋白质聚集体，其然后吸附在膜表面上(数据未显示和图2d-g，表1-2)。设计膜使其孔径(即约50nm)小于aβ聚集体(例如原纤维)的孔径(ochiishi等人，2016；wolff等人，2017)。因此，吸附的蛋白质聚集体堵塞了膜孔，并部分阻断了阳离子从电解质进入通道(图2a，右)。因此，测量了可以进入通道的离子总数及其通量(即跨导较低和响应时间较慢)的减少。
[0171]
进一步进行了循环伏安法(cv)和电化学阻抗谱(eis)测量(图2h-j)。相同的oect通道在有膜和没有膜的情况下以及在含有氧化还原活性分子k3fe(cn)6的电解质中温育aβ后使用以评估通道/电解质界面上的动力学屏障(cardoso等人,2016)。结果显示与aβ聚集体温育后，峰值电流急剧下降，表明fe
3+
向通道的移动受到阻碍。此外，由于离子扩散能力的下降，通道电容随着电荷转移和电解质电阻的增加而降低。
[0172]
这种装置配置的特点是其延长的保质期和操作稳定性。这是因为传感事件是被分隔开的。结合事件发生在功能化膜中，其在需要时可以进行补充，而下面的电子装置保持“原始”状态，以维持其功能以供进一步使用。像这样，与依赖生物功能化电子元件的其他传感器相比，预期所述装置具有显著更长的保质期。如图5a所示，pedot:pss通道中流动的电流在与膜集成之前及之后以及装置已经用于aβ传感之后是相同的。然后可以将相同的oect与新鲜膜集成用于新的传感测量(图5b)。这种配置也具有成本效益，因为对于这种特殊的传感器，oect芯片需要比膜更复杂的制造程序。此外，膜集成的oect具有类似于裸oect的操作稳定性，即当在栅电极处受到5秒长、连续方形脉冲超过15分钟的压力时，所述装置显示出稳定的漏电极电流输出(图5c-d)。
[0173]
生物传感器的灵敏度
[0174]
在上述实验中，装置响应仅针对特定的aβ聚集体浓度进行测试。图3a和b显示了分别与cr功能化膜，以及广泛浓度的aβ溶液温育的裸ps-b-p4vp膜集成的oect通道的稳态特征。功能化膜集成的oect的转移曲线显示，随着aβ聚集体浓度的增加，漏电极电流持续下降(图3a)。另一方面，未功能化的裸膜与aβ聚集体没有特定的相互作用，导致与蛋白质浓度无关的类似的装置响应(图3b)。
[0175]
图3c展示了生物传感器的校准曲线(电流变化相对aβ浓度的对数)，显示对2.21pm至221nm范围内的aβ聚集体的线性响应。功能化膜之间的线性关系斜率为260μa/dec。由于oect电路赋予的高跨导，所述装置的灵敏度优于先前报道的电化学系统，如表3中所概述。
[0176]
表3.oect生物传感器与其他电化学aβ传感器的比较。
[0177][0178][0179]
为了排除膜也与aβ单体相互作用的可能性，监测装置对广泛浓度的肽的敏感性。与肽的通道电导忽略不计的变化证实了传感器对蛋白质聚集形式的选择性。因此，当膜与aβ单体温育时，其表面形态不会改变(数据未显示)。cr分子捕获含有交叉-β结构构象的聚集体，而它们不能有效地与富含α-螺旋结构的肽结合(wu等人，2007；wu等人，2012)。同样，如果膜不携带cr单元，则所述装置对aβ聚集体不敏感。这些结果证明了cr单元在捕获aβ聚集体和识别蛋白质物理状态方面的关键作用。
[0180]
复杂介质中的操作
[0181]
据报道，aβ聚集体会释放到血浆中(de la等人，2015)。检测人血清样品中的aβ聚集体可为ad的体外监测提供方便、非侵入性和低成本的选择。为了测试传感器在复杂介质中的性能，使用诸如葡萄糖、血红蛋白、胆固醇和人血清白蛋白等常见干扰物质模拟复杂介质的条件，并评估传感器在其中以及在人血清(hs)中的性能。图4a显示了oect对pbs中干扰物的响应的比较，与对aβ聚集体的响应相比，所述干扰微不足道。虽然含有大量生物分子的hs产生背景响应，但这并不妨碍装置对aβ聚集体的响应。然后，进一步的研究检查了传感器性能，以监测以不同浓度存在的人血清样品中的aβ聚集体。类似于pbs中记录的装置的剂量依赖性响应(图3a)，oect电流随着hs中aβ聚集体浓度的增加呈线性下降(图4b)。该装置也不对由于其大小而可能堵塞膜孔的分子做出反应，这进一步证明了aβ聚集体与cr的特定相互作用对于它们的检测至关重要(图6)。
[0182]
结论
[0183]
在这项工作中，开发了生物功能化、纳米结构化、等孔膜集成oect，用于快速和灵敏地检测aβ蛋白聚集体。锚定在膜表面的刚果红单元使得能够选择性地捕获aβ聚集体。膜被放置在oect通道的顶部。由于聚集体大于膜孔的尺寸，一旦它们被膜捕获，它们就会在oect操作期间阻止电解质阳离子漂移到通道中。漏电极电流因此与从电解质中吸附的聚集体的量相关地进行调节。因此，我们结合三个概念来构建这种最先进的传感器：1)刚果红仅与aβ聚集体的生物分子相互作用；2)离子途径的尺寸选择性阻塞；3)oect通道对电解质阳离子的高灵敏度。使用cr功能化膜作为识别单元有几个优点：与抗体或酶相比，传感器具有长期稳定性、易用性和低成本。由于膜的等孔性和选择性，数据特别表明aβ单体和物理吸附的aβ聚集体都不会影响离子注入，从而使传感器对aβ聚集体具有高度特异性。无标记蛋白传感器在标准生理浓度范围内线性检测缓冲液和人血清样品中2.21pm至221nm的aβ聚集体。考虑到这种传感方法的选择性和敏感性，这项工作为早期诊断ad的先进电子平台铺平了道路。此外，这项工作可以激发使用生物分子功能化的多孔膜以及它们与小型化、高跨导晶体管的集成。
[0184]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的具有相同的含义。本文引用的出版物和引用它们的材料通过引用具体并入。
[0185]
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案旨在被以下权利要求所涵盖。
[0186]
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