用于确定包含核酸如rna和任选存在的颗粒的样品组合物的至少一个参数的方法
技术领域：
：1.本公开一般涉及分析核酸如rna的领域，特别是确定样品组合物的至少一个参数，所述样品组合物包含核酸(尤其是rna)和任选存在的颗粒。
背景技术：
：：2.使用重组核酸(如dna或rna)将外源遗传信息递送至靶细胞中是众所周知的。使用rna的优点包括瞬时表达和非转化特征。rna不需要进入细胞核就可以表达，而且不可以整合至宿主基因组中，从而消除了各种风险如肿瘤发生。3.重组核酸可以裸露形式给药于有此需要的受试者；然而，重组核酸通常使用药物组合物给药。例如，rna可以通过所谓的纳米颗粒制剂递送，所述纳米颗粒制剂含有rna和形成纳米颗粒的媒介物，例如，阳离子脂质、阳离子脂质和辅助脂质的混合物或者阳离子聚合物。4.这类纳米颗粒制剂的命运受各种关键因素控制(例如，纳米颗粒中核酸的完整性和浓度；游离核酸的量；纳米颗粒的大小、大小分布、定量大小分布和形态；等等)。例如，这些因素在2018年的fda"liposomedrugproductsguidance"中被称作应当分析和具体说明的特定属性。当前纳米颗粒制剂的临床应用的局限性可能在于缺少均质、纯净和良好表征的纳米颗粒制剂。这也是由于所有用于确定这些因素的现有技术都存在一些缺点。5.例如，目前用于确定纳米颗粒中核酸的完整性和/或浓度的技术(如基于染料、凝胶电泳、微通道电泳或毛细管电泳(ce))是劳动密集型的、昂贵的、利用样品制备步骤导致假象，不可以提供足够信息和/或不可以分析大量样品。在目前使用染料(如荧光染料)的一种技术中，染料本身可以导致差异，这可以影响测量结果的可靠性。此外，大多数基于凝胶电泳的技术需要多个洗涤步骤，使用增加程序长度的特殊运行缓冲液，以及由于使用毒性试剂而采取的特殊预防措施。例如，琼脂糖凝胶技术受多个参数(例如，琼脂糖的质量、凝胶的浇铸、染料/灵敏度(需要更大量的样品)、暴露时间、处理原始数据和光密度测定软件的标准化评价(28s/18s方法))的影响，使得这种技术不可靠。与琼脂糖凝胶电泳相比，基于微通道、基于芯片的电泳或毛细管电泳的技术提供更快的运行时间和提高的数据质量，但是需要手动处理以启动和加载凝胶、标记和样品至系统上。ce仪器缺乏足够的rna质量/数量分析所需的灵敏度、动态范围和分离质量。6.此外，表征纳米颗粒制剂的一个关键挑战在于对制剂中含有的颗粒的大小分布的定量确定。对于直径小于约500nm(即与大多数医药产品相关的范围)的颗粒尤其如此。另一个未满足的需求在于确定纳米颗粒制剂的大小分布，其中大小分布宽或复杂(特别是不对称)。可用于表征纳米颗粒制剂的所有现有技术都具有某些缺点：例如，它们不提供关于大小的直接定量信息，或者它们仅测量小的、任选不具有代表性的样品子集，或者对具有不同大小的颗粒的灵敏度(或其他参数，例如，相对于体相的折射率梯度)非常不同，这强烈影响获得的大小分布。7.关于在较低亚微米范围(约100nm)中的颗粒的大小测量，存在几种技术，如动态光散射(dls)、纳米颗粒跟踪分析(nta)、电子显微术(em)和大小排阻色谱(sec)-uv。8.dls提供关于纳米颗粒的扩散常数的信息，由此使用stokes-einstein方程计算流体动力学半径rh。但是，dls仅提供平均数据，由此使用某些算法数值计算颗粒大小。为了获得定量可靠的数字，纳米颗粒制剂应当是单峰和单分散的，这对于许多产品而言并非如此，包括纳米颗粒药物制剂。在dls中最广泛使用的算法是所谓的累积分析(d.e.koppel,j.chem.phys.57(1972)4814-4820)，作为前提，其仅假设单峰大小分布，并且仅在多分散性低于某个阈值的情况下提供具有物理意义的数字。dls的其他算法(参见，例如，provencher,s.w.,comput.phys.commun.1982,27,229–242)提供大小曲线，其主要取决于拟合参数，并且几个非常不同的谱可以对应于相同的数据集。这种分析受到以下事实的阻碍：大颗粒的光散射强度远高于较小颗粒，这使得在大得多的颗粒的存在下难以确定较小颗粒的分数。9.nta是一种通过随着时间的推移用显微镜观察来自样品的非常小的(稀释的)子集的散射光来从它们的扩散常数确定颗粒大小的方法。原则上，nta能够提供定量的大小分布谱；但是，只可以测量非常稀释的样品，并且颗粒必须存在于相对较小的大小范围中，即，由于散射强度高得多，因此不可以在大得多的背景下确定非常小的颗粒。因此，nta不适合作为确定药物制剂的定量大小分布的常规方法。此外，与其他技术(例如，dls)相比，nta的统计标准差较高。这是nta分析的颗粒量低一到三个数量级的直接结果。特别地，具有生物学影响的微量颗粒(例如，聚集体)可能被低估，或者甚至无法通过nta检测到。nta需要几个耗时的优化步骤(例如，视频捕获设置、不同的样品稀释等)以确定适合准确测量的设置。通常，用于nta测量的样品必须稀释10-1000倍，这可能会导致问题，特别是颗粒的取决于浓度的聚集或分解。由于所有这些缺点，很难将nta建立为质量控制方法。10.em提供关于单个颗粒的大小、形状和形态的定量信息，但是可以分析的颗粒数量甚至低于nta。因此，在测量的颗粒可能不代表整个样品的意义上，em具有与nta相似或相同的缺点。这种技术的其他主要缺点是成本高、样品制备复杂和分析样品的周转时间长。这就是为什么em不常用作gmp方法的原因。em的另一个问题是样品的固定会导致假象(例如，收缩、聚集等)。如果样品未固定(例如，在cryo-em中)，则样品可能具有低对比度，并且无法分析。11.其他分离技术如sec-uv不适用，因为与柱基质的相互作用会导致问题(例如，吸附或洗脱延迟)。由于sec柱的大小范围有限，纳米颗粒不可以充分分散，或者纳米颗粒不可以与聚集体分离。此外，在质量或颗粒数量与颗粒大小直接相关的意义上，sec-uv不提供定量的大小分布。其他分散方法如分析超速离心(auc)仅允许间接大小测量，例如基于沉降系数，其中必须做出几个假设以计算大小分布。此外，auc既昂贵又费时，并且它不是常规质量控制中的常用方法。因此，auc也不适合作为常规质量控制方法用于确定定量大小谱。12.鉴于上述情况，为了确保纳米颗粒制剂的可重复质量，需要用于深入颗粒表征的先进分析方法。特别地，需要一种改进的分析含有核酸(尤其是rna)的纳米颗粒制剂的方法，其中所述方法优选地(i)提供关于制剂特征的信息(如制剂中含有的颗粒的定量大小分布(特别是对于直径小于500nm的颗粒)；(ii)提供关于颗粒组成特征的信息(例如，颗粒中含有的核酸(尤其是rna)的量，特别是作为颗粒大小的函数，如颗粒中含有的核酸(尤其是rna)的量与颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物，例如，阳离子脂质对阳离子聚合物)的量的比例，特别是作为颗粒大小的函数)；(iii)与gmp兼容；(iv)不依赖于染料的使用；(v)是半自动的；和/或(vi)可以用来分析当制备和/或储存组合物时改变一个或多个反应条件的影响(例如，盐浓度；温度；ph或缓冲液浓度；光/辐射；氧；剪切力；压力；冷冻/解冻循环；干燥/复原循环；添加赋形剂(例如，稳定剂和/或螯合剂)；颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的类型和/或来源；电荷比例；和/或核酸(如rna)与颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的比例)，所述组合物包含核酸(如rna)和任选存在的颗粒。优选地，所述方法提供关于以下参数中的一个或多个的数据：核酸(如rna)完整性；核酸(如rna)的总量；游离核酸(如rna)的量；与颗粒结合的核酸(如rna)的量；含有核酸(如rna)的颗粒的大小(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(如rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))；含有核酸(如rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)；含有核酸(如rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)；核酸(如rna)的分子量；和/或含有核酸(如rna)的颗粒的形状(例如，形状和/或形式因子)。任选地，其他参数可以包括以下一个或多个：表面核酸的量(如表面rna的量)，包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)，可接近的核酸的量(可接近的rna的量)，核酸(尤其是rna)的大小(例如，基于rg或rh值)，核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于rg或rh值)，核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)，核酸(尤其是rna)包裹效率，与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例，颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例，以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比(n/p比)。13.发明人惊奇地发现本文描述的方法和用途满足上述要求。技术实现要素：14.在第一方面，本公开提供一种用于确定样品组合物的一个或多个参数的方法，其中所述样品组合物包含核酸(如rna)和任选存在的颗粒，所述方法包括：15.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；16.(b)测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，并且任选地测量光散射(ls)信号；以及17.(c)从所述选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)完整性、核酸(如rna)的总量、游离核酸(如rna)的量、与颗粒结合的核酸(如rna)的量、含有核酸(如rna)的颗粒的大小(特别地，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(如rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)以及含有核酸(如rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)。一般来说，含有核酸(如rna)的颗粒的大小分布和/或定量大小分布可以作为含有核酸(如rna)的颗粒的数量、含有核酸(如rna)的颗粒的摩尔量或含有核酸(如rna)的颗粒的质量给出，每个作为它们大小的函数。额外的可选参数包括核酸(尤其是rna)的分子量、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(特别地，基于核酸(尤其是rna)的rg和/或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于核酸(尤其是rna)的rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于核酸(尤其是rna)的rg或rh值)、形状因子、形式因子以及核酸(尤其是rna)包裹效率。一般来说，核酸(尤其是rna)的大小分布和/或定量大小分布可以作为核酸(尤其是rna)分子的数量、核酸(尤其是rna)的摩尔量或核酸(尤其是rna)的质量给出，每个作为它们大小的函数。其他额外的可选参数包括与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比，其中所述电荷比通常表示为n/p比并且可以作为颗粒大小的函数给出。18.在第一方面的第一亚组中，所述方法包括：19.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；20.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及21.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。22.在第一方面的第二和优选亚组中，所述方法用于确定样品组合物的一个或多个参数，其中所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，所述方法包括：23.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；24.(b)测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，并且任选地测量光散射(ls)信号；以及25.(c)从所述选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。26.在第一方面的第三和更优选的亚组中，所述方法用于确定样品组合物的一个或多个参数，其中所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，所述方法包括：27.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；28.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及29.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。30.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg值计算所述含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第一方面的另一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rh值计算所述含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第一方面的另一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg值并分别地基于含有核酸(如rna)的颗粒的rh值计算所述含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这个实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。31.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rg值计算所述核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第一方面的另一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rh值计算所述核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第一方面的另一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rg值并分别地基于核酸(如rna)的rh值计算所述核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这个实施方案产生核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。32.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，场-流分级优选是流场-流分级，如非对称流场-流分级(af4)或中空纤维流场-流分级(hf5)。33.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，使用具有适合防止核酸(尤其是rna)渗透膜的截留分子量(mw)的膜进行步骤(a)，优选截留mw在2kda-30kda的范围内的膜，如10kda的截留mw的膜。34.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，使用聚醚砜(pes)或再生纤维素膜进行步骤(a)。35.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(a)使用以下进行：(i)高达8ml/min，优选高达4ml/min，更优选高达2ml/min的交叉流速，例如，交叉流速谱；和/或(ii)在0.05-0.35ml/min的范围内，优选在0.10-0.30ml/min的范围内，更优选在0.15-0.25ml/min的范围内的注入流量；和/或(iii)在0.30-0.70ml/min的范围内，优选在0.40-0.60ml/min的范围内，更优选在0.45-0.55ml/min的范围内的检测器流量。36.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述交叉流速谱优选含有分级阶段，其允许将对照或样品组合物中含有的组分按其大小分级/分离以产生一个或多个样品级分。优选交叉流速在这个分级阶段期间发生变化(例如，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，或者从一个值(如约0至约0.1ml/min)开始然后增加至较高的值(如约1至约4ml/min))，其中可以通过任何方式变化，例如，连续(如线性或指数)变化或逐步变化。优选地，交叉流速谱含有分级阶段，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)。分级阶段可以具有适合将样品组合物中含有的组分按其大小分级/分离的任何长度，例如，约5min至约60min，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min。交叉流速谱可以含有附加阶段(例如，1、2、3或4个阶段)，其可以在分级阶段之前和/或之后(例如，分级阶段之前1个并且分级阶段之后1、2或3个)，并且可以用来将样品组合物中含有的非核酸(尤其是非rna)组分(例如，蛋白、多肽、单核苷酸等)与样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)分开，以集中样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)和/或再生场-流分级装置(例如，去除与装置的膜结合的所有组分)。优选地，这些附加阶段的交叉流速对于每个附加阶段是恒定的，并且附加阶段中的每一个的长度对于附加阶段中的每一个而言独立地在约5min至约60min的范围内(如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)。例如，交叉流速谱可以含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速(crosslowrate)相同(第一附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且与第二附加阶段的那个不同(第三附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)。在其中交叉流速谱含有分级阶段的实施方案中，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，优选交叉流速谱进一步含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速相同(如约1至约4ml/min)(第一附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(如约0.01至0.1ml/min)(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且低于第二附加阶段的那个(例如，所述第三附加阶段的交叉流速是0)(第三附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)。这样的交叉流速谱的优选实例如下：1.0-2.0ml/min持续10min，在30min内从1.0-2.0ml/min至0.01-0.07ml/min的指数梯度；0.01-0.07ml/min持续30min；以及0ml/min持续10min。37.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，使用对照核酸(尤其是rna)的完整性计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。38.在第一方面的这个实施方案的第一特定实例中，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：39.(a')使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；40.(b')测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号；41.(c'1)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从一个uv、荧光或ri峰的最大高度到uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；42.(c'2)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及43.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性(i(对照))。44.在这个第一实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：45.(c1)从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的最大高度到样品uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；46.(c2)从步骤(b)获得的样品uv、荧光或ri信号计算步骤(c1)中使用的样品uv、荧光或ri峰的总面积，从而获得a100％(样品)；47.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及48.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。49.在第一方面的这个实施方案的第二特定实例中，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：50.(a”)使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；51.(b”)测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；以及52.(c”)从步骤(b”)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定一个uv、荧光或ri峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性。53.在这个第二实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：54.(c1')从步骤(b)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的高度(h(样品))；以及55.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。56.在第一方面的这个实施方案的第三特定实例中(关于第一方面的第一亚组)，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：57.(a')使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；58.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；59.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；60.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及61.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性(i(对照))。62.在这个第三实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：63.(c1)从步骤(b)获得的uv信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv峰的样品uv峰的最大高度到所述样品uv峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；64.(c2)从步骤(b)获得的样品uv信号计算步骤(c1)中使用的样品uv峰的总面积，从而获得a100％(样品)；65.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及66.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。67.在第一方面的这个实施方案的第四特定实例中(关于第一方面的第一亚组)，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：68.(a”)使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；69.(b”)至少测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；以及70.(c”)从步骤(b”)中获得的uv信号确定一个uv峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性。71.在这个第四实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：72.(c1')从步骤(b)中获得的uv信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv峰的样品uv峰的高度(h(样品))；以及73.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。74.在第一方面的这个实施方案的第五特定实例中(关于第一方面的第二亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：75.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；76.(b')测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；77.(c'1)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从一个uv、荧光或ri峰的最大高度到uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；78.(c'2)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及79.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性(i(对照))。80.在这个第五实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：81.(c1)从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的最大高度到样品uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；82.(c2)从步骤(b)获得的样品uv、荧光或ri信号计算步骤(c1)中使用的样品uv、荧光或ri峰的总面积，从而获得a100％(样品)；83.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及84.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。85.在第一方面的这个实施方案的第六特定实例中(关于第一方面的第二亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：86.(a”)使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；87.(b”)测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；以及88.(c”)从步骤(b”)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定一个uv、荧光或ri峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照rna的完整性。89.在这个第六实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：90.(c1')从步骤(b)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的高度(h(样品))；以及91.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。92.在第一方面的这个实施方案的第七特定实例中(关于第一方面的第三亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：93.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；94.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；95.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；96.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及97.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性14))、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或它们的混合物；(ii)醇，如脂肪醇(例如，乙醇)，或醇的混合物；或者(iii)(i)和(ii)的组合。113.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定游离核酸(尤其是rna)的量：在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线))。114.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量：从如本文确定的总核酸(尤其是rna)的量(例如，通过(i)用释放剂处理所述样品组合物的至少部分；(ii)用至少从步骤(i)获得的所述部分进行步骤(a)-(c)；以及(iii)如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)))减去如本文确定的游离核酸(尤其是rna)的量(例如，通过在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)))。115.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)进一步包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号，如动态光散射(dls)信号和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。116.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过从步骤(b)获得的ls信号计算回转半径(rg)值和/或流体动力学半径(rh)值来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小。在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号，并且步骤(c)包括从所述dls信号计算rh值。在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的静态光散射(sls)如mals信号，并且步骤(c)包括从所述sls信号计算rg值。在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号和静态光散射(sls)如mals信号，并且步骤(c)包括计算rg和rh值。这个后一实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒大小的两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。117.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过将从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第一实例中(关于第一方面的第一亚组)，通过将从步骤(b)获得的uv信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第二实例中(关于第一方面的第二亚组)，通过将从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第三实例中(关于第一方面的第三亚组)，通过将从步骤(b)获得的uv信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。在上述第一、第二和第三实例的每一个中，可以在rg值、rh值或两者的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值的大小分布和一个基于rh值的大小分布。118.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过将uv、荧光或ri信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv、荧光或ri信号的图计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第一实例中(关于第一方面的第一亚组)，通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv信号的图计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第二实例中(关于第一方面的第二亚组)，通过将uv、荧光或ri信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv、荧光或ri信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第三实例中(关于第一方面的第三亚组)，通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。在上述第一、第二和第三实例的每一个中，可以在rg值、rh值或两者的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值的定量大小分布和一个基于rh值的定量大小分布。119.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述定量大小分布包括d10、d50和/或d90值(例如，基于rg或rh值)。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一组基于rg值的d10、d50和/或d90值以及一组基于rh值的d10、d50和/或d90值。120.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，如本文指定的参数(包括额外的可选参数)，特别是至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(特别地，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。但是，根据本发明，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布的这两个数据集仅被视为一个参数(而不是两个参数)。此外，如果通过场-流分级获得的分级图谱(fractogram)显示多于一个颗粒峰(particlepeak)，则每个颗粒峰的大小分布的确定仅被视为一个参数(而不是每个颗粒峰的一个参数)。这同样适用于在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布的情况。121.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第一方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))以及任选地本文指定的其余参数(包括额外的可选参数)中的至少一个参数，如至少两个参数；优选这些其余参数选自：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第一方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)和选自以下的至少一个参数，如至少两个参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第一方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、游离核酸(尤其是rna)的量以及与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。但是，根据本发明，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布的这两个数据集仅被视为一个参数(而不是两个参数)。此外，如果通过场-流分级获得的分级图谱显示多于一个颗粒峰，则每个颗粒峰的定量大小分布的确定仅被视为一个参数(而不是每个颗粒峰的一个参数)。这同样适用于在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布的情况。122.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过测量uv信号，例如，在260nm-280nm范围内的波长，如在260nm或280nm的波长，并且使用在相应波长(例如，260nm或280nm)处的核酸(尤其是rna)消光系数，来确定核酸(尤其是rna)，特别是游离核酸(尤其是rna)的量。123.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第一方面的第三亚组的优选实施方案中)，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)在10-2000nm的范围内，优选在20-1500nm的范围内，如30-1200nm、40-1100nm、50-1000、60-900nm、70-800nm、80-700nm、90-600nm或100-500nm，或者例如在10-1000nm、15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。在第一方面的第三亚组的优选实施方案中，含有rna的颗粒的(定量)大小分布(例如，基于rg或rh值)在10-1000nm的范围内，如在15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。124.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述核酸(尤其是rna)的长度为10-15,000个核苷酸，如40-15,000个核苷酸、100-12,000个核苷酸或200-10,000个核苷酸。125.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一亚组的一实施方案中)，所述核酸是rna。在这个实施方案以及第一方面的第二或第三亚组的实施方案中，所述rna优选是mrna或体外转录的rna，特别是体外转录的mrna。126.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，测量选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，任选地ls信号，如sls，例如，mals信号和/或dls信号，是在线进行的，和/或步骤(c)是在线进行的。127.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，在步骤(a)-(c)的一个循环中确定所述一个或多个参数。128.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，在使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级之前，将所述样品组合物的所述至少部分用溶剂或溶剂混合物稀释，所述溶剂或溶剂混合物能够防止颗粒聚集体的形成。在一实施方案中，所述溶剂混合物是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物。129.在第一方面的一实施方案中(特别地，在第一方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，测量uv信号是通过使用圆二色(cd)光谱来进行的。130.在第二方面，本公开提供一种分析在提供包含核酸(如rna)和任选存在的颗粒的组合物时改变一个或多个反应条件的影响的方法，所述方法包括：131.(a)提供包含核酸(如rna)和任选存在的颗粒的第一组合物；132.(b)提供包含核酸(如rna)和任选存在的颗粒的第二组合物，其中所述第二组合物的提供与所述第一组合物的提供仅在一个或多个反应条件方面不同；133.(c)使所述第一组合物的一部分进行第一方面的方法，从而确定所述第一组合物的一个或多个参数；134.(d)使所述第二组合物的相应部分进行步骤(c)中使用的方法，从而确定所述第二组合物的一个或多个参数；以及135.(e)将步骤(c)中获得的第一组合物的一个或多个参数与步骤(d)中获得的第二组合物的相应的一个或多个参数进行比较。136.在第二方面的一实施方案中，所述一个或多个参数包括核酸(如rna)完整性、核酸(如rna)的总量、游离核酸(如rna)的量、与颗粒结合的核酸(如rna)的量、含有核酸(如rna)的颗粒的大小(特别地，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(如rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(如rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg或rh值)以及含有核酸(如rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg或rh值)。一般来说，含有核酸(如rna)的颗粒的大小分布和/或定量大小分布可以作为含有核酸(如rna)的颗粒的数量、含有核酸(如rna)的颗粒的摩尔量或含有核酸(如rna)的颗粒的质量给出，每个作为它们大小的函数。额外的可选参数包括核酸(尤其是rna)的分子量、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(特别地，基于核酸(如rna)的rg和/或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于核酸(如rna)的rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于核酸(如rna)的rg或rh值)、形状因子、形式因子以及核酸(尤其是rna)包裹效率。一般来说，核酸(尤其是rna)的大小分布和/或定量大小分布可以作为核酸(尤其是rna)分子的数量、核酸(尤其是rna)的摩尔量或核酸(尤其是rna)的质量给出，每个作为它们大小的函数。其他额外的可选参数包括与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比，其中所述电荷比通常表示为n/p比并且可以作为颗粒大小的函数给出。137.在第二方面的一实施方案中，所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，如本文指定的参数(包括额外的可选参数)，特别是至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg或rh值)、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg或rh值)以及核酸(尤其是rna)的分子量。在第二方面的一实施方案中，所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于核酸(尤其是rna)的rg或rh值)以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于核酸(尤其rna)的rg或rh值)。138.在第二方面的一实施方案中，步骤(c)和(d)中使用的第一方面的方法是一种方法，包括：139.(a)使组合物的至少部分(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)进行场-流分级，从而将所述组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个组合物级分；140.(b)测量从步骤(a)获得的一个或多个组合物级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，并且任选地测量光散射(ls)信号；以及141.(c)从所述选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。142.在第二方面的第一亚组中，步骤(c)和(d)中使用的第一方面的方法是一种方法，包括：143.(a)使组合物的至少部分(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)进行场-流分级，从而将所述组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个级分；144.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及145.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。146.在第二方面的第二和优选的亚组中，步骤(c)和(d)中使用的第一方面的方法是用于确定样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)的一个或多个参数的方法，其中所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，所述方法包括：147.(a)对所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；148.(b)测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，并且任选地测量光散射(ls)信号；以及149.(c)从所述选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。150.在第二方面的第三和更优选的亚组中，步骤(c)和(d)中使用的第一方面的方法是用于确定样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)的一个或多个参数的方法，其中所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，所述方法包括：151.(a)对所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；152.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及153.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。154.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg值计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第二方面的另一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rh值计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第二方面的另一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg值并分别地基于含有核酸(如rna)的颗粒的rh值计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这个实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。155.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rg值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第二方面的另一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rh值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第二方面的另一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rg值并分别地基于核酸(如rna)的rh值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这个实施方案产生核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。156.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述一个或多个参数包括核酸(尤其是rna)完整性、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小(特别地，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)，以及任选存在的核酸(尤其是rna)的分子量。157.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)以及核酸(尤其是rna)的分子量。在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。但是，根据本发明，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布的这两个数据集仅被视为一个参数(而不是两个参数)。此外，如果通过场-流分级获得的分级图谱显示多于一个颗粒峰，则每个颗粒峰的大小分布的确定仅被视为一个参数(而不是每个颗粒峰的一个参数)。这同样适用于在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布的情况。158.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第二方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))以及任选地本文指定的其余参数(包括额外的可选参数)中的至少一个参数，如至少两个参数；优选这些其余参数选自：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第二方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)和选自以下的至少一个参数，如至少两个参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第二方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、游离核酸(尤其是rna)的量以及与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。但是，根据本发明，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布的这两个数据集仅被视为一个参数(而不是两个参数)。此外，如果通过场-流分级获得的分级图谱显示多于一个颗粒峰，则每个颗粒峰的定量大小分布的确定仅被视为一个参数(而不是每个颗粒峰的一个参数)。这同样适用于在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布的情况。159.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，在步骤(a)-(c)的一个循环中确定所述一个或多个参数。160.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述一个或多个反应条件包括以下任一个：盐浓度/离子强度；温度；ph或缓冲液浓度；光/辐射；氧；剪切力；压力；冷冻/解冻循环；干燥/复原循环；添加赋形剂(例如，稳定剂和/或螯合剂)；颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的类型和/或来源；电荷比；物理状态；以及核酸(尤其是rna)与颗粒形成化合物(特别是构成颗粒的脂质和/或聚合物)的比例。示例性盐浓度包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100mm的盐，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100mmnacl。示例性温度条件包括低温(如-20℃)、环境温度或室温、中温(如30℃)或高温(如50℃)。关于颗粒形成化合物的类型和/或来源的示例性条件是阳离子脂质对阳离子聚合物、阳离子脂质对两性离子脂质或聚乙二醇化脂质对非聚乙二醇化脂质。核酸(尤其是rna)颗粒中正电荷与负电荷的示例性电荷比为约6:1至约1:2，如约5:1至约1.2:2、约4:1至约1.4:2、约3:1至约1.6:2、约2:1至约1.8:2或约1.6:1至约1:1。核酸(尤其是rna)与颗粒形成化合物(特别是构成颗粒的脂质和/或聚合物)的示例性比例包括在约1:100至约10:1(w/w)的范围内的核酸(尤其是rna)与总脂质的比例。161.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述场-流分级优选是流场-流分级，如非对称流场-流分级(af4)或中空纤维流场-流分级(hf5)。162.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，使用具有适合防止核酸(尤其是rna)渗透膜的截留分子量(mw)的膜进行步骤(a)，优选截留mw在2kda-30kda的范围内的膜，如10kda的截留mw的膜。163.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，使用聚醚砜(pes)或再生纤维素膜进行步骤(a)。164.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(a)使用以下进行：(i)高达8ml/min，优选高达4ml/min，更优选高达2ml/min的交叉流速，例如，交叉流速谱；和/或(ii)在0.05-0.35ml/min的范围内，优选在0.10-0.30ml/min的范围内，更优选在0.15-0.25ml/min的范围内的注入流量；和/或(iii)在0.30-0.70ml/min的范围内，优选在0.40-0.60ml/min的范围内，更优选在0.45-0.55ml/min的范围内的检测器流量。165.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述交叉流速谱优选含有分级阶段，其允许将组合物(如对照或样品组合物，特别是用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的组分按其大小分级/分离以产生一个或多个组合物级分。优选交叉流速在这个分级阶段期间发生变化(例如，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，或者从一个值(如约0至约0.1ml/min)开始然后增加至较高的值(如约1至约4ml/min))，其中可以通过任何方式变化，例如，连续(如线性或指数)变化或逐步变化。优选地，交叉流速谱含有分级阶段，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)。分级阶段可以具有适合将组合物中含有的组分按其大小分级/分离的任何长度，例如，约5min至约60min、如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min。交叉流速谱可以含有附加阶段(例如，1、2、3或4个阶段)，其可以在分级阶段之前和/或之后(例如，分级阶段之前1个并且分级阶段之后1、2或3个)，并且可以用来将组合物中含有的非核酸(尤其是非rna)组分(例如，蛋白、多肽、单核苷酸等)与组合物中含有的核酸(尤其是rna)分开，以集中组合物中含有的核酸(尤其是rna)和/或再生场-流分级装置(例如，去除与装置的膜结合的所有组分)。优选地，这些附加阶段的交叉流速对于每个附加阶段是恒定的，并且附加阶段中的每一个的长度对于附加阶段中的每一个而言独立地在约5min至约60min的范围内(如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)。例如，交叉流速谱可以含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速相同(第一附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且与第二附加阶段的那个不同(第三附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)。在其中交叉流速谱含有分级阶段的实施方案中，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，优选交叉流速谱进一步含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速相同(如约1至约4ml/min)(第一附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(如约0.01至0.1ml/min)(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且低于第二附加阶段的那个(例如，所述第三附加阶段的交叉流速是0)(第三附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)。这样的交叉流速谱的优选实例如下：1.0-2.0ml/min持续10min，在30min内从1.0-2.0ml/min至0.01-0.07ml/min的指数梯度；0.01-0.07ml/min持续30min；以及0ml/min持续10min。166.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，使用对照核酸(尤其是rna)的完整性计算样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。167.在第二方面的这个实施方案的第一特定实例中，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：168.(a')使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分(fraction)；169.(b')测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号；170.(c'1)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从一个uv、荧光或ri峰的最大高度到uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；171.(c'2)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及172.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性(i(对照))。173.在这个第一实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：174.(c1)从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的最大高度到样品uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；175.(c2)从步骤(b)获得的样品uv、荧光或ri信号计算步骤(c1)中使用的样品uv、荧光或ri峰的总面积，从而获得a100％(样品)；176.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及177.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。178.在第二方面的这个实施方案的第二特定实例中，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：179.(a”)使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；180.(b”)测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；以及181.(c”)从步骤(b”)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定一个uv、荧光或ri峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性。182.在这个第二实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：183.(c1')从步骤(b)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的高度(h(样品))；以及184.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。185.在第二方面的这个实施方案的第三特定实例中(关于第二方面的第一亚组)，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：186.(a')使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；187.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；188.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；189.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及190.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性(i(对照))。191.在这个第三实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：192.(c1)从步骤(b)获得的uv信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv峰的样品uv峰的最大高度到所述样品uv峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；193.(c2)从步骤(b)获得的样品uv信号计算步骤(c1)中使用的样品uv峰的总面积，从而获得a100％(样品)；194.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及195.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。196.在第二方面的这个实施方案的第四特定实例中(关于第二方面的第一亚组)，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：197.(a”)使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；198.(b”)至少测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；以及(c”)从步骤(b”)中获得的uv信号确定一个uv峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性。199.在这个第四实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：200.(c1')从步骤(b)中获得的uv信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv峰的样品uv峰的高度(h(样品))；以及201.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。202.在第二方面的这个实施方案的第五特定实例中(关于第二方面的第二亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：203.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；204.(b')测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；205.(c'1)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从一个uv、荧光或ri峰的最大高度到uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；206.(c'2)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及207.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性(i(对照))。208.在这个第五实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的rna的完整性：209.(c1)从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的最大高度到样品uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；210.(c2)从步骤(b)获得的样品uv、荧光或ri信号计算步骤(c1)中使用的样品uv、荧光或ri峰的总面积，从而获得a100％(样品)；211.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及212.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。213.在第二方面的这个实施方案的第六特定实例中(关于第二方面的第二亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：214.(a”)使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；215.(b”)测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；以及216.(c”)从步骤(b”)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定一个uv、荧光或ri峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照rna的完整性。217.在这个第六实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的rna的完整性：218.(c1')从步骤(b)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的高度(h(样品))；以及219.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。220.在第二方面的这个实施方案的第七特定实例中(关于第二方面的第三亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：221.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；222.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；223.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；224.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及225.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性(i(对照))。226.在这个第七实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的rna的完整性：227.(c1)从步骤(b)获得的uv信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv峰的样品uv峰的最大高度到所述样品uv峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；228.(c2)从步骤(b)获得的样品uv信号计算步骤(c1)中使用的样品uv峰的总面积，从而获得a100％(样品)；229.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及230.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。231.在第二方面的这个实施方案的第八特定实例中(关于第二方面的第三亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：232.(a”)使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；233.(b”)至少测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；以及234.(c”)从步骤(b”)中获得的uv信号确定一个uv峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照rna的完整性。235.在这个第八实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)中含有的rna的完整性：236.(c1')从步骤(b)中获得的uv信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv峰的样品uv峰的高度(h(样品))；以及237.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。238.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)来确定核酸(尤其是rna)的量。239.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)包含核酸(尤其是rna)和颗粒，如脂质复合物颗粒和/或脂质纳米颗粒和/或polyplex颗粒和/或脂质多聚复合物颗粒和/或病毒样颗粒，核酸(尤其是rna)与所述颗粒结合。240.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定总核酸的量(尤其是总rna的量)：(i)用释放剂处理所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)的至少部分；(ii)用至少从步骤(i)获得的所述部分进行步骤(a)-(c)；以及(iii)如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线))。在这个实施方案中，在第二方面的方法的步骤(a)中，优选使用含有释放剂的液相进行场-流分级。241.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述释放剂是(i)表面活性剂，如阴离子表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)、两性离子表面活性剂(例如，正十四烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐(3-14))、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或它们的混合物；(ii)醇，如脂肪醇(例如，乙醇)，或醇的混合物；或者(iii)(i)和(ii)的组合。242.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定游离核酸(尤其是rna)的量：在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线))。243.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量：从如本文确定的总核酸(尤其是rna)的量(例如，通过(i)用释放剂处理所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)的至少部分；(ii)用至少从步骤(i)获得的所述部分进行步骤(a)-(c)；以及(iii)如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)))减去如本文确定的游离核酸(尤其是rna)的量(例如，通过在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)))。244.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)进一步包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号，如动态光散射(dls)和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。245.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第二或第三亚组的一实施方案中)，通过从步骤(b)获得的ls信号计算回转半径(rg)值和/或流体动力学半径(rh)值来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小。在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号，并且步骤(c)包括从所述dls信号计算rh值。在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的静态光散射(sls)如mals信号，并且步骤(c)包括从所述sls信号计算rg值。在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号和静态光散射(sls)如mals信号，并且步骤(c)包括计算rg和rh值。这个后一实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒大小的两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。246.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过将从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第一实例中(关于第二方面的第一亚组)，通过将从步骤(b)获得的uv信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第二实例中(关于第二方面的第二亚组)，通过将从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第三实例中(关于第二方面的第三亚组)，通过将从步骤(b)获得的uv信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。在上述第一、第二和第三实例的每一个中，可以在rg值、rh值或两者的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值的大小分布和一个基于rh值的大小分布。247.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过将uv、荧光或ri信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv、荧光或ri信号的图计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第一实例中(关于第二方面的第一亚组)，通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv信号的图计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第二实例中(关于第二方面的第二亚组)，通过将uv、荧光或ri信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv、荧光或ri信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第三实例中(关于第二方面的第三亚组)，通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。在上述第一、第二和第三实例的每一个中，可以在rg值、rh值或两者的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值的定量大小分布和一个基于rh值的定量大小分布。248.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述定量大小分布包括d10、d50和/或d90值。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一组基于rg值的d10、d50和/或d90值以及一组基于rh值的d10、d50和/或d90值。249.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过测量uv信号，例如，在260nm-280nm范围内的波长，如在260nm或280nm的波长，并且使用在相应波长(例如，260nm或280nm)处的核酸(尤其是rna)消光系数，来确定核酸(尤其是rna)，特别是游离核酸(尤其是rna)的量。250.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第二方面的第三亚组的优选实施方案中)，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)在10-2000nm的范围内，优选在20-1500nm的范围内，如30-1200nm、40-1100nm、50-1000、60-900nm、70-800nm、80-700nm、90-600nm或100-500nm，或者例如在10-1000nm、15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。在第二方面的第三亚组的优选实施方案中，含有rna的颗粒的(定量)大小分布(例如，基于rg或rh值)在10-1000nm的范围内，例如在15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。251.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述核酸(尤其是rna)的长度为10-15,000个核苷酸，如40-15,000个核苷酸、100-12,000个核苷酸或200-10,000个核苷酸。252.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一亚组的一实施方案中)，所述核酸是rna。在这个实施方案以及第二方面的第二或第三亚组的实施方案中，所述rna优选是mrna或体外转录的rna，特别是体外转录的mrna。253.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，测量选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，任选地ls信号，如sls，例如，mals信号和/或dls信号，是在线进行的，和/或步骤(c)是在线进行的。254.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，在使所述样品组合物(例如，用于步骤(c)的第一组合物或用于步骤(d)的第二组合物)的至少部分进行场-流分级之前，将所述样品组合物的所述至少部分用溶剂或溶剂混合物稀释，所述溶剂或溶剂混合物能够防止颗粒聚集体的形成。在一实施方案中，所述溶剂混合物是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物。255.在第二方面的一实施方案中(特别地，在第二方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，测量uv信号是通过使用圆二色(cd)光谱来进行的。256.应当理解本文在第一方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第二方面的任何实施方案。257.在第三方面，本公开提供场-流分级在确定样品组合物的一个或多个参数中的用途，所述样品组合物包含核酸(如rna)和任选存在的颗粒，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)完整性、核酸(如rna)的总量、游离核酸(如rna)的量、与颗粒结合的核酸(如rna)的量、含有核酸(如rna)的颗粒的大小(特别地，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(如rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(如rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg或rh值)以及含有核酸(如rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg或rh值)。一般来说，含有核酸(如rna)的颗粒的大小分布和/或定量大小分布可以作为含有核酸(如rna)的颗粒的数量、含有核酸(如rna)的颗粒的摩尔量或含有核酸(如rna)的颗粒的质量给出，每个作为它们大小的函数。额外的可选参数包括核酸(如rna)的分子量、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(特别地，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg和/或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于核酸(如rna)的rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于核酸(如rna)的rg或rh值)、形状因子、形式因子以及核酸(尤其是rna)包裹效率。一般来说，核酸(尤其是rna)的大小分布和/或定量大小分布可以作为核酸(尤其是rna)分子的数量、核酸(尤其是rna)的摩尔量或核酸(尤其是rna)的质量给出，每个作为它们大小的函数。其他额外的可选参数包括与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比，其中所述电荷比通常表示为n/p比并且可以作为颗粒大小的函数给出。258.在第三方面的一实施方案中，所述场-流分级包括：259.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；260.(b)测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，并且任选地测量光散射(ls)信号；以及261.(c)从所述选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。262.在第三方面的第一亚组中，所述场-流分级包括：263.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；264.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及265.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。266.在第三方面的第二和优选亚组中，所述用途用于确定样品组合物的一个或多个参数，其中所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，所述场-流分级包括：267.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；268.(b)测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，并且任选地测量光散射(ls)信号；以及269.(c)从所述选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。270.在第三方面的第三和更优选的亚组中，所述用途用于确定样品组合物的一个或多个参数，其中所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，所述场-流分级包括：271.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；272.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及273.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。274.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg值计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第三方面的另一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rh值计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第三方面的另一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，基于含有核酸(如rna)的颗粒的rg值并分别地基于含有核酸(如rna)的颗粒的rh值计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这个实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。275.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rg值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第三方面的另一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rh值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在第三方面的另一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的另一实施方案中)，其中所述一个或多个参数包括核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布，基于核酸(如rna)的rg值并分别地基于核酸(如rna)的rh值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这个实施方案产生核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。276.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述场-流分级是流场-流分级，如非对称流场-流分级(af4)或中空纤维流场-流分级(hf5)。277.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述场-流分级使用具有适合防止核酸(尤其是rna)渗透膜的截留分子量(mw)的膜，优选截留mw在2kda-30kda的范围内的膜，如10kda的截留mw的膜。278.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述场-流分级使用聚醚砜(pes)或再生纤维素膜。279.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(a)使用以下进行：(i)高达8ml/min，优选高达4ml/min，更优选高达2ml/min的交叉流速，例如，交叉流速谱；和/或(ii)在0.05-0.35ml/min的范围内，优选在0.10-0.30ml/min的范围内，更优选在0.15-0.25ml/min的范围内的注入流量；和/或(iii)在0.30-0.70ml/min的范围内，优选在0.40-0.60ml/min的范围内，更优选在0.45-0.55ml/min的范围内的检测器流量。280.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述交叉流速谱优选含有分级阶段，其允许将对照或样品组合物中含有的组分按其大小分级/分离以产生一个或多个样品级分。优选交叉流速在这个分级阶段期间发生变化(例如，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，或者从一个值(如约0至约0.1ml/min)开始然后增加至较高的值(如约1至约4ml/min))，其中可以通过任何方式变化，例如，连续(如线性或指数)变化或逐步变化。优选地，交叉流速谱含有分级阶段，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)。分级阶段可以具有适合将样品组合物中含有的组分按其大小分级/分离的任何长度，例如，约5min至约60min，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min。交叉流速谱可以含有附加阶段(例如，1、2、3或4个阶段)，其可以在分级阶段之前和/或之后(例如，分级之前1个并且分级之后1、2或3个)，并且可以用来将样品组合物中含有的非核酸(尤其是非rna)组分(例如，蛋白、多肽、单核苷酸等)与样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)分开，以集中样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)和/或再生场-流分级装置(例如，去除与装置的膜结合的所有组分)。优选地，这些附加阶段的交叉流速对于每个附加阶段是恒定的，并且附加阶段中的每一个的长度对于附加阶段中的每一个而言独立地在约5min至约60min的范围内(如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)。例如，交叉流速谱可以含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速相同(第一附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且与第二附加阶段的那个不同(第三附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)。在其中交叉流速谱含有分级阶段的实施方案中，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，优选交叉流速谱进一步含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速相同(如约1至约4ml/min)(第一附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(如约0.01至0.1ml/min)(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且低于第二附加阶段的那个(例如，所述第三附加阶段的交叉流速是0)(第三附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)。这样的交叉流速谱的优选实例如下：1.0-2.0ml/min持续10min，在30min内从1.0-2.0ml/min至0.01-0.07ml/min的指数梯度；0.01-0.07ml/min持续30min；以及0ml/min持续10min。281.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，使用对照核酸(尤其是rna)的完整性确定样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。282.在第三方面的这个实施方案的第一特定实例中，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：283.(a')使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；284.(b')测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号；285.(c'1)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从一个uv、荧光或ri峰的最大高度到uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；286.(c'2)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及287.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性(i(对照))。288.在这个第一实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：289.(c1)从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的最大高度到样品uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；290.(c2)从步骤(b)获得的样品uv、荧光或ri信号计算步骤(c1)中使用的样品uv、荧光或ri峰的总面积，从而获得a100％(样品)；291.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及292.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。293.在第三方面的这个实施方案的第二特定实例中，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：294.(a”)使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；295.(b”)测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；以及296.(c”)从步骤(b”)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定一个uv、荧光或ri峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性。297.在这个第二实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：298.(c1')从步骤(b)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的高度(h(样品))；以及299.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。300.在第三方面的这个实施方案的第三特定实例中(关于第三方面的第一亚组)，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：301.(a')使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；302.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；303.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；304.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及305.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性(i(对照))。306.在这个第三实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：307.(c1)从步骤(b)获得的uv信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv峰的样品uv峰的最大高度到所述样品uv峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；308.(c2)从步骤(b)获得的样品uv信号计算步骤(c1)中使用的样品uv峰的总面积，从而获得a100％(样品)；309.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及310.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。311.在第三方面的这个实施方案的第四特定实例中(关于第三方面的第一亚组)，通过以下步骤确定对照核酸(尤其是rna)的完整性：312.(a”)使含有对照核酸(尤其是rna)的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；313.(b”)至少测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；以及314.(c”)从步骤(b”)中获得的uv信号确定一个uv峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照核酸(尤其是rna)的完整性。315.在这个第四实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性：316.(c1')从步骤(b)中获得的uv信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv峰的样品uv峰的高度(h(样品))；以及317.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的完整性。318.在第三方面的这个实施方案的第五特定实例中(关于第三方面的第二亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：319.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；320.(b')测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；321.(c'1)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从一个uv、荧光或ri峰的最大高度到uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；322.(c'2)从步骤(b')中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及323.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性(i(对照))。324.在这个第五实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：325.(c1)从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的最大高度到样品uv、荧光或ri峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；326.(c2)从步骤(b)获得的样品uv、荧光或ri信号计算步骤(c1)中使用的样品uv、荧光或ri峰的总面积，从而获得a100％(样品)；327.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及328.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。329.在第三方面的这个实施方案的第六特定实例中(关于第三方面的第二亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：330.(a”)使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；331.(b”)测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号；以及332.(c”)从步骤(b”)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定一个uv、荧光或ri峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照rna的完整性。333.在这个第六实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：334.(c1')从步骤(b)中获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv、荧光或ri峰的样品uv、荧光或ri峰的高度(h(样品))；以及335.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。336.在第三方面的这个实施方案的第七特定实例中(关于第三方面的第三亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：337.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；338.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；339.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；340.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及341.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性(i(对照))。342.在这个第七实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：343.(c1)从步骤(b)获得的uv信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv峰的样品uv峰的最大高度到所述样品uv峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；344.(c2)从步骤(b)获得的样品uv信号计算步骤(c1)中使用的样品uv峰的总面积，从而获得a100％(样品)；345.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及346.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。347.在第三方面的这个实施方案的第八特定实例中(关于第三方面的第三亚组)，通过以下步骤确定对照rna的完整性：348.(a”)使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；349.(b”)至少测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；以及350.(c”)从步骤(b”)中获得的uv信号确定一个uv峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照rna的完整性。351.在这个第八实例中，可以通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：352.(c1')从步骤(b)中获得的uv信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv峰的样品uv峰的高度(h(样品))；以及353.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。354.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)来确定核酸(尤其是rna)的量。355.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述样品组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，如脂质复合物颗粒和/或脂质纳米颗粒和/或polyplex颗粒和/或脂质多聚复合物颗粒和/或病毒样颗粒，核酸(尤其是rna)与所述颗粒结合。356.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定总核酸(尤其是rna)的量：(i)用释放剂处理所述样品组合物的至少部分；(ii)用至少从步骤(i)获得的所述部分进行步骤(a)-(c)；以及(iii)如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，通过使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线))。在这个实施方案中，在第一方面的方法的步骤(a)中，优选使用含有释放剂的液相进行场-流分级。357.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述释放剂是(i)表面活性剂，如阴离子表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)、两性离子表面活性剂(例如，正十四烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐(3-14))、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或它们的混合物；(ii)醇，如脂肪醇(例如，乙醇)，或醇的混合物；或者(iii)(i)和(ii)的组合。358.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定游离核酸(尤其是rna)的量：在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线))。359.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过以下来确定与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量：从如本文确定的总核酸(尤其是rna)的量(例如，通过(i)用释放剂处理所述样品组合物的至少部分；(ii)用至少从步骤(i)获得的所述部分进行步骤(a)-(c)；以及(iii)如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)))减去如本文确定的游离核酸(尤其是rna)的量(例如，通过在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量(例如，使用(i)核酸消光系数(尤其是rna消光系数)或(ii)核酸校准曲线(尤其是rna校准曲线)))。360.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)进一步包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号，如动态光散射(dls)信号和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。361.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过从步骤(b)获得的ls信号计算回转半径(rg)值和/或流体动力学半径(rh)值来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小。在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号，并且步骤(c)包括从所述dls信号计算rh值。在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的静态光散射(sls)如mals信号，并且步骤(c)包括从所述sls信号计算rg值。在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号和静态光散射(sls)如mals信号，并且步骤(c)包括计算rg和rh值。这个后一实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒大小的两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。362.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过将从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第一实例中(关于第三方面的第一亚组)，通过将从步骤(b)获得的uv信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第二实例中(关于第三方面的第二亚组)，通过将从步骤(b)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。在这个实施方案的第三实例中(关于第三方面的第三亚组)，通过将从步骤(b)获得的uv信号对如本文所述确定的rg或rh值(例如，通过从步骤(b)获得的sls信号计算rg值或通过从步骤(b)获得的dls信号计算rh值)作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。在上述第一、第二和第三实例的每一个中，可以在rg值、rh值或两者的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值的大小分布和一个基于rh值的大小分布。363.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过将uv、荧光或ri信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv、荧光或ri信号的图计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第一实例中(关于第三方面的第一亚组)，通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv信号的图计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第二实例中(关于第三方面的第二亚组)，通过将uv、荧光或ri信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv、荧光或ri信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。在这个实施方案的第三实例中(关于第三方面的第三亚组)，通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。在上述第一、第二和第三实例的每一个中，可以在rg值、rh值或两者的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值的定量大小分布和一个基于rh值的定量大小分布。364.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述定量大小分布包括d10、d50和/或d90值。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一组基于rg值的d10、d50和/或d90值以及一组基于rh值的d10、d50和/或d90值。365.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，如本文指定的参数(包括额外的任选参数)，特别是至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(特别地，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。但是，根据本发明，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布的这两个数据集仅被视为一个参数(而不是两个参数)。此外，如果通过场-流分级获得的分级图谱显示多于一个颗粒峰，则每个颗粒峰的大小分布的确定仅被视为一个参数(而不是每个颗粒峰的一个参数)。这同样适用于在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布的情况。366.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第三方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))以及任选地本文指定的其余参数(包括额外的可选参数)中的至少一个参数，如至少两个参数；优选这些其余参数选自：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第三方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)和选自以下的至少一个参数，如至少两个参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第三方面的第三亚组的优选实施方案中)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、游离核酸(尤其是rna)的量以及与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。但是，根据本发明，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布的这两个数据集仅被视为一个参数(而不是两个参数)。此外，如果通过场-流分级获得的分级图谱显示多于一个颗粒峰，则每个颗粒峰的定量大小分布的确定仅被视为一个参数(而不是每个颗粒峰的一个参数)。这同样适用于在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布的情况。367.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，在步骤(a)-(c)的一个循环中确定所述一个或多个参数。368.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，通过测量uv信号，例如，在260nm-280nm范围内的波长，如在260nm或280nm的波长，并且使用在相应波长(例如，260nm或280nm)处的核酸(尤其是rna)消光系数，来确定核酸(尤其是rna)，特别是游离核酸(尤其是rna)的量。369.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中，特别是在第三方面的第三亚组的优选实施方案中)，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)在10-2000nm的范围内，优选在20-1500nm的范围内，如30-1200nm、40-1100nm、50-1000、60-900nm、70-800nm、80-700nm、90-600nm或100-500nm，或者例如在10-1000nm、15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。在第三方面的第三亚组的优选实施方案中，含有rna的颗粒的(定量)大小分布(例如，基于rg或rh值)在10-1000nm的范围内，例如在15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。370.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，所述核酸(尤其是rna)的长度为10-15,000个核苷酸，如40-15,000个核苷酸、100-12,000个核苷酸或200-10,000个核苷酸。371.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一亚组的一实施方案中)，所述核酸是rna。在这个实施方案以及第三方面的第二或第三亚组的实施方案中，所述rna优选是mrna或体外转录的rna，特别是体外转录的mrna。372.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，测量选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号，任选地ls信号，如sls，例如，mals信号和/或dls信号，是在线进行的，和/或步骤(c)是在线进行的。373.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，在使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级之前，将所述样品组合物的所述至少部分用溶剂或溶剂混合物稀释，所述溶剂或溶剂混合物能够防止颗粒聚集体的形成。在一实施方案中，所述溶剂混合物是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物。374.在第三方面的一实施方案中(特别地，在第三方面的第一、第二或第三亚组的一实施方案中)，测量uv信号是通过使用圆二色(cd)光谱来进行的。375.应当理解本文在第一或第二方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第三方面的任何实施方案。376.进一步的实施方案如下：377.1.一种用于确定样品组合物的一个或多个参数的方法，其中所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，所述方法包括：378.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；379.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及380.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数，381.其中所述一个或多个参数包括rna完整性、rna的总量、游离rna的量、与颗粒结合的rna的量、含有rna的颗粒的大小、含有rna的颗粒的大小分布以及含有rna的颗粒的定量大小分布。382.2.项目1的方法，其中所述场-流分级是流场-流分级，如非对称流场-流分级(af4)或中空纤维流场-流分级(hf5)。383.3.项目1或2的方法，其中使用具有适合防止rna渗透膜的截留分子量(mw)的膜进行步骤(a)，优选截留mw在2kda-30kda的范围内的膜，如10kda的截留mw的膜。384.4.项目1-3中任一项的方法，其中使用聚醚砜(pes)或再生纤维素膜进行步骤(a)。385.5.项目1-4中任一项的方法，其中使用高达8ml/min，优选高达4ml/min，更优选高达2ml/min的交叉流速进行步骤(a)。386.6.项目1-5中任一项的方法，其中使用以下交叉流速谱进行步骤(a)：1.0-2.0ml/min持续10min，在30min内从1.0-2.0ml/min至0.01-0.07ml/min的指数梯度；0.01-0.07ml/min持续30min；以及0ml/min持续10min。387.7.项目1-6中任一项的方法，其中使用在0.05-0.35ml/min的范围内，优选在0.10-0.30ml/min的范围内，更优选在0.15-0.25ml/min的范围内的注入流量进行步骤(a)。388.8.项目1-7中任一项的方法，其中使用在0.30-0.70ml/min的范围内，优选在0.40-0.60ml/min的范围内，更优选在0.45-0.55ml/min的范围内的检测器流量进行步骤(a)。389.9.项目1-8中任一项的方法，其中使用对照rna的完整性计算所述样品组合物中含有的rna的完整性。390.10.项目9的方法，其中通过以下步骤确定对照rna的完整性：391.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；392.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；393.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；394.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及395.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性(i(对照))。396.11.项目10的方法，其中通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：397.(c1)从步骤(b)获得的样品uv信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv峰的样品uv峰的最大高度到所述样品uv峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；398.(c2)从步骤(b)获得的样品uv信号计算步骤(c1)中使用的样品uv峰的总面积，从而获得a100％(样品)；399.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及400.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。401.12.项目9的方法，其中通过以下步骤确定计算对照rna的完整性：402.(a”)使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；403.(b”)至少测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；以及(c”)从步骤(b”)中获得的uv信号确定一个uv峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照rna的完整性。404.13.项目12的方法，其中通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：405.(c1')从步骤(b)中获得的uv信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv峰的样品uv峰的高度(h(样品))；以及406.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。407.14.项目1-13中任一项的方法，其中通过使用(i)rna消光系数或(ii)rna校准曲线来确定rna的量。408.15.项目1-14中任一项的方法，其中所述样品组合物包含rna和颗粒，如脂质复合物颗粒和/或脂质纳米颗粒和/或polyplex颗粒和/或脂质多聚复合物颗粒和/或病毒样颗粒，rna与所述颗粒结合。409.16.项目15的方法，其中通过以下来确定总rna的量：(i)用释放剂处理所述样品组合物的至少部分；(ii)用至少从步骤(i)获得的所述部分进行步骤(a)-(c)；以及(iii)如项目14所述确定rna的量。410.17.项目16的方法，其中在步骤(a)中使用含有释放剂的液相进行场-流分级。411.18.项目16或17的方法，其中所述释放剂是(i)表面活性剂，如阴离子表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)、两性离子表面活性剂(例如，正十四烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐(3-14))、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或它们的混合物；(ii)醇，如脂肪醇(例如，乙醇)，或醇的混合物；或者(iii)(i)和(ii)的组合。412.19.项目15-18中任一项的方法，其中通过以下来确定游离rna的量：在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如项目14所述确定rna的量。413.20.项目15-19中任一项的方法，其中通过从如项目16-18中任一项确定的总rna的量减去如项目19确定的游离rna的量来确定与颗粒结合的rna的量。414.21.项目15-20中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号，如动态光散射(dls)信号和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。415.22.项目21的方法，其中通过从步骤(b)获得的ls信号计算回转半径(rg)值和/或流体动力学半径(rh)值来确定含有rna的颗粒的大小。416.23.项目21的方法，其中使实验确定的rg和/或rh值平滑，优选通过将实验确定或计算的rg或rh值拟合为多项式或线性函数并基于多项式或线性拟合重新计算rg或rh值。417.24.项目21-23中任一项的方法，其中通过将从步骤(b)获得的uv信号对如项目22所述确定的rg或rh值作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。418.25.项目21-24中任一项的方法，其中通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg值的函数的uv信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。419.26.项目25的方法，其中所述定量大小分布包括d10、d50和/或d90值。420.27.项目22-26中任一项的方法，其中步骤(b)包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号，并且步骤(c)包括从所述dls信号计算rh值。421.28.项目15-27中任一项的方法，其中所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离rna的量、与颗粒结合的rna的量、含有rna的颗粒的大小分布以及含有rna的颗粒的定量大小分布。422.29.项目15-28中任一项的方法，其中通过测量在260nm处的uv信号并使用在260nm处的rna消光系数或者通过测量在280nm处的uv信号并使用在280nm处的rna消光系数来确定rna，特别是游离rna的量。423.30.项目1-29中任一项的方法，其中含有rna的颗粒的大小分布和/或含有rna的颗粒的定量大小分布在20-1500nm的范围内，如30-1200nm、40-1100nm、50-1000、60-900nm、70-800nm、80-700nm、90-600nm或100-500nm，例如在10-1000nm、15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。424.31.项目1-30中任一项的方法，其中所述rna的长度为10-15,000个核苷酸，如40-15,000个核苷酸、100-12,000个核苷酸或200-10,000个核苷酸。425.32.项目1-31中任一项的方法，其中所述rna是体外转录的rna，特别是体外转录的mrna。426.33.项目1-32中任一项的方法，其中测量uv信号，任选地ls信号，如sls，例如，mals信号和/或dls信号，是在线进行的，和/或步骤(c)是在线进行的。427.34.项目15-33中任一项的方法，其中在使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级之前，将所述样品组合物的所述至少部分用溶剂或溶剂混合物稀释，所述溶剂或溶剂混合物能够防止颗粒聚集体的形成。428.35.项目34的方法，其中所述溶剂混合物是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物。429.35a.项目1-35中任一项的方法，其中测量uv信号是通过使用圆二色(cd)光谱来进行的。430.36.一种分析在提供包含rna和任选存在的颗粒的组合物时改变一个或多个反应条件的影响的方法，所述方法包括：431.(a)提供包含rna和任选存在的颗粒的第一组合物；432.(b)提供包含rna和任选存在的颗粒的第二组合物，其中所述第二组合物的提供与所述第一组合物的提供仅在一个或多个反应条件方面不同；433.(c)使所述第一组合物的部分进行项目1-35和35a中任一项的方法，从而确定所述第一组合物的一个或多个参数；434.(d)使所述第二组合物的相应部分进行步骤(c)中使用的方法，从而确定所述第二组合物的一个或多个参数；以及435.(e)将步骤(c)中获得的第一组合物的一个或多个参数与步骤(d)中获得的第二组合物的相应的一个或多个参数进行比较。436.37.项目36的方法，其中所述一个或多个反应条件包括以下任一个：盐浓度/离子强度(例如，2mmnacl或100mmnacl)；温度(例如，低温(如-20℃)或高温(如50℃))；ph或缓冲液浓度；光/辐射；氧；剪切力；压力；冷冻/解冻循环；干燥/复原循环；添加赋形剂(例如，稳定剂和/或螯合剂)；颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物，例如，阳离子脂质对阳离子聚合物、阳离子脂质对两性离子脂质或聚乙二醇化脂质对非聚乙二醇化脂质)的类型和/或来源；电荷比；物理状态；以及rna与颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的比例。437.38.场-流分级在确定样品组合物的一个或多个参数中的用途，所述样品组合物包含rna和任选存在的颗粒，其中所述一个或多个参数包括rna完整性、rna的总量、游离rna的量、与颗粒结合的rna的量、含有rna的颗粒的大小(如含有rna的颗粒的流体动力学半径)、含有rna的颗粒的大小分布以及含有rna的颗粒的定量大小分布。438.39.项目38的用途，其中所述场-流分级包括：439.(a)使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级，从而将所述样品组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个样品级分；440.(b)至少测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的uv信号和任选的光散射(ls)信号；以及441.(c)从所述uv信号并且任选地从所述ls信号计算所述一个或多个参数。442.40.项目38或39的用途，其中所述场-流分级是流场-流分级，如非对称流场-流分级(af4)或中空纤维流场-流分级(hf5)。443.41.项目38-40中任一项的用途，其中所述场-流分级使用具有适合防止rna渗透膜的截留分子量(mw)的膜，优选截留mw在2kda-30kda的范围内的膜，如10kda的截留mw的膜。444.42.项目38-41中任一项的用途，其中所述场-流分级使用聚醚砜(pes)或再生纤维素膜。445.43.项目39-42中任一项的用途，其中步骤(a)使用以下进行：446.(i)高达8ml/min，优选高达4ml/min，更优选高达2ml/min的交叉流速，如以下交叉流速谱：1.0-2.0ml/min持续10min，在30min内从1.0-2.0ml/min至0.01-0.07ml/min的指数梯度；0.01-0.07ml/min持续30min；以及0ml/min持续10min；和/或(ii)在0.05-0.35ml/min的范围内，优选在0.10-0.30ml/min的范围内，更优选在0.15-0.25ml/min的范围内的注入流量；和/或447.(iii)在0.30-0.70ml/min的范围内，优选在0.40-0.60ml/min的范围内，更优选在0.45-0.55ml/min的范围内的检测器流量。448.44.项目38-43中任一项的用途，其中使用对照rna的完整性确定所述样品组合物中含有的rna的完整性。449.45.项目44的用途，其中通过以下步骤确定对照rna的完整性：450.(a')使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；451.(b')至少测量从步骤(a')获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；452.(c'1)从步骤(b')中获得的uv信号计算从一个uv峰的最大高度到所述uv峰末端的面积，从而获得a50％(对照)；453.(c'2)从步骤(b')中获得的uv信号计算步骤(c'1)中使用的一个峰的总面积，从而获得a100％(对照)；以及454.(c'3)确定a50％(对照)和a100％(对照)之间的比例，从而获得所述对照rna的完整性(i(对照))。455.46.项目45的用途，其中通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：456.(c1)从步骤(b)获得的样品uv信号计算从对应于步骤(c'1)中使用的对照uv峰的样品uv峰的最大高度到所述样品uv峰末端的面积，从而获得a50％(样品)；457.(c2)从步骤(b)获得的样品uv信号计算步骤(c1)中使用的样品uv峰的总面积，从而获得a100％(样品)；458.(c3)确定a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)；以及459.(c4)确定i(样品)和i(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。460.47.项目44的用途，其中通过以下步骤确定计算对照rna的完整性：461.(a”)使含有对照rna的对照组合物的至少部分进行场-流分级，特别是af4或hf5，从而将所述对照组合物中含有的组分按其大小分级以产生一个或多个对照级分；462.(b”)至少测量从步骤(a”)获得的一个或多个对照级分中至少一个的uv信号；以及463.(c”)从步骤(b”)中获得的uv信号确定一个uv峰的高度(h(对照))，从而获得所述对照rna的完整性。464.48.项目47的用途，其中通过以下步骤计算所述样品组合物中含有的rna的完整性：465.(c1')从步骤(b)中获得的uv信号确定对应于步骤(c”)中使用的对照uv峰的样品uv峰的高度(h(样品))；以及466.(c2')确定h(样品)和h(对照)之间的比例，从而获得所述样品组合物中含有的rna的完整性。467.49.项目38-48中任一项的用途，其中通过使用(i)rna消光系数或(ii)rna校准曲线来确定rna的量。468.50.项目39-49中任一项的用途，其中所述样品组合物包含rna和颗粒，如脂质复合物颗粒和/或脂质纳米颗粒和/或polyplex颗粒和/或脂质多聚复合物颗粒和/或病毒样颗粒，rna与所述颗粒结合和/或所述颗粒中含有rna。469.51.项目50的用途，其中通过以下来确定总rna的量：(i)用释放剂处理所述样品组合物的至少部分；(ii)用至少从步骤(i)获得的所述部分进行步骤(a)-(c)；以及(iii)如项目49所述确定rna的量。470.52.项目51的用途，其中在步骤(a)中使用含有释放剂的液相进行场-流分级。471.53.项目51或52的用途，其中所述释放剂是(i)表面活性剂，如阴离子表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)、两性离子表面活性剂(例如，正十四烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐(3-14))、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或它们的混合物；(ii)醇，如脂肪醇(例如，乙醇)，或醇的混合物；或者(iii)(i)和(ii)的组合。472.54.项目50-53中任一项的用途，其中通过以下来确定游离rna的量：在不添加释放剂的情况下，特别是在不存在任何释放剂的情况下进行步骤(a)-(c)；以及如项目49所述确定rna的量。473.55.项目50-54中任一项的用途，其中通过从如项目51-53中任一项确定的总rna的量减去如项目53确定的游离rna的量来确定与颗粒结合的rna的量。474.56.项目50-55中任一项的用途，其中步骤(b)进一步包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号，如动态光散射(dls)信号和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。475.57.项目56的用途，其中通过从步骤(b)获得的ls信号计算回转半径(rg)值和/或流体动力学半径(rh)值来确定含有rna的颗粒的大小。476.58.项目57的用途，其中使实验确定的rg和/或rh值平滑，优选通过将实验确定或计算的rg或rh值拟合为多项式或线性函数并基于多项式或线性拟合重新计算rg或rh值。477.59.项目56-58中任一项的用途，其中通过将从步骤(b)获得的uv信号对如项目57所述确定的rg或rh值作图来确定含有rna的颗粒的大小分布。478.60.项目56-59中任一项的用途，其中通过将uv信号转换为累积重量分数并将累积重量分数对rg或rh值作图，从显示作为rg或rh值的函数的uv信号的图计算含有rna的颗粒的定量大小分布。479.61.项目60的用途，其中所述定量大小分布包括d10、d50和/或d90值。480.62.项目57-61中任一项的用途，其中步骤(b)进一步包括测量从步骤(a)获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号，并且步骤(c)包括从所述dls信号计算rh值。481.63.项目50-62中任一项的用途，其中所述一个或多个参数包括(或是)至少两个，优选至少三个，选自以下的参数：游离rna的量、与颗粒结合的rna的量、含有rna的颗粒的大小分布以及含有rna的颗粒的定量大小分布。482.64.项目50-63中任一项的用途，其中通过测量在260nm处的uv信号并使用在260nm处的rna消光系数或者通过测量在280nm处的uv信号并使用在280nm处的rna消光系数来确定rna，特别是游离rna的量。483.65.项目38-64中任一项的用途，其中含有rna的颗粒的大小分布和/或含有rna的颗粒的定量大小分布在20-1500nm的范围内，如30-1200nm、40-1100nm、50-1000、60-900nm、70-800nm、80-700nm、90-600nm或100-500nm，例如在10-1000nm、15-500nm、20-450nm、25-400nm、30-350nm、40-300nm或50-250nm的范围内。484.66.项目38-64中任一项的用途，其中所述rna的长度为10-15,000个核苷酸，如40-15,000个核苷酸、100-12,000个核苷酸或200-10,000个核苷酸。485.67.项目38-65中任一项的用途，其中所述rna是体外转录的rna，特别是体外转录的mrna。486.68.项目39-67中任一项的用途，其中测量uv信号，任选地ls信号，如sls，例如，mals信号和/或dls信号，是在线进行的，和/或步骤(c)是在线进行的。487.69.项目39-68中任一项的用途，其中在使所述样品组合物的至少部分进行场-流分级之前，将所述样品组合物的所述至少部分用溶剂或溶剂混合物稀释，所述溶剂或溶剂混合物能够防止颗粒聚集体的形成。488.70.项目69的用途，其中所述溶剂混合物是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物。489.70a.项目39-70中任一项的用途，其中测量uv信号是通过使用圆二色(cd)光谱来进行的。490.在第四方面，本公开提供一种数据处理设备/系统，其包括用于执行本公开的任何方法的装置，特别是第一方面的方法(例如，如项目1-35和35a中任一项定义的方法)和/或第二方面的方法(例如，如项目36或37中定义的方法)。491.在第五方面，本公开提供一种计算机程序，适合执行本公开的任何方法，特别是第一方面的方法(例如，如项目1-35和35a中任一项定义的方法)和/或第二方面的方法(例如，如项目36或37中定义的方法)。492.在第六方面，本公开提供一种计算机可读存储介质或数据载体，其包括本公开的第五方面的程序。493.本文公开了本公开的其他方面。附图说明494.图1示出非对称流场-流分级(af4)分离的时间-流量谱，其中检测器流量(vd)为0.5ml/min，交叉流(vx)起始点为1.5ml/min，并且呈指数下降至0.04ml/min。495.图2示出用于估计相对rna完整性的优选计算程序的概况。分离rna之后用在260nm处的uv信号显示af4分级图谱的实例。a)用于对照rna的计算的限值(limit)。b)用于总rna峰面积的计算的限值。c)用于略微降解的rna的计算的限值。d)用于总略微降解的rna峰面积的计算的限值。496.图3示出不使用标准品的rna定量：a)通过af4-uv-ri分析不同注入体积的rna储备溶液。将曲线下的峰面积(uv实线；ri虚线)对注入体积作图，并且拟合线性回归。b)通过af4-uv-ri用相同注入体积测量rna的连续稀释，并且如a)进行分析。497.图4示出使用af4-uv-ri且不使用标准品的降解rna定量：a)示出不同热降解的rna和未处理的rna的代表性af4分级图谱(曲线代表在260nm处的uv信号)。b)应用lambert-beer定律，不同降解rna的uv信号与浓度直接相关。498.图5示出从通过本文公开的af4方法分离的样品颗粒组合物(含有摩尔比为1.3/2的脂质和rna)获得的代表性分级图谱。实线代表在90°角的光散射(ls)信号并指示颗粒峰(t＝～35min)，而虚线代表uv信号(在260nm处记录)并反映结合(t＝～38min)和未结合的rna(t＝～20min)。499.图6示出非配制的rna的定量rna完整性测量：a)不同热降解rna的代表性af4分级图谱(n＝3；曲线代表在260nm处的uv信号)。b)热降解的长度不同的4种rna(rna#1-4；大小：986-1688nt)的平均计算的相对完整性的概括。误差棒代表标准差(n＝3)。c)使用不同比例(未处理的、完全热降解的以及未处理与完全热降解的50:50混合物)从rna#2获得的代表性af4分级图谱。d)验证实验：将不同rna(rna#1-3，986-1688nt)热降解，以规定方式混合(对于混合物4的af4分级图谱，见图6c)并通过af4-uv测量进行分析。条形图表示与理论计算值(黑色条)相比，用本文公开的af4方法(深、中和浅灰色条)确定的相对rna完整性。500.图7证明与使用荧光染料定量rna相比，uv信号用于定量rna的适用性(概念验证)。a)样品组合物(包含rna和荧光标记的颗粒)的uv峰以及荧光(fs)积分与样品组合物中相应的总rna量相关。b)据发现样品组合物的uv与fs峰面积的计算比例在很宽的质量范围内(样品组合物中1-15μg总rna)是恒定的。501.图8示出作为rna样品组合物参数的uv比例。a)游离rna以及与颗粒结合的rna的uv峰积分与样品组合物中含有的相应标称总rna量相关。b)游离rna(峰)和结合的rna(峰)的uv比例的计算。502.图9示出通过af4-uv-mals定量颗粒大小分布的概念验证。a)样品组合物(rna和atto594标记的颗粒)的代表性af4分级图谱：虚线代表在260nm处记录的uv迹线，实线代表在624nm处发射的荧光信号(fs)。b)计算uv/fs比例(虚线)并将其对回转半径(rg)和记录的来自颗粒峰级分(洗脱时间：22-60min)的uv信号(突出显示的灰色峰)作图。将变化低于uv/fs比例的50％的rg区域突出显示(框)。在50和300nm之间的rg范围内，uv/fs比例的变化很小，并且给出可靠的大小值。较小的rg值受rna信号的影响。较大的rg值受散射的影响。总的来说，这些受影响的rg值低于总信号量的10％。c)使用在624nm处的荧光发射和在260nm处的uv信号基于累积重量分数分析计算定量质量(quality)参数(d10、d50、d90)。503.图10示出样品组合物(rna和颗粒)的代表性af4分级图谱，用在90°的ls信号和在260nm处的uv检测。计算的回转半径(rg)值(灰色方块)源自使用berry图的多角度光散射(mals)，而流体动力学半径(rh)值源自在线动态光散射(dls；灰色圆圈)。504.图11示出通过使用af4-uv-mals定量复杂样品组合物中的颗粒大小分布。a)示出样品组合物(rna和颗粒)的af4-uv-mals洗脱谱、用于rna检测的260nm处的uv信号(虚线)和在90°的光散射信号(实线)。来自mals信号的相应回转半径(rg)值显示为黑点。b)将颗粒峰(洗脱时间：26-55min)的实验确定的rms值拟合为多项式方程(浅灰色线)。c)将uv信号(实线)作图为多项式拟合的rg值的函数(见图11b)，并且将相应的累积重量分数作图为uv信号的函数(虚线)。505.图12示出使用本文公开的af4方法对不同样品组合物(通过将不同脂质/rna比例(0.1-0.9)的脂质和rna与100mmnacl混合制备)的分离和定性分析。a)对于每种不同的样品组合物，叠加显示uv信号(在260nm)、光散射信号(在90°)和使用berry图计算的相应回转半径(rg)值。b)将计算自mals信号的rg值与适当的累积重量分数分析作图，然后计算相应的d90值。c)将源自累积重量分数分析的rg(d90)值作图为具有100mmnacl(黑点)或没有nacl(空心点)的脂质/rna比例的函数。506.图13示出通过将流体动力学半径(rh)值与rg值关联来估计“形状因子”。这些值适合线性回归，并且产生的斜率提供关于颗粒形状的信息。507.图14示出通过本文公开的af4方法分离和表征不同颗粒组合物(lpx、lnp、polyplex颗粒(plx)、脂质体、vlps+lpx)。显示的是af4-uv-mals-dls分离/检测。在90°角的ls显示为实线，并且表示颗粒峰。虚线代表在260nm处记录的uv信号(用于rna检测)。回转半径(rg)值(黑点)源自使用zimm图的多角度光散射(mals)信号。动态光散射(dls；灰点)提供流体动力学半径(rh)。单个颗粒峰级分通过灰色条突出显示。a)在af4-uv-mals-dls分离/检测之后，含有摩尔比为1.3/2的脂质和rna的lpx样品的代表性分级图谱。b)包含两种类型的颗粒(短rna-lpx:vlp，1:1混合物)的组合物的代表性分级图谱。c)脂质体样品(带正电荷的脂质体，由摩尔比为2/1的dotma和dope组成)的代表性分级图谱。d)lpx样品(带正电荷的lpx，含有dotma和胆固醇，以及摩尔比为4/1的rna)的代表性分级图谱。e)脂质纳米颗粒(lnp)样品的代表性分级图谱，由dodma、胆固醇、dope、peg(摩尔比为1.2/1.44/0.3/0.06)和摩尔比为3/1的rna组成。f)颗粒的代表性分级图谱，含有jetpei聚合物以及ivt-rna或sarna，颗粒与rna的比例为12/1。508.图15示出在离子(氯化钠)的存在下rna行为的分析。示出来自不同氯化钠浓度(0-50mm)的非配制rna的示例性af4分级图谱(示出在90°的光散射信号)。回转半径(rg)值源自使用zimm图的多角度光散射(mals)。509.图16示出用氯化钠处理之后rna的表征。a)示出不同氯化钠浓度(0-50mm)的源自累积重量分数分析的rg(d50)值。b)将rnarg(d50)值(来自图16a)对氯化钠浓度作图，并且计算比例(mm氯化钠对nmrg)。从0至10mmnacl值的比例的线性拟合由粗线表示，而点线(dottedline)表示从10至50mmnacl的拟合。灰线和黑线代表用两种不同rna浓度测量的实例。510.图17示出复杂样品组合物中游离/未结合的rna的定量。a)使用本文公开的af4方法，在没有颗粒的组合物中通过在260nm处的uv吸收检测不同量的游离rna(1-15μg)。将rna量对各自的uv峰曲线下面积(auc*min)作图以产生线性校准曲线。b)通过af4方法分析不同量的颗粒组合物(含有1-15μg总rna)。叠加的af4分级图谱示出260nm处的uv信号。第一个峰(洗脱时间：～20min)对应于游离rna，而第二个峰(洗脱时间：～38min)对应于颗粒(结合的rna)。可以相对于参考rna(＝100％)计算颗粒组合物中游离、未结合的rna的量(见图17a)。c)为了显示该方法的线性，将游离rna(见图17b)以及参考、裸rna(见图17a)的uv峰积分作图为不同rna量(1-15μg)的函数。d)作为定量游离rna的第二种、优选程序(直接方法)，定义未结合的rna峰，并且可以使用rna的特定消光系数直接计算rna量。511.图18示出具有不同物理化学行为的样品组合物中游离rna量的分析。示出a)没有nacl的颗粒组合物(以可变电荷比例(0.1-0.9)混合的(dotma/dope2/1)/rna复合物)或b)具有100mmnac的颗粒组合物的af4-uv分级图谱。c)使用在260nm处的af4-uv检测，具有100mmnacl(黑色圆圈)和没有nacl(空心圆圈)的计算的、未结合的rna的百分比(mol/mol)图。所有混合物均一式两份制备并至少一式两份测量。误差棒代表标准差。d)通过使用260nm处rna的消光系数计算的具有100mmnacl(黑色圆圈)和没有nacl(空心圆圈)的未结合的rna浓度(μg/ml)的图。512.图19示出颗粒组合物中总rna的定量。a)通过本文公开的af4方法分离的zwittergent处理的、裸rna的af4分级图谱。260nm处的uv信号由黑线表示，90°的ls信号由虚线表示。b)具有uv检测(实线)，有游离rna(以灰色突出显示)和结合的rna(第二个峰)，90°角的ls信号(虚线)的颗粒组合物的代表性分级图谱。c)rna组合物的相应af4分级图谱，其中已使用释放剂(含有0.1％zwittergent的液相)溶解颗粒，具有uv检测(实线)和90°的光散射(虚线)。d)用释放剂(zwittergent)处理之后裸rna和总rna的直接定量。513.图20示出含有rna和颗粒的样品组合物中游离rna和总rna的完整性。a)使用本文公开的af4方法分离的的颗粒的uv迹线，所述颗粒具有的rna的rna完整性不同(未处理的rna：黑色实线；部分热降解的rna：点线；混合物(以定义的方式混合50％未处理的和50％完全降解的)：虚线；颗粒中完全降解的rna：灰色实线)。b)颗粒中完整游离rna(深灰色)以及总游离rna(黑色)和完全降解的(浅灰色)游离rna的定量。c)af4分离(在液相中使用释放剂)之后溶解的颗粒的uv迹线。d)通过af4-uv测量颗粒中游离和总rna分析的确定的完整性。条形图表示与颗粒中总rna值的确定的完整性(黑色条)相比游离rna的相对rna完整性(灰色条)。514.图21示出如何通过本文公开的af4方法确定rna的不同级分(总的、结合的、包裹的、可接近的、表面的和未结合的rna)的方案。例如，af4方法可以用于使用嵌入性染料(例如，gelred)的荧光发射信号定量可接近的rna和/或表面rna。游离的(未结合的)、总的和可接近的rna的定量组合可以用来计算包裹的、结合的和表面rna。gelred在600nm处的荧光发射通过嵌入rna增强。515.图22示出(a)使用本文公开的af4方法的荧光检测的线性；(b)显示可接近的(黑色条)和包裹的(灰色条)rna的相对量的条形图；以及(c)颗粒组合物中游离rna的相对量的比较，其中已使用不同的rna检测法确定量：260nm处的uv吸收(黑色条)和600nm处的荧光发射信号(fs)(灰色条)。516.图23示出在不使用参考rna的情况下用本文公开的af4方法对rna完整性的分析。a)显示的是具有90°的ls信号(点线)和260nm处的uv信号(实线)的长sarna的示例性af4分级图谱。粗黑线代表源自mals信号的分子量曲线。b)为了更好的概述，在图23b的上图中仅将来自(a)的分子量曲线显示为实线。基于总uv峰信号(即，从t＝10min至t＝40min)设置总rna峰(峰1)的限值。这里，由如下来自分子量曲线的一阶导数(源自mals)设置“完整”rna峰(峰2)的限值。计算分子量曲线的一阶导数(图23b下图中的点线)。分子量曲线的更水平部分反映保留时间，其中存在未降解的rna的级分。在这个基础上，可以选择积分极限，并且可以计算样品中未降解的rna的量。517.图24示出游离和结合的rna的定量分析，使用uv确定颗粒大小分布，特别是累积rna重量分数，rna脂质复合物(lpx)级分中的rna质量和每lpx级分的rna拷贝数。a)显示的具有90°的ls信号(实线)和260nm处的uv信号(虚线)的rnalpx样品组合物的代表性af4分级图谱。uv信号显示两个峰，其中第一个峰代表游离的、未结合的rna的量，而第二个峰来自包含rna的lpx纳米颗粒。uv信号直接代表不同级分中的rna量，作为洗脱时间的函数。回转半径(rg，粗线)源自mals信号。b)显示的是来自图24a的260nm处的uv信号(虚线)，实线显示基于uv信号下面积的累积重量分数。c)显示的是通过在包括特定大小的颗粒的不同rg级分laboratorypress,coldspringharbor1989)。524.在整个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及变化如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为意指包括所陈述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。术语“基本上由…组成”表示排除具有任何实质意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含”涵盖术语“基本上由…组成”，而后者又涵盖术语“由…组成”。因此，在本技术中每次出现时，术语“包含”可以替换为术语“基本上由…组成”或“由…组成”。同样，在本技术中每次出现时，术语“基本上由…组成”可以替换为术语“由…组成”。525.在描述本公开的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”以及相似指称应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在该范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值如其在本文中单独陈述地加入本说明书。除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本公开，并不对本公开另外要求保护的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应当解释为暗示对于本公开的实践必不可少的任何未要求保护的要素。526.在本文中使用时，“和/或”被视作两个指定特征或组分中每一个的具体公开，其中包含或不包含另一个。例如，“x和/或y”被视作(i)x、(ii)y以及(iii)x和y中每一个的具体公开，就好像每个在本文中单独列出一样。527.在本公开的上下文中，术语“约”表示准确性的间隔，本领域普通技术人员会理解所述准确性的间隔仍确保考虑的特征的技术效果。该术语通常表示与所示数值偏差±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％和例如±0.01％。如普通技术人员会理解的，对于给定技术效果的数值的这种具体偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果一般可以具有比人造或工程技术效果更大的这种偏差。528.本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值如其在本文中单独陈述地加入本说明书。529.本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本发明，并不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应当解释为暗示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。530.在这个说明书的整个正文中引用几份文件。本文引用的每份文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容都不得解释为承认本发明无法享有在先申请的优先权。531.定义532.在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语均具有其公认的含义。533.如本文所用的术语如“减少”或“抑制”表示导致总体降低的能力，例如，在水平上，降低约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多或者约75％或更多。术语“抑制”或相似短语包括完全或基本上完全抑制，即减少至0或基本上至0。534.在一实施方案中，术语如“增加”或“增强”涉及增加或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％或至少约100％。535.如本文所用的“生理ph”是指约7.5的ph。536.如本公开中所用，“％w/v”是指重量体积百分比，它是一种浓度单位，以克(g)为单位测量溶质的量，表示为以毫升(ml)为单位的溶液总体积的百分比。537.术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类离子类别的数量和它们各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度is在数学上通过下式表示[0538][0539]其中c是特定离子类别的摩尔浓度，z是其电荷的绝对值。总和σ取自溶液中所有不同种类的离子(i)。[0540]根据本公开，在一实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。关于二价离子的存在，特别是二价阳离子，由于螯合剂的存在，它们的浓度或有效浓度(游离离子的存在)在一实施方案中足够低以防止rna的降解。在一实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于rna核苷酸之间磷酸二酯键水解的催化水平。在一实施方案中，游离二价离子的浓度为20μm或更少。在一实施方案中，没有或基本上没有游离的二价离子。[0541]“渗透压”是指特定溶质的浓度，表示为每千克溶剂的溶质渗透摩尔(osmole)数。[0542]术语“冷冻”涉及液体的凝固，通常伴随着热量的去除。[0543]术语“冻干(lyophilizing)”或“冻干(lyophilization)”是指物质的冷冻干燥，通过将其冷冻然后降低周围压力以允许物质中的冷冻介质直接从固相升华至液相。[0544]术语“喷雾干燥”是指通过混合(加热的)气体与容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体来喷雾干燥物质，其中来自形成的液滴的溶剂蒸发，导致干燥粉末。[0545]术语“复原”涉及将溶剂如水添加至干燥的产品以使其恢复为液体状态，例如其原始液体状态。[0546]在本公开的上下文中术语“重组”表示“通过遗传工程制备”。在一实施方案中，本公开的上下文中的“重组物体”不是天然存在的。[0547]如本文所用的术语“天然存在”是指物体可以在自然界中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中且可以分离自自然来源并且尚未被人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”表示“存在于自然界中”，并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离，但是将来可能从天然来源发现和/或分离的物体。[0548]如本文所用，术语“室温”和“环境温度”在本文中可互换使用，并且指至少约15℃，优选约15℃至约35℃，约15℃至约30℃，约15℃至约25℃或约17℃至约22℃的温度。这类温度包括15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃和22℃。[0549]术语“乙醇注射技术”是指一个过程，其中通过针头将包含脂质的乙醇溶液快速注射至水性溶液中。这个行为将脂质分散在整个溶液中，并且促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成如脂质体形成。一般来说，本文描述的核酸(尤其是rna)脂质复合物颗粒可通过将核酸(尤其是rna)添加至胶体脂质体分散体来获得。在一实施方案中，利用乙醇注射技术，如下形成这种胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质如阳离子脂质(如dotma)和额外脂质的乙醇溶液注射至水性溶液中。在一实施方案中，本文描述的核酸(尤其是rna)脂质复合物颗粒无需挤出步骤即可获得。[0550]术语edta是指乙二胺四乙酸二钠盐。关于edta二钠盐给出所有浓度。[0551]术语“烷基”是指饱和的直链或支化烃的单价基团。优选地，烷基包含1-12(如1-10)个碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选1-8个碳原子，如1-6或1-4个碳原子。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基(也称为2-丙基或1-甲基乙基)、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基-丙基、异戊基(iso-amyl)、正己基、异己基、仲己基、正庚基、异庚基、正辛基、2-乙基-己基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基等。[0552]根据本公开，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键互相连接的约2个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个以及多达约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白”是指大的肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”和“蛋白”在本文中通常用作同义词。[0553]根据本公开，优选一旦被摄取或引入，即转染或转导至细胞中就编码肽或蛋白的核酸如rna(优选mrna)导致所述肽或蛋白的表达，所述细胞可以存在于体外或受试者体内。所述细胞可以在细胞内(例如在细胞质中和/或在细胞核中)表达编码的肽或蛋白，可以分泌编码的肽或蛋白，或者可以在表面上表达它。[0554]根据本公开，术语如“核酸表达”和“核酸编码”或相似术语在本文中可互换使用，并且关于特定肽或多肽，其表示如果存在于适当环境中，优选在细胞内，核酸可以表达以产生所述肽或多肽。[0555]根据本公开，肽或蛋白的部分或片段优选具有衍生它的肽或蛋白的至少一种功能特性。这种功能特性包括药理活性、与其他肽或蛋白的相互作用、酶促活性、与抗体的相互作用以及核酸的选择性结合。例如，肽或蛋白的药理活性片段具有衍生该片段的肽或蛋白的至少一种药理活性。肽或蛋白的部分或片段优选包含所述肽或蛋白的至少6个、特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肽或蛋白的部分或片段优选包含所述肽或蛋白的多达8个、特别是多达10个、多达12个、多达15个、多达20个、多达30个或多达55个连续氨基酸的序列。[0556]根据本公开，肽或蛋白的类似物是衍生它的所述肽或蛋白的修饰形式，并且具有所述肽或蛋白的至少一种功能特性。例如，肽或蛋白的药理活性类似物具有衍生该类似物的肽或蛋白的至少一种药理活性。这类修饰包括任何化学修饰，并且包括与蛋白或肽相关的任何分子(如碳水化合物、脂质和/或蛋白或肽)的单个或多个取代、缺失和/或添加。在一实施方案中，蛋白或肽的“类似物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白酶切割或者结合至抗体或另一细胞配体所致的那些修饰形式。术语“类似物”还延伸至所述蛋白和肽的所有功能性化学等价物。[0557]根据本公开的“抗原”涵盖会引发免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制如细胞应答所针对的任何物质。这还包括其中将抗原加工为抗原肽并且免疫应答或免疫机制针对一种或多种抗原肽的情况，特别是如果在mhc分子的背景中呈递。特别地，“抗原”涉及与抗体或t淋巴细胞(t细胞)特异性反应的任何物质，优选肽或蛋白。根据本发明，术语“抗原”包括包含至少一个表位如t细胞表位的任何分子。优选地，本公开的上下文中的抗原是一种分子，其任选地在加工之后，诱导免疫反应，优选是抗原(包括表达抗原的细胞)特异性的。在一实施方案中，抗原是疾病相关抗原，如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，或者源自这种抗原的表位。[0558]根据本公开，可以使用任何合适的抗原，其是免疫应答的候选物，其中所述免疫应答可以是体液以及细胞免疫应答。在本公开的一些实施方案的上下文中，抗原优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞呈递，在mhc分子的背景中，这导致针对抗原的免疫应答。抗原优选是对应于或源自天然存在的抗原的产物。这类天然存在的抗原可以包括或可以源自过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他传染物和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可以对应于天然存在的产物，例如，病毒蛋白或其部分。[0559]在一优选实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即肿瘤细胞的一部分，特别是主要出现在细胞内或作为肿瘤细胞表面抗原的那些。在另一实施方案中，抗原是病原体相关抗原，即源自病原体的抗原，例如源自病毒、细菌、单细胞生物或寄生虫，例如病毒抗原如病毒核糖核蛋白或外壳蛋白。特别地，抗原应当由mhc分子呈递，这导致调节，特别是免疫系统细胞(优选cd4+和cd8+淋巴细胞)的激活，特别是通过t细胞受体的活性的调节。[0560]术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义用于指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是一种含有表位的分子，所述表位会刺激宿主的免疫系统以产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。疾病相关抗原包括病原体相关抗原，即，与微生物感染相关的抗原，通常是微生物抗原(如细菌或病毒抗原)，或者与癌症相关的抗原，通常是肿瘤，如肿瘤抗原。[0561]术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可以源自细胞质、细胞表面或细胞核。特别地，它是指那些在细胞内产生或作为肿瘤细胞上的表面抗原的抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎儿硫糖蛋白、α2-h-铁蛋白和γ-胎蛋白，以及各种病毒肿瘤抗原。根据本公开，肿瘤抗原优选包括在类型和/或表达水平方面是肿瘤或癌症以及肿瘤细胞或癌细胞的特征的任何抗原。[0562]术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。[0563]术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌组分。细菌抗原可以源自细菌的细胞壁或细胞质膜。[0564]术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即，免疫系统识别的分子的一部分或片段，例如，抗体t细胞或b细胞识别的分子的那个，特别是当在mhc分子的背景中呈递时。蛋白的表位优选包含所述蛋白的连续或不连续部分，并且优选长度为约5至约100，优选约5至约50，更优选约8至约0，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位可以优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。特别优选本发明的上下文中的表位是t细胞表位。[0565]术语如“表位”、“抗原片段”、“免疫原性肽”和“抗原肽”在本文中可互换使用，并且优选涉及抗原的不完整代表(representation)，其优选能够引发针对抗原或者表达或包含或优选呈递抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，它是t细胞受体识别(即，特异性结合)的抗原的一部分，特别是如果在mhc分子的背景中呈递。某些优选的免疫原性部分结合至mhci类或ii类分子。[0566]术语“t细胞表位”是指当在mhc分子的背景中呈递时被t细胞识别的蛋白的一部分或片段。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“mhc”包括mhci类和mhcii类分子，并且涉及所有脊椎动物中均存在的基因复合物。mhc蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导很重要，其中mhc蛋白或分子结合肽表位并呈递它们用于t细胞上的t细胞受体识别。mhc编码的蛋白在细胞表面上表达，并且向t细胞展示自身抗原(来自细胞自身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)。在i类mhc/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8-约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可能是有效的。在ii类mhc/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10-约25个氨基酸，特别是长约13-约18个氨基酸，而更长或更短的肽可能是有效的。[0567]术语“靶标”应当表示这样的物质，如细胞或组织，其是免疫应答如细胞免疫应答的靶标。靶标包括呈递抗原或抗原表位(即源自抗原的肽片段)的细胞。在一实施方案中，靶细胞是表达抗原并优选用i类mhc呈递所述抗原的细胞。[0568]术语“部分(portion)”是指部分(fraction)。关于特定结构如氨基酸序列或蛋白，术语其“部分(portion)”可以指所述结构的连续或不连续部分。[0569]术语“部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用，是指连续的元件。例如，结构如氨基酸序列或蛋白的一部分是指所述结构的连续元件。当在组合物的上下文中使用时，术语“部分(part)”表示组合物的一部分。例如，组合物的一部分可以为所述组合物的0.1％-99.9％(如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何部分。[0570]“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白降解为肽)，并且这些片段中的一个或多个与mhc分子关联(例如，通过结合)用于通过细胞(优选特定t-细胞的抗原呈递细胞)呈递。[0571]“抗原反应性ctl”表示对抗原或源自所述抗原的肽有反应的cd8+t-细胞，其与i类mhc一起在抗原呈递细胞表面上呈递。[0572]根据本发明，ctl反应性可以包括持续的钙通量、细胞分裂、产生细胞因子如ifn-γ和tnf-α、上调激活标记如cd44和cd69以及特异性溶细胞杀死表达肿瘤抗原的靶细胞。还可以使用准确指示ctl反应性的人工报告物确定ctl反应性。[0573]术语“免疫应答”和“免疫反应”在本文中以其常规含义可互换使用，是指对抗原的综合身体反应，并且优选指细胞免疫应答、体液免疫应答或两者。根据本发明，关于物质(如抗原、细胞或组织)的术语“对…免疫应答”或“针对…免疫应答”涉及针对所述物质的免疫应答(如细胞应答)。免疫应答可以包括一种或多种选自以下的反应：产生针对一种或多种抗原的抗体，以及抗原特异性t淋巴细胞(优选cd4+和cd8+t淋巴细胞，更优选cd8+t淋巴细胞)的扩增，其可以在体外的各种增殖或细胞因子产生测试中检测到。[0574]在本发明的上下文中，术语“诱导免疫应答”和“引发免疫应答”以及相似术语是指免疫应答的诱导，优选细胞免疫应答、体液免疫应答或两者的诱导。免疫应答可以是保护性/防护性/预防性和/或治疗性的。免疫应答可以针对任何免疫原或抗原或抗原肽，优选针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如，病毒(如流感病毒(a、b或c)、cmv或rsv)的抗原)。在这个上下文中“诱导”可以表示在诱导之前没有针对特定抗原或病原体的免疫应答，但是其也可以表示在诱导之前有一定水平的针对特定抗原或病原体的免疫应答，并且在诱导之后所述免疫应答增强。因此，在这个上下文中“诱导免疫应答”还包括“增强免疫应答”。优选地，在个体中诱导免疫应答之后，所述个体受到保护免于发展疾病如传染病或癌性疾病，或者疾病状况通过诱导免疫应答达到改善。[0575]术语“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“细胞介导的免疫”或相似术语表示包括针对细胞的细胞应答，所述细胞的特征是表达抗原和/或用i类或ii类mhc呈递抗原。细胞应答涉及称作t细胞或t淋巴细胞的细胞，其充当“助手”或“杀手”。辅助性t细胞(也称作cd4+t细胞)通过调节免疫应答发挥核心作用，而杀伤细胞(也称作细胞毒性t细胞、溶细胞性t细胞、cd8+t细胞或ctl)杀死细胞如病变细胞。[0576]术语“体液免疫应答”是指活生物体产生抗体以响应物质和生物体的过程，它们最终中和和/或消除所述物质和生物体。抗体应答的特异性由t和/或b细胞通过结合单一特异性抗原的膜相关受体来介导。在结合适当抗原并接收各种其他激活信号之后，b淋巴细胞分裂，产生记忆b细胞以及分泌抗体的浆细胞克隆，每个克隆产生的抗体识别与其抗原受体识别的相同的抗原表位。记忆b淋巴细胞保持休眠状态，直至它们随后被其特定抗原激活。这些淋巴细胞提供记忆的细胞基础，并且在再次暴露于特定抗原时导致抗体应答升级。[0577]如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其能够与抗原上的表位特异性结合。特别地，术语“抗体”是指至少包含通过二硫键互相连接的两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和任何前述的组合。每条重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)。每条轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)。可变区和恒定区在本文中还分别称作可变结构域和恒定结构域。vh和vl区可以进一步细分为高变性的区域，称作互补性决定区(cdr)，散布于更保守的、称作框架区(fr)的区域。每个vh和vl由3个cdr和4个fr组成，从氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。vh的cdr称作hcdr1、hcdr2和hcdr3，vl的cdr称作lcdr1、lcdr2和lcdr3。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区包含重链恒定区(ch)和轻链恒定区(cl)，其中ch可以进一步细分为恒定结构域ch1、铰链区以及恒定结构域ch2和ch3(从氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列：ch1、ch2、ch3)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2以及单链抗体和人源化抗体。[0578]术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白，优选涉及抗原受体如抗体或b细胞受体(bcr)。免疫球蛋白的特征在于结构域，即，具有特征性免疫球蛋白(ig)折叠的免疫球蛋白结构域。该术语涵盖膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也称作表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其一般是bcr的部分。可溶性免疫球蛋白一般称作抗体。免疫球蛋白一般包含几条链，通常是通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域组成，如vl(可变轻链)结构域，cl(恒定轻链)结构域，vh(可变重链)结构域以及ch(恒定重链)结构域ch1、ch2、ch3和ch4。有5种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即，α、δ、ε、γ和μ，其导致不同类别的抗体，即iga、igd、ige、igg和igm。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在它们的羧基末端包含跨膜结构域和短的胞质结构域。在哺乳动物中有两种类型的轻链，即，λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型内基本上是保守的，其中可变部分高度不同并导致抗原识别。[0579]术语“疫苗接种”和“免疫接种”描述为了治疗或预防原因治疗个体的过程，并且涉及以下程序：向个体给药一种或多种免疫原或抗原或其衍生物，特别是以编码其的rna的形式，如本文所述，并且刺激针对所述一种或多种免疫原或抗原或者细胞的免疫应答，所述细胞以呈递所述一种或多种免疫原或抗原为特征。[0580]“以呈递抗原为特征的细胞”或“呈递抗原的细胞”或“在抗原呈递细胞表面上呈递抗原的mhc分子”或相似表述表示细胞如病变细胞，特别是肿瘤细胞，或者抗原呈递细胞，在mhc分子(优选mhci类和/或mhcii类分子，最优选mhci类分子)的背景下直接或在加工之后呈递抗原或抗原肽。[0581]在本公开的上下文中，术语“转录”涉及这样的过程，其中将dna序列中的遗传密码转录为rna。随后，可以将rna翻译为肽或蛋白。[0582]关于rna，术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过这个过程mrna链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白。[0583]如本文所用的术语“任选”或“任选地”表示随后描述的事件、情况或条件可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件、情况或条件发生的情况和不发生的情况。[0584]颗粒绕旋转轴的“回转半径”(在本文中缩写为rg)是一点到旋转轴的径向距离，如果假设颗粒的整个质量集中在该点，则其绕给定轴的转动惯量会与其实际质量分布相同。在数学上，rg是颗粒的组分与其质量中心或给定轴的均方根距离。例如，对于由n个质量元素组成的大分子，质量为mi(i＝1,2,3,…,n)，位于距质量中心固定距离si处，rg是所有质量元素的si2的质量平均值的平方根，并且可以计算如下：[0585][0586]回转半径可以通过实验来确定或计算，例如，通过使用光散射。特别地，对于小散射向量结构函数s定义如下：[0587][0588]其中n是组分的数目(guinier定律)。[0589]“d10值”，特别是关于颗粒的定量大小分布(quantitativesizedistribution)，是10％的颗粒的直径小于这个值的直径。d10值是一种描述最小颗粒在颗粒群内(如在获得自场-流分级的颗粒峰内)的比例的方法。[0590]“d50值”，特别是关于颗粒的定量大小分布，是50％的颗粒的直径小于这个值的直径。d50值是一种描述颗粒群(如在获得自场-流分级的颗粒峰内)的平均颗粒大小(particlesize)的方法。[0591]“d90值”，特别是关于颗粒的定量大小分布，是90％的颗粒的直径小于这个值的直径。“d95”、“d99”和“d100”值具有相应的含义。d90、d95、d99和d100值是描述最大颗粒在颗粒群内(如在获得自场-流分级的颗粒峰内)的比例的方法。[0592]颗粒的“流体动力学半径”(有时称作“stokes半径”或“stokes-einstein”半径)是以与所述颗粒相同的速度扩散的假设硬球的半径。流体动力学半径与颗粒的移动性相关，不仅考虑大小，而且还考虑溶剂影响。例如，具有较强水合作用的较小带电颗粒可能比具有较弱水合作用的较大带电颗粒具有更大的流体动力学半径。这是因为较小的颗粒在穿过溶液时拖曳更多的水分子。因为颗粒在溶剂中的实际尺寸不可直接测量，流体动力学半径可以由stokes-einstein方程定义：[0593][0594]其中kb是boltzmann常数；t是温度；η是溶剂的粘度；并且d是扩散系数。扩散系数可以通过实验确定，例如，通过使用动态光散射(dls)。因此，一种确定颗粒或颗粒群的流体动力学半径(如本文公开的样品或对照组合物中含有的颗粒的流体动力学半径或者对这样的样品或对照组合物进行场-流分级获得的颗粒峰的流体动力学半径)的方法是测量所述颗粒或颗粒群的dls信号(如本文公开的样品或对照组合物中含有的颗粒的dls信号或者对这样的样品或对照组合物进行场-流分级获得的颗粒峰的dls信号)。[0595]如本文所用的术语“形状(shape)因子”表示rg值(如重新计算的rg值)与流体动力学半径(rh)值的比例。它可以通过将rg值(如重新计算的rg值)对流体动力学半径(rh)值作图并将数据点拟合为函数(例如线性函数)来确定或计算。[0596]如本文所用的术语“形式(form)因子”表示流体动力学半径(rh)值与rg值(如重新计算的rg值)的比例。它可以通过将流体动力学半径(rh)值对rg值(如重新计算的rg值)作图并将数据点拟合为函数(例如线性函数)来确定或计算。[0597]如本文所用的表述“核酸包裹效率”表示样品或对照组合物中含有的包裹的核酸的量与样品或对照组合物中含有的核酸总量的比例，所述样品或对照组合物包含核酸和颗粒。例如，在核酸是rna的情况下，如本文所用的表述“rna包裹效率”表示包含rna和颗粒的样品或对照组合物中含有的包裹的rna的量与样品或对照组合物中含有的rna总量的比例。[0598]如本文所用的术语“膜”是指尺寸选择屏障，其允许一定尺寸(称作“截留”(如截留分子量(mw)))以下的分子通过但阻止所述一定尺寸(即，截留，如截留mw)以上的分子。优选地，膜是合成的。适用于本公开的方法和/或用途的膜的实例包括超滤膜、聚醚砜(pes)膜、再生纤维素膜、聚偏氟乙烯(pvdf)膜和其他超滤膜。[0599]如本文所用的术语“聚集体”涉及颗粒簇，其中颗粒相同或非常相似并以非共价方式互相粘附(例如，通过离子相互作用、h桥相互作用、偶极相互作用和/或范德华相互作用)。[0600]如本文所用的表述“光散射”是指物理过程，其中由于光通过的介质中的局部不均匀性而迫使光与直线轨迹偏离一条或多条路径。[0601]术语“uv”表示紫外光，并且指定波长从10nm至400nm的电磁波谱带，即，比可见光短但比x-射线长。[0602]如本文所用的术语“圆二色光谱”或“cd光谱”是指使用圆偏振光的光谱。优选地，cd光谱涉及左手和右手光的差异吸收。[0603]术语“uvcd光”或“uvcd信号”表示具有从10nm至400nm波长的圆偏振光，即，比可见光短但比x-射线长。[0604]如本文所用的表述“多角度光散射”或“mals”涉及用于测量由样品散射成多角度的光的技术。“多角度”在这方面表示在测量时可以在不同的离散角度检测散射光，例如，通过在包括所选特定角度的范围内移动的单个检测器或固定在特定角度位置的检测器阵列。在一优选实施方案中，mals中使用的光源是激光源(malls：多角度激光散射)。基于包含颗粒的组合物的mals信号并通过使用适当形式(例如，zimm图、berry图或debye图)，可以确定回转半径(rg)，并因此确定所述颗粒的大小。优选地，zimm图是使用以下等式的图形表示：[0605][0606]其中c是溶剂中颗粒的质量浓度(g/ml)；a2是第二维里系数(mol·ml/g2)；p(θ)是与散射光强度对角度的依赖性相关的形式因子；rθ是过量rayleigh比例(cm-1)；k*是一个光学常数，等于4π2ηo(dn/dc)2λ0-4na-1，其中ηo是溶剂在入射辐射(真空)波长处的折射率，λ0是入射辐射(真空)波长(nm)，na是阿伏伽德罗数(avogadro’snumber)(mol-1)，dn/dc是微分折射率增量(ml/g)(参见，例如，buchholzetal.(electrophoresis22(2001),4118-4128)；b.h.zimm(j.chem.phys.13(1945),141；p.debye(j.appl.phys.15(1944):338；andw.burchard(anal.chem.75(2003),4279-4291)。优选地，berry图按以下项计算：[0607][0608]其中c、rθ和k*如上文定义。优选地，debye图按以下项计算：[0609][0610]其中c、rθ和k*如上文定义。虽然核酸(尤其是rna)本身不是以上提供的定义意义上的颗粒，但是核酸(尤其是rna)的大小也可以使用上述任何形式(例如，zimm图、berry图或debye图)来确定，假设核酸(尤其是rna)呈无规卷曲的形式。因此，在本公开的方法和/或用途的一实施方案中，基于核酸(如rna)的rg值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在本公开的方法和/或用途的另一实施方案中，基于核酸(如rna)的rh值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布。在本公开的方法和/或用途的另一实施方案中，基于核酸(如rna)的rg值并分别地基于核酸(如rna)的rh值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这个实施方案产生核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。[0611]如本文所用的表述“动态光散射”或“dls”是指确定颗粒的大小和大小分布谱(特别是关于颗粒的流体动力学半径)的技术。单色光源，通常是激光，通过偏振器射入样品。散射光然后穿过第二个偏振器，在那里它被检测到，并且将生成的图像投影到屏幕上。溶液中的颗粒被光击中并在所有方向上衍射光。来自颗粒的衍射光可以相长干扰(亮区)或相消干扰(暗区)。这个过程在短的时间间隔内重复，并且通过比较随时间的在每个点的光强度的自相关器分析产生的散斑图案集。[0612]如本文所用的表述“静态光散射”或“sls”是指确定颗粒的大小和大小分布谱(特别是关于颗粒的回转半径和/或颗粒的摩尔质量)的技术。在含有颗粒的溶液中发射高强度单色光，通常是激光。一个或多个检测器用来在一个或多个角度测量散射强度。需要角度依赖性来获得所有大分子的摩尔质量和半径大小的准确测量。因此，在相对于入射光方向的几个角度同时测量，称作多角度光散射(mals)或多角度激光散射(malls)，一般被认为是静态光散射的标准实施。[0613]表述“洗脱时间”和“保留时间”在本文中可互换使用，并且涉及特定分析物在设定条件下通过系统(例如，从场-流分级装置的注入点到检测器)所花的时间。[0614]表述“连续变化”表示从一个值到不同值的变化是稳定进行的，即，没有任何跳跃。连续变化的实例是线性变化或指数变化(如线性梯度或指数梯度)。[0615]表述“逐步变化”表示从一个值到不同值的变化是不连续的，而是从第一个特定值跳跃到第二个特定值，从而遗漏第一个和第二个值之间的值中的至少一个。逐步变化的实例是从第一个值(例如，10ml/min)开始并以第二个值(例如，0ml/min)结束的流速谱，其中在这个谱期间，流速可以仅为整数(例如，10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0ml/min)，从而遗漏这些整数之间的值。[0616]如本文所用的表述“提供包含核酸(如rna)和任选存在的颗粒的组合物”表示通过任何方式提供这样的组合物，例如，可以将其制备、加工(如纯化和/或干燥)和/或储存。[0617]核酸[0618]根据本公开，术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、它们的组合和它们的修饰形式。该术语包括基因组dna、cdna、mrna、重组产生和化学合成的分子。根据本公开，核酸可以作为单链或双链以及线性或共价环状闭合分子存在。根据本公开，核酸可以是分离的。根据本公开，术语“分离的核酸”表示所述核酸：(i)是体外扩增的，例如通过用于dna的聚合酶链反应(pcr)或用于rna的体外转录(使用例如rna聚合酶)，(ii)是通过克隆重组产生的，(iii)是纯化的，例如通过切割和通过凝胶电泳分离，或者(iv)是合成的，例如，通过化学合成。[0619]术语“核苷”(在本文中缩写为“n”)涉及可以认为是没有磷酸基团的核苷酸的化合物。核苷是与糖(例如，核糖或脱氧核糖)连接的核碱基，而核苷酸由核苷以及一个或多个磷酸基团组成。核苷的实例包括胞苷、尿苷、假尿苷、腺苷和鸟苷。[0620]通常构成天然存在的核酸的五种标准核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鸟苷。五种核苷通常分别缩写为它们的单字母代码u、a、t、c和g。但是，胸苷更常写作“dt”(“d”代表“脱氧”)，因为它含有2'-脱氧呋喃核糖部分而不是尿苷中发现的呋喃核糖环。这是因为胸苷存在于脱氧核糖核酸(dna)而不是核糖核酸(rna)中。相反地，尿苷存在于rna而不是dna中。其余三种核苷可以在rna和dna中找到。在rna中，它们会表示为a、c和g，而在dna中，它们会表示为da、dc和dg。[0621]修饰的嘌呤(a或g)或嘧啶(c、t或u)碱基部分优选被一个或多个烷基修饰，更优选一个或多个c1-4烷基，甚至更优选一个或多个甲基。修饰的嘌呤或嘧啶碱基部分的具体实例包括n7-烷基-鸟嘌呤、n6-烷基-腺嘌呤、5-烷基-胞嘧啶、5-烷基-尿嘧啶和n(1)-烷基-尿嘧啶，如n7-c1-4烷基-鸟嘌呤、n6-c1-4烷基-腺嘌呤、5-c1-4烷基-胞嘧啶、5-c1-4烷基-尿嘧啶和n(1)-c1-4烷基-尿嘧啶，优选n7-甲基-鸟嘌呤、n6-甲基-腺嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶和n(1)-甲基-尿嘧啶。[0622]在本公开中，术语“dna”涉及包括脱氧核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，dna含有全部或大部分脱氧核糖核苷酸残基。如本文所用，“脱氧核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基(ribofuranosyl)的2'-位置缺少羟基的核苷酸。dna涵盖但不限于双链dna、单链dna、分离的dna如部分纯化的dna、基本上纯的dna、合成的dna、重组产生的dna，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的dna的修饰的dna。这类改变可以指将非核苷酸物质添加至内部dna核苷酸或dna的末端。本文中还考虑dna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或核糖核苷酸。对于本公开，认为这些改变的dna是天然存在的dna的类似物。如果基于分子中核苷酸残基的总数，分子中脱氧核糖核苷酸残基的含量超过50％(如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子含有“大部分脱氧核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(不管核苷酸残基是否是标准的(即，天然存在的)核苷酸残基或其类似物)。[0623]在一实施方案中，dna是重组dna，并且可以通过核酸特别是cdna的克隆来获得。cdna可以通过rna的逆转录获得。[0624]在本公开中，术语“rna”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，rna含有全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基基团的2'-位置具有羟基的核苷酸。rna涵盖但不限于双链rna、单链rna、分离的rna如部分纯化的rna、基本上纯的rna、合成的rna、重组产生的rna，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的rna的修饰的rna。这类改变可以指将非核苷酸物质添加至内部rna核苷酸或rna的末端。本文中还考虑rna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，这些改变/修饰的核苷酸可以称作天然存在的核苷酸的类似物，并且含有这类改变/修饰的核苷酸的相应rna(即，改变/修饰的rna)可以称作天然存在的rna的类似物。如果基于分子中核苷酸残基的总数，分子中核糖核苷酸残基的含量超过50％(如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子含有“大部分核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(不管核苷酸残基是否是标准的(即，天然存在的)核苷酸残基或其类似物)。[0625]根据本公开，“rna”包括mrna、trna、核糖体rna(rrna)、小核rna(snrna)、自扩增rna(sarna)、单链rna(ssrna)、dsrna、抑制性rna(如反义ssrna、小干扰rna(sirna)或microrna(mirna))、激活rna(如小激活rna)和免疫刺激rna(isrna)。[0626]如本文所用的术语“体外转录”或“ivt”表示以无细胞方式进行转录(即，rna的产生)。即，ivt不使用活细胞/培养的细胞，而是使用从细胞提取的转录机制(例如，细胞裂解物或其分离的组分，包括rna聚合酶(优选t7、t3或sp6聚合酶))。[0627]根据本公开，术语“mrna”表示“信使rna”，并且涉及可以通过使用dna模板产生并可以编码肽或蛋白的“转录物”。通常，mrna包含5'-utr、肽/蛋白编码区和3'-utr。在本公开的上下文中，mrna优选通过体外转录(ivt)从dna模板产生。如上所示，体外转录方法是技术人员已知的，并且各种体外转录试剂盒是可商购的。[0628]mrna是单链的，但是可以含有自我互补序列，其允许部分mrna折叠并与自身配对以形成双螺旋。[0629]根据本公开，“dsrna”表示双链rna，并且是具有两条部分或完全互补链的rna。[0630]rna的长度可以从10个核苷酸至15,000个变化，如40-15,000、100-12,000或200-10,000个核苷酸。在一实施方案中，rna是抑制性rna，并且具有10-100个核苷酸的长度(如至多90个核苷酸、至多80个核苷酸、至多70个核苷酸、至多60个核苷酸、至多50个核苷酸、至多45个核苷酸、至多40个核苷酸、至多35个核苷酸、至多30个核苷酸、至多25个核苷酸或至多20个核苷酸)。在一实施方案中，rna编码肽或蛋白，并且具有至少45个核苷酸的长度(如至少60、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少6,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000个核苷酸)，优选多达15,000，如多达14,000、多达13,000、多达12,000个核苷酸、多达11,000个核苷酸或多达10,000个核苷酸。[0631]在本公开的某些实施方案中，所述rna是与编码肽或蛋白的rna转录物有关的mrna。如本领域中建立的，mrna一般含有5'非翻译区(5'-utr)、肽编码区和3'非翻译区(3'-utr)。在一些实施方案中，所述rna是通过体外转录或化学合成产生的。在一实施方案中，使用dna模板通过体外转录产生mrna。体外转录方法是技术人员已知的；参见，例如，molecularcloning:alaboratorymanual,2ndedition,j.sambrooketal.eds.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor1989。此外，各种体外转录试剂盒是可商购的，例如，来自thermofisherscientific(如transcriptaidtmt7试剂盒、t7试剂盒、)、newenglandbiolabsinc.(如hiscribetmt7试剂盒、hiscribetmt7arcamrna试剂盒)、promega(如ribomaxtm、、系统)、jenabioscience(如sp6或t7转录试剂盒)和epicentre(如ampliscribetm)。为了提供修饰的rna，相应修饰的核苷酸，如修饰的天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和/或修饰的非天然存在的核苷酸，可以在合成(优选体外转录)期间掺入，或者修饰在转录之后实现和/或添加至rna。[0632]在一实施方案中，rna是体外转录的rna(ivt-rna)，并且可以通过适当dna模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何rna聚合酶的任何启动子。用于体外转录的dna模板可以通过克隆核酸，特别是cdna，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cdna可以通过rna的逆转录获得。[0633]在本公开的上下文中，所述rna，优选mrna，含有一种或多种修饰，例如，以便增加其稳定性和/或增加翻译效率和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，为了增加rna(尤其是mrna)的表达，可以在编码区，即编码表达的肽或蛋白的序列内对其进行修饰，优选不改变表达的肽或蛋白的序列。这类修饰例如在wo2007/036366和pct/ep2019/056502中有所描述，并且包括以下：5'-帽结构；天然存在的poly(a)尾的延长或截短；5'-和/或3'-非翻译区(utr)的改变，如引入与所述rna的编码区无关的utr；用合成核苷酸替换一个或多个天然存在的核苷酸；以及密码子优化(例如，改变，优选增加rna的gc含量)。根据本公开，在修饰的rna(优选mrna)的上下文中的术语“修饰”优选涉及在所述rna中不天然存在的rna(优选mrna)的任何修饰。[0634]在一些实施方案中，根据本公开的rna(优选mrna)包含5'-帽结构。在一实施方案中，所述rna(优选mrna)没有无帽的5'-三磷酸。在一实施方案，所述rna(优选mrna)可以包含常规5'-帽和/或5'-帽类似物。术语“常规5'-帽”是指在mrna分子的5'-末端发现的帽结构，一般由鸟苷5'-三磷酸(gppp)组成，所述鸟苷5'-三磷酸(gppp)通过其三磷酸部分连接至mrna的下一个核苷酸的5'-末端(即，鸟苷通过5'至5'三磷酸键连接至mrna的其余部分)。鸟苷可以在位置n7甲基化(导致帽结构m7gppp)。术语“5'-帽类似物”是指5'-帽，其基于常规5'-帽，但是已在m7鸟苷结构的2'-或3'-位置进行修饰以避免5'-帽结构类似物在反方向上整合(这类5'-帽类似物也称作抗反向帽类似物(arca))。特别优选的5'-帽类似物是在磷酸盐桥的桥接和非桥接氧处具有一个或多个取代的那些，如在β-磷酸盐处硫代磷酸酯修饰的5'-帽类似物(如m27,2'og(5')ppsp(5')g(称作beta-s-arca或β-s-arca))，如pct/ep2019/056502所述，其全部公开内容援引加入本文。提供如本文所述的具有5’‑帽结构的rna(优选mrna)可以通过在相应的5’‑帽化合物存在下体外转录dna模板来实现，其中所述5’‑帽结构共转录地掺入产生的rna链中，或者可以例如通过体外转录产生rna(优选mrna)，并且可以使用加帽酶，例如痘苗病毒的加帽酶，将5’‑帽结构转录后连接至rna。[0635]在一些实施方案中，根据本公开的rna(优选mrna)包含选自m27,2'og(5’)ppsp(5')g(特别是其d1非对映体)、m27,3'og(5')ppp(5')g和m27,3'-ogppp(m12'-o)apg的5'-帽结构。[0636]在一[0637]在一些实施方案中，所述rna(优选mrna)包含cap0、cap1或cap2，优选cap1或cap2。根据本公开，术语“cap0”表示结构“m7gpppn”，其中n是在位置2'带有oh部分的任何核苷。根据本公开，术语“cap1”表示结构“m7gpppnm”，其中nm是在位置2'带有och3部分的任何核苷。根据本公开，术语“cap2”表示结构“m7gpppnmnm”，其中每个nm独立地是在位置2'带有och3部分的任何核苷。[0638]beta-s-arca(β-s-arca)的d1非对映体具有以下结构：[0639][0640]“β-s-arca的d1非对映体”或“β-s-arca(d1)”是β-s-arca的非对映体，与β-s-arca的d2非对映体(β-s-arca(d2))相比其在hplc柱上首先洗脱，因此表现出较短的保留时间。所述hplc优选是分析hplc。在一实施方案中，supelcosillc-18-trp柱，优选规格：5μm、4.6x250mm用于分离，由此可以应用1.3ml/min的流速。在一实施方案中，使用乙酸铵中的甲醇梯度，例如，在15min内，0.05m乙酸铵，ph＝5.9中的甲醇的0-25％线性梯度。uv-检测(vwd)可以在260nm处进行，荧光检测(fld)可以在280nm激发和337nm检测下进行。[0641]cap1的组成部分5'-帽类似物m27,3'-ogppp(m12'-o)apg(也称作m27,3'og(5')ppp(5')m2'-oapg)具有以下结构：[0642][0643]包含β-s-arca和rna的示例性cap0rna具有以下结构：[0644][0645]包含m27,3'og(5')ppp(5')g和rna的示例性cap0rna具有以下结构：[0646][0647]包含m27,3'-ogppp(m12'-o)apg和rna的示例性cap1rna具有以下结构：[0648][0649]如本文所用，术语“poly(a)尾”或“poly-a序列”是指腺苷酸残基的不间断或间断序列，其通常位于rna分子的3'-末端。poly-a尾或poly-a序列是本领域技术人员已知的，并且可以在本文描述的rna中的3’‑utr之后。不间断的poly-a尾的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly-a尾是典型的。本文公开的rna可以具有在转录之后通过不依赖于模板的rna聚合酶连接至rna的游离3'-末端的poly-a尾，或者由dna编码并由模板依赖性rna聚合酶转录的poly-a尾。[0650]已证实约120个a核苷酸的poly-a尾对转染的真核细胞中的rna水平以及从存在于poly-a尾上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白水平具有有益影响(holtkampetal.,2006,blood,vol.108,pp.4009-4017)。[0651]poly-a尾可以具有任何长度。在一些实施方案中，poly-a尾包含、基本上由或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个a核苷酸，特别是约120个a核苷酸。在这种情况下，“基本上由…组成”表示poly-a尾中的大多数核苷酸，通常poly-a尾中核苷酸数量的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是a核苷酸，但是允许其余的核苷酸是除a核苷酸以外的核苷酸，如u核苷酸(尿苷酸)、g核苷酸(鸟苷酸)或c核苷酸(胞苷酸)。在这种情况下，“由…组成”表示poly-a尾中的所有核苷酸，即，poly-a尾中核苷酸数量的100％是a核苷酸。术语“a核苷酸”或“a”是指腺苷酸。[0652]在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dt核苷酸(脱氧胸苷酸)的dna模板，在rna转录期间，例如，在制备体外转录的rna期间，连接poly-a尾。编码poly-a尾的dna序列(编码链)称作poly(a)盒。[0653]在一些实施方案中，dna编码链中存在的poly(a)盒基本上由da核苷酸组成，但是被4种核苷酸(da、dc、dg和dt)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。在wo2016/005324a1中公开了这样的盒，其援引加入本文。wo2016/005324a1中公开的任何poly(a)盒均可以用于本发明。涵盖这样的poly(a)盒，其基本上由da核苷酸组成，但是被具有均等分布的4种核苷酸(da、dc、dg、dt)且具有例如5-50个核苷酸长度的随机序列中断，在dna水平上在大肠杆菌(e.coli)中表现出质粒dna的恒定增殖，并且在rna水平上仍与支持rna稳定性和翻译效率方面的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文描述的rna分子中含有的poly-a尾基本上由a核苷酸组成，但是被4种核苷酸(a、c、g、u)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。[0654]在一些实施方案中，在poly-a尾的3'-末端侧翼没有除a核苷酸以外的核苷酸，即，poly-a尾在其3'-末端未被a以外的核苷酸掩盖或跟随。[0655]在一些实施方案中，根据本公开的rna包含5'-utr和/或3'-utr。术语“非翻译区”或“utr”涉及dna分子中的区域，其转录但不翻译为氨基酸序列，或者涉及rna分子如mrna分子中的相应区域。非翻译区(utr)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-utr)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-utr)。如果存在，5'-utr位于5'-末端，蛋白编码区的起始密码子的上游。5'-utr位于5'-帽(如果存在)的下游，例如，直接与5'-帽相邻。如果存在，3'-utr位于3'-末端，蛋白编码区的终止密码子的下游，但是术语“3'-utr”优选不包括poly-a序列。因此，3'-utr位于poly-a序列(如果存在)的上游，例如，直接与poly(a)序列相邻。将3'-utr并入rna(优选mrna)分子的3'-非翻译区可以导致翻译效率的提高。可以通过并入两个或更多个这样的3'-utr(它们优选以头对尾方向排列；参见，例如，holtkampetal.,blood108,4009-4017(2006))来实现协同效应。3'-utr对于它们被引入的rna(优选mrna)可以是自体的或异源的。在一具体实施方案中，所述3'-utr源自珠蛋白基因或mrna，如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白或β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的基因或mrna。例如，可以通过用一个或多个，优选两个拷贝的3'-utr替换现有3'-utr或者插入一个或多个，优选两个拷贝的3'-utr来修饰rna(优选mrna)，所述3'-utr源自珠蛋白基因，如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白或β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白。[0656]所述rna(优选mrna)可以具有修饰的核糖核苷酸以增加其稳定性和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，在一实施方案中，本文描述的rna中的尿苷被修饰的核苷替换(部分或完全，优选完全)。在一些实施方案中，修饰的核苷是修饰的尿苷。[0657]在一些实施方案中，替换尿苷的修饰的尿苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-尿苷(m5u)和它们的组合。[0658]在一些实施方案中，替换(部分或完全，优选完全)rna中的尿苷的修饰的核苷可以是以下任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m3u)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2u)、4-硫代-尿苷(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5u)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo5u)、5-羧基甲基-尿苷(cm5u)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5u)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲基酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2u)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2u)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5u)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2u)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5u)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5u)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(d)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5d)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5u)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2u)、α-硫代-尿苷、2′‑o-甲基-尿苷(um)、5,2′‑o-二甲基-尿苷(m5um)、2′‑o-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′‑o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2′‑o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2′‑o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′‑o-甲基-尿苷(cmnm5um)、3,2′‑o-二甲基-尿苷(m3um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′‑o-甲基-尿苷(inm5um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′‑f-阿糖-尿苷、2′‑f-尿苷、2′‑oh-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-e-丙烯基氨基)尿苷或本领域已知的任何其他修饰的尿苷。[0659]被假尿苷修饰(部分或完全，优选完全替换尿苷)的rna(优选mrna)在本文中称作“ψ-修饰的”，而术语“m1ψ-修饰的”表示rna(优选mrna)含有n(1)-甲基假尿苷(部分或完全，优选完全替换尿苷)。此外，术语“m5u-修饰的”表示rna(优选mrna)含有5-甲基尿苷(部分或完全，优选完全替换尿苷)。这类ψ-或m1ψ-或m5u-修饰的rna与它们的未修饰形式相比表现出降低的免疫原性，因此在避免或最小化诱导免疫应答的应用中是优选的。[0660]可以将本公开的rna(优选mrna)的密码子进一步优化，例如，以增加rna的gc含量和/或替换细胞(或受试者)中稀有的密码子，其中由是所属细胞(或受试者)中的同义频繁密码子的密码子表达感兴趣的肽或蛋白。[0661]上述修饰的组合，即，掺入5'-帽结构，掺入poly-a序列，暴露poly-a序列，改变5'-和/或3'-utr(如掺入一个或多个3'-utr)，用合成核苷酸替换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，5-甲基胞苷用于胞苷和/或假尿苷(ψ)或n(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5u)用于尿苷)以及密码子优化对rna(优选mrna)的稳定性和翻译效率的提高具有协同效应。因此，在一优选实施方案中，根据本公开的rna(优选mrna)含有上述修饰中的至少两种、至少三种、至少四种或全部五种的组合，即，(i)掺入5'-帽结构，(ii)掺入poly-a序列，暴露poly-a序列；(iii)改变5'-和/或3'-utr(如掺入一个或多个3'-utr)；(iv)用合成核苷酸替换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，5-甲基胞苷用于胞苷和/或假尿苷(ψ)或n(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5u)用于尿苷)，以及(v)密码子优化。[0662]在一实施方案中，根据本公开的rna包含编码肽或蛋白，优选药学活性肽或蛋白的核酸序列。[0663]在一优选实施方案中，根据本公开的rna包含编码肽或蛋白，优选药学活性肽或蛋白的核酸序列，并且能够表达所述肽或蛋白，特别是如果被转移至细胞或受试者中。因此，根据本发明的rna优选含有编码区(开放阅读框(orf))，所述编码区编码肽或蛋白，优选编码药学活性肽或蛋白。在这方面，“开放阅读框”或“orf”是一段连续的密码子，以起始密码子开始并以终止密码子结束。[0664]根据本公开，术语“药学活性肽或蛋白”表示可以用于治疗个体的肽或蛋白，其中肽或蛋白的表达会有益于例如改善疾病或病症的症状。优选地，药学活性肽或蛋白具有治疗或姑息特性，并且可以将其给药以使疾病或病症的一种或多种症状改善、减轻、缓解、逆转、延迟发生或者减轻疾病或病症的一种或多种症状的严重程度。优选地，当以治疗有效量给药至个体时，药学活性肽或蛋白对个体的状况或疾病状态具有积极或有利的影响。药学活性肽或蛋白可以具有预防特性，并且可以用来延迟疾病或病症的发生或者减轻这种疾病或病症的严重程度。术语“药学活性肽或蛋白”包括完整的蛋白或多肽，并且还可以指其药学活性片段。其还可以包括肽或蛋白的药学活性类似物。[0665]药学活性肽和蛋白的具体实例包括但不限于细胞因子、激素、粘附分子、免疫球蛋白、免疫活性化合物、生长因子、蛋白酶抑制剂、酶、受体、凋亡调节剂、转录因子、肿瘤抑制蛋白、结构蛋白、重编程因子、基因组工程蛋白和血液蛋白。[0666]术语“细胞因子”涉及具有约5-20kda的分子量并参与细胞信号传导(例如，旁分泌、内分泌和/或自分泌信号传导)的蛋白。特别地，当释放时，细胞因子对其释放位置周围的细胞行为产生影响。细胞因子的实例包括淋巴因子、白介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(tnf)。根据本公开，细胞因子不包括激素或生长因子。细胞因子与激素的不同之处在于(i)它们通常在比激素更多变的浓度下起作用，并且(ii)一般由广泛的细胞产生(几乎所有有核细胞都可以产生细胞因子)。干扰素通常特征在于抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素是这样的蛋白，其通过与受调节细胞表面上的干扰素受体结合来改变和调节细胞内的基因转录，从而防止细胞内的病毒复制。干扰素可以分为两种类型。ifn-γ是唯一的ii型干扰素；其他都是i型干扰素。细胞因子的具体实例包括促红细胞生成素(epo)、集落刺激因子(csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、骨形态发生蛋白(bmp)、干扰素α(ifnα)、干扰素β(ifnβ)、干扰素γ(infγ)、白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素10(il-10)和白介素11(il-11)。[0667]术语“激素”涉及一类由腺体产生的信号传导分子，其中信号传导通常包括以下步骤：(i)在特定组织中合成激素；将激素(ii)储存和分泌；(iii)转运至其靶标；(iv)激素通过受体结合；(v)信号的中继和放大；以及(vi)激素的分解。激素与细胞因子的不同之处在于(1)激素通常以较少变化的浓度起作用，并且(2)一般由特定种类的细胞产生。在一实施方案中，“激素”是肽或蛋白激素，如胰岛素、加压素、催乳素、促肾上腺皮质激素(acth)、甲状腺激素、生长激素(如人生长激素或牛促生长素)、催产素、心房利钠肽(anp)、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦蛋白。[0668]术语“粘附分子”涉及位于细胞表面并参与细胞与其他细胞或与胞外基质(ecm)结合的蛋白。粘附分子通常是跨膜受体，并且可以分为钙非依赖性(例如，整合素、免疫球蛋白超家族、淋巴细胞归巢受体)和钙依赖性(钙粘着蛋白和选择素)。粘附分子的具体实例是整合素、淋巴细胞归巢受体、选择素(例如，p-选择素)和地址素。[0669]整合素也参与信号转导。特别地，当结合配体时，整合素调节细胞信号传导途径，例如，跨膜蛋白激酶如受体酪氨酸激酶(rtk)的途径。这种调节可以导致细胞生长、分裂、存活或分化或者细胞凋亡。整合素的具体实例包括：α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、αlβ2、αmβ2、αiibβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8和α6β4。[0670]术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白超家族”是指参与细胞的识别、结合和/或粘附过程的分子。属于这个超家族的分子具有共同特征，它们含有称作免疫球蛋白结构域或折叠的区域。免疫球蛋白超家族的成员包括抗体(例如，igg)、t细胞受体(tcr)、主要组织相容性复合物(mhc)分子、共受体(例如，cd4、cd8、cd19)、抗原受体辅助分子(例如，cd-3γ、cd3-δ、cd-3ε、cd79a、cd79b)、共刺激或抑制分子(例如，cd28、cd80、cd86)等。[0671]术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物，优选通过诱导和/或抑制免疫细胞成熟，诱导和/或抑制细胞因子生物合成，和/或通过刺激b细胞产生抗体来改变体液免疫。免疫活性化合物具有有效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可以下调免疫应答的其他方面，例如将免疫应答从th2免疫应答转移，这可用于治疗广泛的th2介导的疾病。免疫活性化合物可以用作疫苗佐剂。免疫活性化合物的具体实例包括白介素、集落刺激因子(csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体和抗原，特别是肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(如细菌、寄生虫或病毒抗原)、过敏原和自身抗原。[0672]术语“自身抗原”或“自体抗原”是指源自受试者体内的抗原(即，自身抗原也可以称作“自体的抗原”)，并且针对身体的这个正常部分产生异常强的免疫应答。这种针对自身抗原的强免疫反应可能是“自身免疫性疾病”的原因。[0673]术语“过敏原”是指一种源自受试者体外的抗原(即，过敏原也可以称作“异源抗原”)，并且产生异常强的免疫应答，其中受试者的免疫系统击退感知中的威胁，如果不击退，所述感知中的威胁对受试者无害。“过敏症”是由这种对过敏原的强免疫反应引起的疾病。过敏原通常是能够通过免疫球蛋白e(ige)应答在特应性个体中刺激i型超敏反应的抗原。过敏原的具体实例包括源自花生蛋白(例如，arah2.02)、卵清蛋白、草花粉蛋白(例如，phlp5)和尘螨蛋白(例如，derp2)的过敏原。[0674]术语“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的分子。通常，生长因子充当细胞之间的信号传导分子。术语“生长因子”包括与其靶细胞表面上的特异性受体结合的特定细胞因子和激素。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白(bmp)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血管内皮生长因子(vegf)、如egfa、表皮生长因子(egf)、胰岛素样生长因子、肝配蛋白、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、神经调节蛋白、神经营养蛋白(例如，脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf))、胎盘生长因子(pgf)、血小板源性生长因子(pdgf)、肾胺酶(rnls)(抗凋亡存活因子)、t细胞生长因子(tcgf)、血小板生成素(tpo)、转化生长因子(转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-β))以及肿瘤坏死因子-α(tnf-α)。在一实施方案中，“生长因子”是肽或蛋白生长因子。[0675]术语“蛋白酶抑制剂”是指抑制蛋白酶功能的分子，特别是肽或蛋白。蛋白酶抑制剂可以根据被抑制的蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶抑制剂)或它们的作用机制(例如，自杀抑制剂，如丝氨酸蛋白酶抑制剂)进行分类。蛋白酶抑制剂的具体实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶和苯丁抑制素。[0676]术语“酶”是指加速化学反应的大分子生物催化剂。像任何催化剂一样，酶不会在它们催化的反应中被消耗，并且不改变所述反应的平衡。与许多其他催化剂不同，酶的特异性要高得多。在一实施方案中，酶对于受试者的体内稳态是必不可少的，例如，酶的任何功能障碍(特别地，可能由任何突变、缺失或产生减少引起的活性降低)都会导致疾病。酶的实例包括单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(hsv1-tk)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶和乳糖酶。[0677]术语“受体”是指从细胞外接收信号(特别是称作配体的化学信号)的蛋白分子。信号(例如，配体)与受体的结合引起细胞的某种应答，例如，激酶的细胞内激活。受体包括跨膜受体(如离子通道偶联(离子型)受体、g蛋白偶联(代谢型)受体和酶联受体)和细胞内受体(如细胞质受体和核受体)。受体的具体实例包括类固醇激素受体、生长因子受体和肽受体(即，配体是肽的受体)，如p-选择素糖蛋白配体-1(psgl-1)。术语“生长因子受体”是指与生长因子结合的受体。[0678]术语“细胞凋亡调节剂”是指调节细胞凋亡，即激活或抑制细胞凋亡的分子，特别是肽或蛋白。凋亡调节剂可以分为两大类：调节线粒体功能的调节剂和调节胱天蛋白酶的调节剂。第一类包括蛋白(例如，bcl-2、bcl-xl)，其通过防止线粒体膜电位丧失和/或促凋亡蛋白如细胞色素c释放至胞质溶胶中来保护线粒体完整性。促凋亡蛋白(例如，bax、bak、bim)也属于第一类，其促进细胞色素c的释放。第二类包括阻断胱天蛋白酶激活的蛋白，如凋亡蛋白抑制剂(例如，xiap)或flip。[0679]术语“转录因子”涉及调节遗传信息从dna转录为信使rna的速率的蛋白，特别是通过与特定dna序列结合来调节。转录因子可以调节整个生命过程中的细胞分裂、细胞生长和细胞死亡；胚胎发育期间的细胞迁移和组织；和/或响应来自细胞外的信号，如激素。转录因子含有至少一个与特定dna序列(通常与受转录因子调节的基因相邻)结合的dna-结合结构域。转录因子的具体实例包括mecp2、foxp2、foxp3、stat蛋白家族和hox蛋白家族。[0680]术语“肿瘤抑制蛋白”涉及保护细胞免于向癌症路径上的一步的分子，特别是肽或蛋白。肿瘤抑制蛋白(通常由相应的肿瘤抑制基因编码)表现出对细胞周期调节的减弱或抑制作用和/或促进细胞凋亡。它们的功能可能是以下一种或多种：抑制对细胞周期持续至关重要的基因；将细胞周期与dna损伤耦合(只要细胞中存在受损的dna，就不会发生细胞分裂)；如果不可以修复受损的dna，则启动细胞凋亡；转移抑制(例如，防止肿瘤细胞分散，阻断接触抑制的丧失以及抑制转移)；以及dna修复。肿瘤抑制蛋白的具体实例包括p53、磷酸酶和张力蛋白同系物(pten)、swi/snf(switch/sucrosenon-fermentable)、vonhippel–lindau肿瘤抑制蛋白(pvhl)、结肠腺瘤息肉蛋白(apc)、cd95、致瘤性抑制5(st5)、致瘤性抑制5(st5)、致瘤性抑制14(st14)和yippee样3(ypel3)。[0681]术语“结构蛋白”是指赋予生物组分刚度和刚性的蛋白，如果没有，所述生物学组分是流体。结构蛋白大多是纤维状的(如胶原蛋白和弹性蛋白)，但是也可以是球状的(如肌动蛋白和微管蛋白)。通常，球状蛋白作为单体是可溶的，但是聚合形成长纤维，例如，其可以构成细胞骨架。其他结构蛋白是能够产生机械力的发动蛋白(如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白)，以及表面活性蛋白。结构蛋白的具体实例包括胶原蛋白、表面活性蛋白a、表面活性蛋白b、表面活性蛋白c、表面活性蛋白d、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白。[0682]术语“重编程因子”或“重编程转录因子”涉及分子，特别是肽或蛋白，当在体细胞中任选地与其他物质如其他重编程因子一起表达时，其导致所述体细胞重编程或去分化为具有干细胞特征，特别是多能性的细胞。重编程因子的具体实例包括oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28和nanog。[0683]术语“基因组工程蛋白”涉及能够在受试者基因组中插入、缺失或置换dna的蛋白。基因组工程蛋白的具体实例包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和成簇的规律间隔短回文重复-crispr-相关蛋白9(crispr-cas9)。[0684]术语“血液蛋白”涉及存在于受试者的血浆，特别是健康受试者的血浆中的肽或蛋白。血液蛋白具有多种功能，如转运(例如，白蛋白、转铁蛋白)、酶促活性(例如，凝血酶或血浆铜蓝蛋白)、凝血(例如，纤维蛋白原)、防御病原体(例如，补体组分和免疫球蛋白)、蛋白酶抑制剂(例如，α1-抗胰蛋白酶)等。血液蛋白的具体实例包括凝血酶、血清白蛋白、因子vii、因子viii、胰岛素、因子ix、因子x、组织纤溶酶原激活物、蛋白c、vonwillebrand因子、抗凝血酶iii、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、改良的因子viii和抗凝剂。[0685]因此，在一实施方案中，药学活性肽或蛋白是(i)细胞因子，优选选自促红细胞生成素(epo)、白介素4(il-2)和白介素10(il-11)，更优选epo；(ii)粘附分子，特别是整合素；(iii)免疫球蛋白，特别是抗体；(iv)免疫活性化合物，特别是抗原；(v)激素，特别是加压素、胰岛素或生长激素；(vi)生长因子，特别是vegfa；(vii)蛋白酶抑制剂，特别是α1-抗胰蛋白酶；(viii)酶，优选选自单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(hsv1-tk)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶和乳糖酶；(ix)受体，特别是生长因子受体；(x)细胞凋亡调节剂，特别是bax；(xi)转录因子，特别是foxp3；(xii)肿瘤抑制蛋白，特别是p53；(xiii)结构蛋白，特别是表面活性蛋白b；(xiv)重编程因子，例如，选自oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28和nanog；(xv)基因组工程蛋白，特别是成簇的规律间隔短回文重复-crispr-相关蛋白9(crispr-cas9)；以及(xvi)血液蛋白，特别是纤维蛋白原。[0686]在一实施方案中，药学活性肽或蛋白包含一种或多种抗原或者一种或多种表位，即，向受试者给药所述肽或蛋白在受试者中引发针对所述一种或多种抗原或者一种或多种表位的免疫应答，这可能是治疗性的或者部分或完全保护性的。[0687]在某些实施方案中，所述rna编码至少一种表位。在某些实施方案中，所述表位源自肿瘤抗原。所述肿瘤抗原可以是“标准”抗原，其一般已知在各种癌症中表达。所述肿瘤抗原也可以是“新抗原”，其是个体肿瘤特异性的，并且以前尚未被免疫系统识别。新抗原或新表位可能由癌细胞基因组中的一个或多个癌症特异性突变导致氨基酸改变所致。肿瘤抗原的实例包括但不限于p53，art-4，bage，β-联蛋白/m，bcr-ablcamel，cap-1，casp-8，cdc27/m，cdk4/m，cea，密蛋白家族的细胞表面蛋白，如claudiν-6、claudin-18.2和claudin-12，c-myc，ct，cyp-b，dam，elf2m，etv6-aml1，g250，gage，gnt-v，gap100，hage，her-2/neu，hpv-e7，hpv-e6，hast-2，htert(或htrt)，lage，ldlr/fut，mage-a，优选mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11或mage-a12，mage-b，mage-c，mart-1/melan-a，mc1r，肌球蛋白/m，muc1，mum-1，mum-2，mum-3，na88-a，nf1，ny-eso-1，ny-br-1，pl90次要bcr-abl，pml/rara，prame，蛋白酶3，psa，psm，rage，ru1或ru2，sage，sart-1或sart-3，scgb3a2，scp1，scp2，scp3，ssx，survivin，tel/aml1，tpi/m，trp-1，trp-2，trp-2/int2，tpte，wt以及wt-1。[0688]癌症突变因人而异。因此，编码新的表位(新表位)的癌症突变代表在开发疫苗组合物和免疫疗法中有吸引力的靶标。肿瘤免疫疗法的效力依赖于选择能够在宿主内诱导有效免疫应答的癌症特异性抗原和表位。rna可以用来将患者特异性肿瘤表位递送至患者。位于脾中的树突细胞(dc)代表对免疫原性表位或抗原(如肿瘤表位)的rna表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已显示使用多个表位会促进肿瘤疫苗组合物的治疗效力。肿瘤突变组(mutanome)的快速测序可以为个体化疫苗提供多个表位，所述疫苗可以由本文描述的rna编码，例如，作为单一多肽，其中所述表位任选地用接头隔开。在本公开的某些实施方案中，所述rna编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。示例性实施方案包括编码至少五个表位(称作“五表位”)的rna和编码至少十个表位(称作“十表位”)的rna。[0689]颗粒[0690]在本公开的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体，特别是颗粒形成化合物。优选地，颗粒含有由一种或多种类型的两亲物质(例如，两亲脂质、两亲聚合物和/或两亲蛋白/多肽)组成的包膜(例如，一个或多个层或薄层)。在这个上下文中，表述“两亲物质”表示所述物质具有亲水性和亲脂性特性。所述包膜还可以包含不必是两亲性的额外物质(例如，额外的脂质和/或额外的聚合物)。因此，在一实施方案中，所述颗粒是单层或多层结构，其中构成一个或多个层或薄层的物质包含一种或多种类型的两亲物质(特别是选自两亲脂质、两亲聚合物和/或两亲蛋白/多肽)，任选与不必是两亲性的额外物质(例如，额外的脂质和/或额外的聚合物)组合。在一实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米大小的结构，如微米或纳米大小的致密结构。在这方面，术语“微米大小”表示颗粒的所有三个外部尺寸都在微米级别，即，在1和5μm之间。根据本公开，术语“颗粒”包括脂质复合物颗粒(lpx)、脂质纳米颗粒(lnp)、polyplex颗粒、脂质多聚复合物颗粒、病毒样颗粒(vlp)和它们的混合物(例如，两种或更多种颗粒类型的混合物，如lpx和vlp的混合物或者lnp和vlp的混合物)。[0691]如本公开所用，“纳米颗粒”是指包含如本文描述的核酸(尤其是rna)和至少一种阳离子脂质的颗粒，其中所述颗粒的所有三个外部尺寸都在纳米级别，即，至少约1nm并低于约1000nm(优选地，在10和990nm之间，如在15和900nm之间，在20和800nm之间，在30和700nm之间，在40和600nm之间或在50和500nm之间)。优选地，最长轴和最短轴没有显著差异。优选地，颗粒的大小是它的直径。[0692]在本公开的上下文中，术语“脂质复合物(lipoplex)颗粒”涉及含有两亲脂质，特别是阳离子两亲脂质和如本文描述的核酸(尤其是rna)的颗粒。带正电荷的脂质体(由一种或多种两亲脂质，特别是阳离子两亲脂质制成)和带负电荷的核酸(尤其是rna)之间的静电相互作用导致核酸脂质复合物颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体一般可以使用阳离子两亲脂质如dotma和额外的脂质如dope合成。在一实施方案中，核酸(尤其是rna)脂质复合物颗粒是纳米颗粒。[0693]术语“脂质纳米颗粒”涉及纳米大小的脂质复合物颗粒。[0694]在本公开的上下文中，术语“”polyplex颗粒”涉及含有两亲聚合物，特别是阳离子两亲聚合物和如本文描述的核酸(尤其是rna)的颗粒。带正电荷的阳离子两亲聚合物和带负电荷的核酸(尤其是rna)之间的静电相互作用导致核酸polyplex颗粒的复合和自发形成。适合用于制备polyplex颗粒的带正电荷的两亲聚合物包括鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-l-赖氨酸、聚-l-精氨酸和组蛋白。在一实施方案中，核酸(尤其是rna)polyplex颗粒是纳米颗粒。[0695]术语“脂质多聚复合物(lipopolyplex)颗粒”涉及含有如本文描述的两亲脂质(特别是阳离子两亲脂质)、如本文描述的两亲聚合物(特别是阳离子两亲聚合物)和如本文描述的核酸(尤其是rna)的颗粒。在一实施方案中，核酸(尤其是rna)脂质多聚复合物颗粒是纳米颗粒。[0696]术语“病毒样颗粒”(在本文中缩写为vlp)是指与病毒非常相似但不含有所述病毒的任何遗传物质并因此是非传染性的分子。优选地，vlp含有如本文描述的核酸(优选rna)，所述核酸(优选rna)与衍生vlp的病毒是异源的。vlp可以通过病毒结构蛋白的单独表达合成，所述病毒结构蛋白然后可以自组装成病毒样结构。在一实施方案中，来自不同病毒的结构衣壳蛋白的组合可以用来产生重组vlp。vlp可以制备自多种病毒家族的组分，包括乙型肝炎病毒(hbv)(hbv衍生的小表面抗原(hbsag))、细小病毒科(例如，腺相关病毒)、乳头瘤病毒科(例如，hpv)、逆转录病毒科(例如，hiv)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)和噬菌体(例如qβ、ap205)。[0697]术语“含有核酸的颗粒”涉及如本文描述的与核酸(尤其是rna)结合的颗粒。在这方面，核酸(尤其是rna)可以粘附至所述颗粒的外表面(表面核酸(尤其是表面rna))和/或可以包含在所述颗粒中(包裹的核酸(尤其是包裹的rna))。[0698]在一实施方案中，本公开的方法和用途中利用的颗粒的大小(优选直径，即，半径的两倍，例如回转半径(rg)值的两倍或流体动力学半径的两倍)在约10至约2000nm的范围内，如至少约15nm(优选至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm或至少约100nm)和/或至多1900nm(优选至多约1900nm、至多约1800nm、至多约1700nm、至多约1600nm、至多约1500nm、至多约1400nm、至多约1300nm、至多约1200nm、至多约1100nm、至多约1000nm、至多约950nm、至多约900nm、至多约850nm、至多约800nm、至多约750nm、至多约700nm、至多约650nm、至多约600nm、至多约550nm或至多约500nm)，优选在约20至约1500nm的范围内，如约30至约1200nm、约40至约1100nm、约50至约1000、约60至约900nm、约70至800nm、约80至700nm、约90至600nm或约100至500nm，如在10至1000nm、15至500nm、20至450nm、25至400nm、30至350nm、40至300nm或50至250nm的范围内。[0699]在一实施方案中，核酸(尤其是rna)在处于游离形式时(即，未结合或粘附至含有核酸(尤其是rna)和颗粒的样品或对照组合物中的颗粒)或在处于未配制形式时(即，在缺少如本文所述的颗粒的组合物中，如缺少颗粒形成化合物(例如，构成脂质体(特别是阳离子脂质)和/或病毒样颗粒的组分))的大小(优选直径，即，半径的两倍如回转半径(rg)值的两倍或流体动力学半径的两倍)在约10至约200nm的范围内，如约15至约190nm、约20至约180nm、约25至约170nm或约30至约160nm。[0700]样品组合物[0701]根据本公开，样品组合物包含如本文公开的核酸(尤其是rna)和任选存在的如本文公开的颗粒。在一实施方案中，样品组合物包含如本文公开的rna。在一实施方案中，样品组合物包含如本文公开的rna和如本文公开的颗粒。在一实施方案中，样品组合物包含rna和如本文公开的颗粒的混合物，例如，两种或更多种类型的颗粒的混合物，如lpx和vlp的混合物或者lnp和vlp的混合物或者lpx、vlp和vlp的混合物。[0702]可以使用技术人员已知的程序提供(例如，制备)样品组合物。例如，可以通过如技术人员已知或本文公开的体外转录或化学合成提供(例如，制备)包含如本文公开的rna的样品组合物。然后这种包含rna的组合物可以用来产生包含rna和颗粒的样品组合物。例如，可以通过提供含有一种或多种合适脂质的脂质体组合物并将包含rna的组合物与脂质体组合物混合来制备这样的样品组合物。优选通过使用乙醇注射技术制备脂质体组合物。在一可选实施方案中，优选通过使用微流控流体动力学聚焦(mhf)(参见zizzarietal.,materials,10(2017),1411，其全部公开内容援引加入本文)或相似程序制备脂质体组合物。[0703]提供(例如，制备、加工(如纯化和/或干燥)和/或储存)样品组合物(例如第二方面的方法中的步骤(a)和(c)中提到的第一组合物或者第二方面的方法中的步骤(b)和(d)中提到的第二组合物)的几个反应条件可能对所述样品组合物的一个或多个参数有影响，其中所述一个或多个参数包括核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量，游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小(特别地，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)和含有核酸(尤其是rna)的颗粒定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)(额外的任选参数包括核酸(尤其是rna)的分子量、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(特别地，基于核酸(尤其是rna)的rg和/或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于核酸(尤其是rna)的rg和/或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于核酸(尤其是rna)的rg或rh值)、形状因子、形式因子和核酸(尤其是rna)包裹效率；其他额外的任选参数包括与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比，其中所述电荷比通常表示为n/p比例，并且可以作为颗粒大小的函数给出)。那些反应条件包括但不限于盐浓度/离子强度；温度(例如，用于干燥和/或储存)；ph或缓冲液浓度；光/辐射；氧；剪切力；压力；冷冻/解冻循环；干燥/复原循环；添加赋形剂(例如，稳定剂和/或螯合剂)；颗粒形成化合物(特别是脂质(例如，阳离子两亲脂质)和/或聚合物(例如，阳离子两亲聚合物))的类型和/或来源；核酸(尤其是rna)与颗粒形成化合物(特别是脂质(例如，阳离子两亲脂质)和/或聚合物(例如，阳离子两亲聚合物))的比例；电荷比；以及物理状态。[0704]a)盐和离子强度[0705]根据本公开，本文描述的样品组合物可以包含盐如氯化钠。不希望受理论束缚，氯化钠用作离子渗透压剂，用于在与至少一种阳离子脂质混合之前预处理核酸(尤其是rna)。某些实施方案考虑本公开中氯化钠的替代有机或无机盐。替代盐包括但不限于氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、乙酸钾、磷酸二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(edta)的钠盐。[0706]一般来说，包含本文描述的核酸(尤其是rna)颗粒的样品组合物可以包含氯化钠，所述氯化钠的浓度优选范围为0mm至约500mm、约2mm至约400mm、约4mm至约300mm、约6mm至约200mm或约10mm至约100mm。示例性盐浓度包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100mm的盐，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、(羟甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸(tapso)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(hepes)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(tes)、1,4-哌嗪二乙磺酸(pipes)、二甲胂酸、2-吗啉-4-基乙磺酸(mes)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(mopso)或磷酸缓冲盐水(pbs)。其他合适的缓冲剂可以是盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。[0716]在一些实施方案中，缓冲剂具有约5.7至约6.7的ph。在具体实施方案中，缓冲剂具有约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6或约6.7的ph。在一实施方案中，缓冲剂是hepes。在一优选实施方案中，hepes具有约5.7至约6.7的ph。在具体实施方案中，hepes具有约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6或约6.7的ph。在一示例性实施方案中，hepes具有约6.2的ph。[0717]在另一实施方案中，缓冲剂具有约2.5mm至约10mm的浓度。在hepes是缓冲剂的具体实施方案中，hepes的浓度为约2.5mm、约2.75mm、3.0mm、约3.25mm、约3.5mm、约3.75mm、约4.0mm、约4.25mm、约4.5mm、约4.75mm、约5.0mm、约5.25mm、约5.5mm、约5.75mm、约6.0mm、约6.25mm、约6.5mm、约6.75mm、约7.0mm、约7.25mm、约7.5mm、约7.75mm、约8.0mm、约8.25mm、约8.5mm、约8.75mm、约9.0mm、约9.25mm、约9.5mm、约9.75mm或约10.0mm。在一优选实施方案中，hepes的浓度为约7.5mm。[0718]d)光、辐射、氧、剪切力和/或压力[0719]一般来说，可以在选自光、辐射、氧、剪切力和/或压力的条件下制备本文描述的样品组合物，所述条件适合核酸(尤其是rna)的稳定性以及适合核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性。但是，例如，在样品组合物的合成、加工和/或储存期间，可能需要应用对于核酸(尤其是rna)的稳定性以及对于核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性不是最佳的光、辐射、氧、剪切力和/或压力。因此，可能需要分析这些压力条件(即，光、辐射、氧、剪切力和/或压力，它们对于核酸(尤其是rna)的稳定性以及对于核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性不是最佳的)可以如何影响样品组合物的一个或多个参数。[0720]在一些实施方案中，在没有光的情况下，即在黑暗中制备本文描述的样品组合物。[0721]在一些实施方案中，在没有辐射的情况下制备本文描述的样品组合物。在可选的实施方案中，使用辐射，例如微波辐射制备本文描述的样品组合物。[0722]在一些实施方案中，在环境空气(即，含氧空气)下制备本文描述的样品组合物。在可选的实施方案中，在惰性气体(如氮气或稀有气体)下，即在不存在氧气的情况下制备本文描述的样品组合物。以这种方式，人们可以分析氧的存在是否对核酸(尤其是rna)的稳定性以及对核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性(特别是对作为颗粒组分的脂质的稳定性)有影响，例如在样品组合物的储存过程中，并且可以建立随时间推移的稳定性谱。[0723]在一些实施方案中，在高剪切力下制备本文描述的样品组合物(例如，使用乙醇注射技术或微流控流体动力学聚焦(mhf)(参见zizzarietal.,materials,10(2017),1411))。在可选的实施方案中，在低剪切力下制备本文描述的样品组合物(例如，通过使用移液管将包含如本文描述的rna的组合物与如本文描述的脂质体组合物混合)。以这种方式，人们可以分析不同剪切力的应用是否对核酸(尤其是rna)的稳定性以及对核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性有影响。[0724]在一些实施方案中，在环境压力下制备本文描述的样品组合物。在可选的实施方案中，在低于环境压力或高于环境压力的压力下制备本文描述的样品组合物。以这种方式，人们可以分析不同压力的应用是否对核酸(尤其是rna)的稳定性以及对核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性有影响。[0725]e)冷冻/解冻循环[0726]在一实施方案中，可以将样品组合物储存在低于-10℃的温度下(例如，约-15℃至约-40℃)，然后解冻至约4℃至约25℃的温度(环境温度)。在另一实施方案中，样品组合物可以经受多次冻融循环(例如，在低于-10℃的温度下冷冻(例如，约-15℃至约-40℃)以及解冻至约4℃至约25℃的温度(环境温度))。以这种方式，人们可以分析一个或多个冻融循环的应用是否对核酸(尤其是rna)的稳定性以及对核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性有影响。[0727]在一实施方案中，可以将样品组合物储存在低于-10℃的温度下(例如，约-15℃至约-40℃)。在一可选实施方案中，样品组合物可以不冷冻保存。以这种方式，人们可以分析冷冻是否对核酸(尤其是rna)的稳定性以及对核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性有影响。[0728]f)干燥/复原循环[0729]在一实施方案中，样品组合物可以以干燥形式储存，然后使用适当的溶剂或溶剂混合物(例如，水性溶剂)复原。干燥形式可以通过喷雾干燥、冻干或冷冻样品制品获得。在一可选实施方案中，这种干燥/复原循环可以重复一次或多次。以这种方式，人们可以分析多个干燥/复原循环的应用是否对核酸(尤其是rna)的稳定性以及对核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性有影响。[0730]g)赋形剂[0731]本文描述的样品组合物可以包含一种或多种赋形剂。这类赋形剂包括但不限于稳定剂、螯合剂、载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、增香剂或着色剂。在一可选实施方案中，本文描述的样品组合物不含赋形剂。以这种方式，人们可以分析特定赋形剂(例如，稳定剂或螯合剂)的存在是否对核酸(尤其是rna)的稳定性以及对核酸(尤其是rna)颗粒(如果存在)的稳定性有影响。[0732]例如，本文描述的样品组合物可以包含稳定剂以避免产品质量的大量损失，特别是在冷冻、冻干或喷雾干燥期间以及冷冻、冻干或喷雾干燥组合物的储存期间核酸(尤其是rna)活性的大量损失。通常，稳定剂在冷冻、冻干或喷雾干燥过程之前存在，并且在所得的冷冻、冻干和冷冻干燥制品中持续存在。它可以用来在冷冻、冻干或喷雾干燥期间以及冷冻、冻干或冷冻干燥制品的储存期间保护核酸(尤其是rna)，例如以减少或防止聚集、颗粒塌陷、核酸(尤其是rna)降解和/或其他类型的损伤。[0733]在一实施方案中，稳定剂是碳水化合物。如本文所用，术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。[0734]在一实施方案中，稳定剂是单糖。如本文所用，术语“单糖”是指不可以水解为更简单的碳水化合物单元的单个碳水化合物单元(例如，简单糖(simplesugar))。示例性单糖稳定剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。[0735]在一实施方案中，稳定剂是二糖。如本文所用，术语“二糖”是指由2个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4个键或1-6个键键合在一起。二糖可以水解为两个单糖。示例性二糖稳定剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。[0736]术语“三糖”表示连接在一起形成一个分子的三个糖。三糖的实例包括棉子糖和松三糖。[0737]在一实施方案中，稳定剂是寡糖。如本文所用，术语“寡糖”是指由3至约15个，优选3至约10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4个键或1-6个键键合在一起，形成线性、支化或环状结构。示例性寡糖稳定剂包括环糊精、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可以是氧化或还原的。[0738]在一实施方案中，稳定剂是环状寡糖。如本文所用，术语“环状寡糖”是指由3至约15个，优选6、7、8、9或10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4个键或1-6个键键合在一起，形成环状结构。示例性环状寡糖稳定剂包括作为离散化合物的环状寡糖，如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。[0739]其他示例性环状寡糖稳定剂包括在较大分子结构中包括环糊精部分的化合物，如含有环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可以是氧化或还原的，例如，氧化为二羰基形式。如本文所用，术语“环糊精部分”是指并入较大分子结构(如聚合物)中或是其一部分的环糊精(例如，α、β或γ环糊精)基团。环糊精部分可以直接或通过任选存在的接头键合至一个或多个其他部分。环糊精部分可以是氧化或还原的，例如，氧化为二羰基形式。[0740]碳水化合物稳定剂，例如，环状寡糖稳定剂，可以是衍生化的碳水化合物。例如，在一实施方案中，稳定剂是衍生化的环状寡糖，例如，衍生化的环糊精，例如，2-羟丙基-β-环糊精，例如，部分醚化的环糊精(例如，部分醚化的β环糊精)。[0741]示例性稳定剂是多糖。如本文所用，术语“多糖”是指由至少16个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4个键或1-6个键键合在一起，形成线性、支化或环状结构，并且包括含有多糖作为其骨架结构一部分的聚合物。在骨架中，多糖可以是线性或环状的。示例性多糖稳定剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糖糊精等。[0742]在一实施方案中，稳定剂是糖醇。如本文所用，术语“糖醇”是指“糖”的还原产物，并且表示简单糖醇分子中的所有氧原子都以羟基形式存在。所述糖醇是“多元醇”。这个术语是指含有三个或更多个羟基的化合物，并且与另一个惯用术语多元醇(polyhydricalcohol)同义。糖醇的实例包括但不限于山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓醇、甘油、木糖醇或肌醇。[0743]在一实施方案中，样品组合物可以包括蔗糖作为稳定剂。不希望受理论束缚，蔗糖的作用是促进样品组合物的冷冻保护，从而防止核酸(尤其是rna)颗粒聚集并保持组合物的化学和物理稳定性。某些实施方案考虑本公开中蔗糖的替代稳定剂。替代稳定剂包括但不限于海藻糖、葡萄糖、果糖、精氨酸、甘油、甘露醇、脯氨酸、山梨醇、甘氨酸甜菜碱和葡聚糖。在一具体实施方案中，蔗糖的替代稳定剂是海藻糖。[0744]在一实施方案中，稳定剂的浓度为约5％(w/v)至约35％(w/v)，如约10％(w/v)至约25％(w/v)、约15％(w/v)至约25％(w/v)或约20％(w/v)至约25％(w/v)。[0745]在一实施方案中，本文描述的样品组合物包含螯合剂。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键，从而产生稳定的水溶性络合物的化合物。不希望受理论束缚，螯合剂降低游离二价离子的浓度，否则其可能诱导样品组合物中核酸(尤其是rna)的加速降解。合适的螯合剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、edta的盐、去铁草酰胺b、去铁胺、二乙基二硫代氨基甲酸盐钠(dithiocarbsodium)、青霉胺、三胺五乙酸钙、三胺五乙酸的钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氨三乙酸、反式-二氨基环己烷四乙酸(dcta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、双(氨基乙基)乙二醇醚-n,n,n',n'-四乙酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸或其盐。在某些实施方案中，螯合剂是edta或edta的盐。在一示例性实施方案中，螯合剂是edta二钠二水合物。[0746]在一些实施方案中，edta以约0.25mm至约5mm，如约0.3mm至约4.5mm、约0.5mm至约4.0mm、约1.0mm至约3.5mm或约1.5mm至约2.5mm的浓度包含在样品组合物中。在一优选实施方案中，edta以约2.5mm的浓度包含在样品组合物中。[0747]h)颗粒形成化合物[0748]颗粒形成化合物，即，主要组成样品组合物的含有核酸(尤其是rna)的颗粒的化合物(特别是脂质(例如，阳离子两亲脂质)和/或聚合物(例如，阳离子两亲聚合物))的量和/或类型和/或来源(例如，天然、半合成或合成来源)可能对所述样品组合物的一个或多个参数有影响。可以通过将本公开的方法和/或用途应用于不同样品组合物从而确定所述不同样品组合物的一个或多个参数，并且比较对不同样品组合物中的一种确定的一个或多个参数与对不同样品组合物中的另一种确定的一个或多个参数来分析影响。可以使用不同条件提供这些不同的样品组合物，包括但不限于不同浓度的核酸(尤其是rna)、不同来源的脂质和/或聚合物(例如，天然、半合成或合成来源)、阳离子两亲脂质以外的脂质的存在或不存在、阳离子两亲脂质以外的聚合物的存在或不存在、不同浓度的总脂质、不同浓度的总聚合物、不同浓度的脂质和聚合物总量、以及不同比例的核酸(尤其是rna)与颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)。尽管核酸和颗粒形成化合物都是含有核酸(尤其是rna)的颗粒的组分，但是如本公开所用的表述“颗粒形成化合物”不涵盖任何核酸。[0749]一般来说，本文描述的样品组合物中的核酸浓度可以为约0.01mg/ml至约2mg/ml，如约0.05mg/ml至约1mg/ml或约0.1mg/ml至约0.5mg/ml。因此，在本公开的某些实施方案中，本文描述的样品组合物中的rna浓度为约0.01mg/ml至约2mg/ml，如约0.05mg/ml至约1mg/ml或约0.1mg/ml至约0.5mg/ml。[0750]在一实施方案中，本文描述的脂质溶液、脂质体和核酸(尤其是rna)颗粒包括阳离子两亲脂质。如本文所用，“阳离子两亲脂质”是指具有净正电荷的两亲脂质。阳离子两亲脂质通过静电相互作用将带负电荷的核酸(尤其是rna)与脂质基质结合。一般来说，阳离子两亲脂质具有亲脂性部分，如固醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常带有正电荷。阳离子两亲脂质的实例包括但不限于1,2-二-o-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)，二甲基双十八烷基铵(ddab)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(dodac)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(dimethylazanium)(dmrie)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(dmepc)、l,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(dorie)以及2,3-二油酰基氧基-n-[2(精胺羧酰胺)乙基]-n,n-二甲基-l-丙基铵(propanamium)三氟乙酸盐(dospa)。优选dotma、dotap、dodac和dospa。在具体实施方案中，至少一种阳离子两亲脂质是dotma和/或dotap。在一实施方案中，至少一种阳离子两亲脂质是dotma，特别是(r)-dotma。[0751]可以掺入额外的脂质以调节核酸(特别是rna)颗粒的整体正负电荷比和物理稳定性。在某些实施方案中，额外的脂质是中性脂质。如本文所用，“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的实例包括但不限于1,2-二-(9z-十八烯酰基(octadecenoyl))-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、聚乙二醇化神经酰胺(例如，n-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(peg)]}和n-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(peg)]}，其中peg为(聚乙二醇)750、(聚乙二醇)2000或(聚乙二醇)5000)、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、聚乙二醇化胆固醇(如胆固醇-(聚乙二醇)600)、聚乙二醇化二酰基甘油酯(如二硬脂酰基-rac-甘油-peg2000、1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000、1,3-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000或者1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000和1,3-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000的混合物)以及脑苷脂。在具体实施方案中，第二脂质是dope、胆固醇和/或dopc。[0752]在某些实施方案中，核酸(尤其是rna)颗粒包括阳离子两亲脂质和额外的脂质。在一示例性实施方案中，阳离子两亲脂质是dotma，额外的脂质是dope。不希望受理论束缚，至少一种阳离子两亲脂质的量与至少一种额外的脂质的量相比可能影响重要的核酸(尤其是rna)颗粒特征，如电荷、颗粒大小、稳定性、组织选择性和核酸(尤其是rna)的生物活性。因此，在一些实施方案中，至少一种阳离子两亲脂质与至少一种额外的脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。在具体实施方案中，所述摩尔比可以是约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在一示例性实施方案中，至少一种阳离子两亲脂质与至少一种额外的脂质的摩尔比是约2:1。[0753]一般来说，本文描述的样品组合物中的总脂质浓度可以为约0.1至约100mg/ml，如约0.5至约90mg/ml、约1至约80mg/ml、约2至约70mg/ml、约4至约60mg/ml、约6至约50mg/ml、约8至约40mg/ml或约10至约20mg/ml。[0754]核酸(尤其是rna)与颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的比例也可以对所述样品组合物的一个或多个参数有影响，其中所述一个或多个参数包括核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小(特别地，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的rg或rh值)(额外的任选存在的参数包括核酸(尤其是rna)的分子量、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(特别地，基于核酸(尤其是rna)的rg和/或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于核酸(尤其是rna)的rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于核酸(尤其是rna)的rg或rh值)、形状因子、形式因子以及核酸(尤其是rna)的包裹效率)以及与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)总量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出；以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比，其中其中所述电荷比通常表示为n/p比)。例如，电荷比(见下文)可能对这些参数中的一个或多个有影响。此外，中性脂质与阳离子两亲脂质的比例也可能对这些参数中的一个或多个有影响。[0755]一般来说，核酸(尤其是rna)与颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的比例可以为约1:100至约10:1(w/w)，如约1:90至约5:1(w/w)、约1:80至约1:2(w/w)、约1:70至约1:1(w/w)、约1:60至约1:2(w/w)、约1:55至约1:5、约1:50至约1:10、约1:45至约1:15、约1:40至约1:20或约1:35至约1:25(w/w)。[0756]i)电荷比[0757]本公开的核酸(尤其是rna)颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷和核酸(尤其是rna)中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子两亲脂质(或阳离子两亲聚合物)中存在的正电荷与核酸(尤其是rna)中存在的负电荷的比例。通过以下等式计算至少一种阳离子两亲脂质(或阳离子两亲聚合物)中存在的正电荷与核酸(尤其是rna)中存在的负电荷的电荷比：电荷比＝[(阳离子两亲脂质或聚合物浓度(mol))*(阳离子两亲脂质或聚合物中正电荷的总数)]/[(核酸(尤其是rna)浓度(mol))*(核酸(尤其是rna)中负电荷的总数)]。核酸(尤其是rna)浓度以及至少一种阳离子两亲脂质或聚合物量可以由本领域技术人员使用常规方法确定。[0758]电荷比可以对本文描述的样品组合物的一个或多个参数有影响。可以通过将本公开的方法和/或用途应用于已提供有不同电荷比的至少两种样品组合物，从而确定所述不同样品组合物的一个或多个参数，并且比较对至少两种不同样品组合物中的一种确定的一个或多个参数与对至少两种不同样品组合物中的另一种确定的一个或多个参数来分析影响。[0759]一般来说，在生理ph下，核酸(尤其是rna)颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约6:1至约1:2，如约5:1至约1.2:2、约4:1至约1.4:2、约3:1至约1.6:2、约2:1至约1.8:2或约1.6:1至约1:1。[0760]在第一实施方案中，在生理ph下，核酸(尤其是rna)颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2至约1:2。在具体实施方案中，在生理ph下核酸(尤其是rna)颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2.0、约1.8:2.0、约1.7:2.0、约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。在一实施方案中，在生理ph下核酸(尤其是rna)颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.3:2.0。在另一实施方案中，本文描述的核酸(尤其是rna)颗粒在生理ph下可以具有相等数量的正电荷和负电荷，产生具有净中性电荷比的核酸(尤其是rna)颗粒。具有根据第一实施方案的电荷比的核酸(尤其是rna)颗粒优先靶向脾组织或脾细胞如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。[0761]在第二实施方案中，在生理ph下，核酸(尤其是rna)颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约6:1至约1.5:1。在具体实施方案中，在生理ph下核酸(尤其是rna)颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约6.0:1.0、约5.8:1.0、约5.6:1.0、约5.4:1.0、约5.2:1.0、约5.0:1.0、约4.8:1.0、约4.6:1.0、约4.4:1.0、约4.2:1.0、约4.0:1.0、约3.8:1.0、约3.6:1.0、约3.4:1.0、约3.2:1.0、约3.0:1.0、约2.8:1.0、约2.6:1.0、约2.4:1.0、约2.2:1.0、约2.0:1.0、约1.8:1.0、约1.6:1.0或约1.5:1.0。具有根据第二实施方案的电荷比的核酸(尤其是rna)颗粒优先靶向肺组织或肺细胞。[0762]j)物理状态[0763]本文描述的样品组合物的物理状态(即，液体或固体)可能对所述样品组合物的一个或多个参数有影响。固体的非限制性实例包括冷冻形式或冻干形式。液体形式的非限制性实例包括溶液或悬浮液。固体形式可以通过喷雾干燥、冻干或冷冻样品制品获得。在一实施方案中，样品组合物可以是固体形式。在一可选实施方案中，样品组合物可以是液体形式(例如，作为溶液或悬浮液)。[0764]可以通过将本公开的方法和/或用途应用于已经以不同物理状态提供的至少两种样品组合物，从而确定所述不同样品组合物的一个或多个参数，并且比较对不同样品组合物中的一种确定的一个或多个参数与对不同样品组合物中的另一种确定的一个或多个参数来分析样品组合物的物理状态的影响。[0765]本公开的样品组合物的参数[0766]如果样品或对照组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，则所述核酸(尤其是rna)可以以游离形式(即，不结合/粘附至颗粒)和/或以结合形式(即，结合/粘附至颗粒)包含在所述样品或对照组合物中。核酸(尤其是rna)的总量是游离核酸(尤其是rna)(即，未结合的核酸(如未结合的rna))和结合的核酸(尤其是rna)的总和。结合的核酸(尤其是rna)由结合/粘附至颗粒外表面的核酸(尤其是rna)(在本文中也称作“表面核酸”(如“表面rna”))和包含/包裹在颗粒内的核酸(尤其是rna)(在本文中也称作“包裹的核酸”(如“包裹的rna”))组成。“表面核酸”(如“表面rna”)和游离核酸(如“游离rna”)的总和在本文中也称作“可接近的核酸”(如“可接近的rna”)。因此，除了核酸的总量(如rna的总量)和游离核酸的量(如游离rna的量)，包含核酸(尤其是rna)和颗粒的样品或对照组合物的额外参数是表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)和可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)。图21说明核酸和颗粒的样品或对照组合物中含有的上述核酸形式，其中所述核酸是rna。[0767]此外，当核酸(尤其是rna)为游离形式(即，不结合或粘附至包含核酸(尤其是rna)和颗粒的样品或对照组合物中含有的颗粒)或未配制形式(即，在组合物中缺少如本文所述的颗粒，如缺少构成脂质体的组分(特别是阳离子两亲脂质和/或阳离子两亲聚合物)和/或病毒样颗粒)时，也可以确定或分析核酸(尤其是rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(例如，基于核酸(如rna)的回转半径(rg)和/或核酸(如rna)的流体动力学半径(rh))。因此，包含游离或未配制形式的核酸(尤其是rna)的样品或对照组合物的额外参数是核酸(尤其是rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(每个基于例如rg或rh值)。[0768]进一步的参数包括例如源自上述参数中的一个或多个的那些，如形状因子、形式因子、核酸(尤其是rna)包裹效率、与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例、颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例、以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比(n/p比)。[0769]因此，在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个或至少6个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或全部)：核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(如rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的分子量、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、形状因子、形式因子、核酸(尤其是rna)包裹效率、与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例、颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例、以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比(n/p比)。在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个或至少6个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或全部)：核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(如rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、形状因子、形式因子、核酸(尤其是rna)包裹效率、与颗粒结合的核酸(如rna)的量比颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例、颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例、以及颗粒中的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比(n/p比)。在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个或至少6个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或全部)：核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(如rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、形状因子、形式因子以及核酸(尤其是rna)包裹效率。在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个或至少6个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或全部)：核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小(例如，基于含有核酸(如rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(如rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)以及核酸(尤其是rna)包裹效率。在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个或至少6个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或全部)：核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、表面核酸的量(如表面rna的量)、包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)、可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)、核酸(尤其是rna)的大小(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的大小分布(例如，基于rg或rh值)、核酸(尤其是rna)的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)以及核酸(尤其是rna)包裹效率。在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个、至少4个或至少5个，例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)：核酸完整性(尤其是rna完整性)、核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)。在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个或至少4个，例如，1个、2个、3个、4个或5个)：核酸(尤其是rna)的总量、游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)。在一些实施方案中，通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括以下的至少一个，优选至少两个(如至少3个，例如，1个、2个、3个或4个)：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量、含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)。[0770]在本公开的方法和/或用途的一些实施方案中(特别是那些，其中组合物(如样品或对照组合物)包含rna和颗粒)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的回转半径(rg)和/或含有核酸(尤其是rna)的颗粒的流体动力学半径(rh))和任选存在的本文指定的其余参数(包括额外的任选参数)中的至少一个参数，如至少两个参数；优选这些其余参数选自：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在本公开的方法和/或用途的一些实施方案中(特别是那些，其中组合物(如样品或对照组合物)包含rna和颗粒)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)和选自以下的至少一个参数，如至少两个参数：游离核酸(尤其是rna)的量、与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量以及含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布(例如，基于rg或rh值)。在本公开的方法和/或用途的一些实施方案中(特别是那些，其中组合物(如样品或对照组合物)包含rna和颗粒)，所述一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布(例如，基于rg或rh值)、游离核酸(尤其是rna)的量以及与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量。如果在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布，则会产生两个数据集，即，一个基于rg值，一个基于rh值。但是，根据本发明，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布的这两个数据集仅被视为一个参数(而不是两个参数)。此外，如果通过场-流分级获得的分级图谱显示多于一个颗粒峰，则每个颗粒峰的定量大小分布的确定仅被视为一个参数(而不是每个颗粒峰的一个参数)。这同样适用于在rg值和rh值的基础上确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布的情况。[0771]在一些实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数在步骤(a)-(c)的至少一个(例如，1-10个)循环中确定或分析。在一优选实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数在步骤(a)-(c)的一个循环中确定或分析。[0772]一般来说，通过本公开的方法和/或用途确定或分析样品组合物的参数(例如，核酸(尤其是rna)的量)。因此，在一些实施方案中，在进行本公开的方法或应用本公开的用途之前，样品组合物的一个或多个参数(例如，游离核酸(尤其是rna)的量)是未知的。但是，在一些实施方案中，样品组合物的一个或多个参数(例如，游离核酸(尤其是rna)的量)在第一个时间点是已知的，并且本公开的方法和/或用途用来至少在第二个、较晚的时间点确定或分析样品组合物的一个或多个参数(例如，游离核酸(尤其是rna)的量)(例如，在一定时期内(如一小时或多小时、一天或多天、一周或多周、一个月或多个月或者一年或多年)，每小时(如每天、每周、每个月或每年)至少一次(如至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少8次、至少10次))。因此，在一实施方案中，本公开的方法和/或用途可以用来在一定时期内(如一小时或多小时、一天或多天、一周或多周、一个月或多个月或者一年或多年)监测样品组合物的一个或多个参数，例如，在样品组合物的储存期间，以便确定一个或多个参数随时间变化的谱。[0773]在一可选实施方案中，本公开的方法和/或用途可以用来比较至少两种样品组合物的相同的一个或多个参数(例如，游离核酸(尤其是rna)的量)，其中所述至少两种样品组合物仅在提供所述至少两种样品组合物的一个或多个反应条件上不同。在这个实施方案中，可以分析不同反应条件对样品组合物的一个或多个参数的影响。这些反应条件包括但不限于合成条件、加工条件(例如，纯化和/或干燥条件)和储存条件。[0774]a.核酸完整性(尤其是rna完整性)[0775]根据本公开，核酸完整性(尤其是rna完整性)是代表样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)的降解程度的参数。例如，对于未降解的核酸(尤其是rna)，所述核酸的所有分子具有相同长度。因此，当使用场-流分级根据它们的大小或流体动力学移动性(例如，扩散系数)进行分离时，未降解的核酸(尤其是rna)应当产生一个尖峰。相反，核酸(尤其是rna)的降解导致长度不同的分子的混合物。因此，当使用场-流分级根据它们的大小或流体动力学移动性进行分离时，与未降解的核酸(尤其是rna)相比，在不同的保留时间，特别是在较早的保留时间检测到降解的核酸(尤其是rna)，并且与仅存在未降解的核酸(尤其是rna)的情况相比，未降解的核酸(尤其是rna)的峰更宽更小。降解程度越高，降解的核酸(尤其是rna)的峰越宽越高，而未降解的核酸(尤其是rna)的峰越宽越小。本领域技术人员能够使用常规实验室技术和仪器检测核酸(尤其是rna)。例如，通过场-流分级进行分离之后，可以通过测量选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号来检测核酸(尤其是rna)。因为核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)具有特征性消光系数，所以优选通过测量uv信号(优选在260nm-280nm范围内的波长，如在260nm或280nm的波长处)进行所述核酸(尤其是rna)的检测。[0776]例如，图6c示出包含未处理的rna、完全降解的rna或者未处理和降解的rna混合物的三种样品组合物的uv信号。如图6c所示，未处理的(即未降解的)rna在约17min的保留时间产生一个单峰，完全降解的rna在约4min的保留时间产生一个峰，而未降解和降解的rna混合物产生两个峰(分别在约4和约17min的保留时间)，它们小于完全未降解的rna获得的峰或完全降解的rna获得的峰。[0777]优选使用对照核酸(尤其是对照rna)的完整性确定或计算如本文公开的样品组合物的核酸完整性(尤其是rna完整性)。这种对照核酸(尤其是对照rna)通常包含在对照组合物中，其中对照组合物和样品组合物相同，除了(i)待确定或分析其对样品的一个或多个参数的影响的应用于样品组合物的条件和/或(ii)待确定或分析其对样品的一个或多个参数的影响的样品组合物组分的存在或不存在。例如，如果应用于样品组合物的条件是例如约98℃的高温(应用一段时间(例如，2、4或10min))，则各自的对照组合物与样品组合物相同(即，具有与样品组合物相同量的相同组分(特别是相同核酸(尤其是rna)等))，但是未经受高温。此外，例如，如果样品组合物额外地包含赋形剂(例如，稳定剂或螯合剂)，则各自的对照组合物与样品组合物相同，并且已经经受与样品组合物相同的条件，除了对照组合物不含所述赋形剂。此外，如果要在一段时间内监测样品组合物的一个或多个参数(例如，为了获得储存时的稳定性谱)，则对照组合物可以是初始样品组合物，即，在监测开始时的样品组合物。[0778]一般来说，如果使用对照核酸(尤其是对照rna)的完整性确定或计算如本文公开的样品组合物的核酸完整性(尤其是rna完整性)，优选为样品组合物确定或计算的完整性值与为对照组合物确定或计算的完整性值相关。因此，通常将为样品组合物确定或计算的完整性值归一化至为对照组合物确定或计算的完整性值，例如，根据以下等式，将为样品组合物确定或计算的完整性值(ivs)除以为对照组合物确定或计算的完整性值(ivc)来产生样品组合物的归一化完整性(isnorm.)：)，其中结果以百分比表示(因此为对照组合物确定或计算的完整性为100％)。[0779]在这方面，可以如技术人员已知的那样确定或计算完整性值，使用例如从对照或样品组合物的场-流分级获得的分级图谱中代表未降解的核酸(尤其是未降解的rna)的峰的面积和/或高度。[0780]在一优选实施方案中，在代表未降解的核酸(尤其是未降解的rna)的峰(uv、荧光或ri峰)面积的基础上确定或计算完整性值。特别地，完整性值确定或计算为(i)从所述峰的最大高度至所述峰末端的面积(a50％)和(ii)所述峰的总面积(a100％)的比例。例如，图2说明a50％和a100％值的确定或计算。特别地，图2a示出对照rna组合物的a50％值的确定或计算(a50％值的确定或计算限值用数字“1”表示)，而图2b示出对照rna组合物的a100％值的确定或计算(a100％值的确定或计算限值用数字“2”表示)。图2c和2d示出经受热处理的样品rna组合物的a50％(图2c)和a100％(图2d)值的确定或计算(因此，由于降解的rna的存在，图2c和2d中的峰更宽)。[0781]在一可选的优选实施方案中，在没有参考样品的情况下确定或计算完整性值。在这个实施方案中，样品组合物的完整性值优选是(i)2·a50％，即从所述峰的最大高度至所述峰末端的峰面积的两倍值和(ii)a100％(即所述峰的总面积)的比例。因此，根据以下等式确定或计算样品组合物中核酸(尤其是rna)的完整性：确定核酸(尤其是rna)完整性的其他程序是可能的(例如，峰的限值可以由峰的斜率定义)。为了验证峰最大值含有“完整”/未降解的核酸(尤其是rna)，可以从ls数据确定或计算核酸(尤其是rna)的分子量并与样品的理论计算的分子量(基于核酸序列以及共价或非共价连接至核酸的任选存在的额外物质(例如，一种或多种染料))进行比较。为了避免核酸(尤其是rna)的更高分子结构，应当用能够防止颗粒聚集体形成的溶剂或溶剂混合物稀释样品。例如，溶剂混合物可以是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物(如60％(v/v))。优选地，这种稀释在临分析之前进行(例如，在分析之前5min)和/或在升高的温度下进行(例如，在40℃-80℃的范围内，如50℃-70℃或55℃-65℃，或者在约60℃)。形成较高分子结构倾向低的样品可以在不用能够防止颗粒聚集体形成的溶剂或溶剂混合物稀释的情况下进行分析。[0782]在另一可选实施方案中，在代表未降解的核酸(尤其是未降解的rna)的峰(uv、荧光或ri峰)高度的基础上确定或计算完整性值。在这个实施方案中，样品组合物的完整性值是对样品组合物获得的分级图谱中所述峰的高度(hs)，并且对照组合物的完整性值是对对照组合物获得的分级图谱中所述峰的高度(hc)。因此，根据以下等式确定或计算样品组合物中核酸(尤其是rna)的归一化完整性：应当注意样品组合物中核酸(尤其是rna)的归一化完整性的这种确定或计算较不灵敏(与上述基于面积的实施方案相比，特别是a50％与a100％的比例)。因此，基于代表未降解的核酸(尤其是未降解的rna)的峰高度确定或计算样品组合物中核酸(尤其是rna)的归一化完整性的这个可选实施方案是不太优选的。[0783]在进一步的可选实施方案中，特别是当核酸(尤其是rna)的长度超过10,000个核苷酸(如长达15,000个核苷酸，或长达12,000个核苷酸)时，可以基于(a)选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，以及(b)ls信号(例如，mals信号)确定或计算样品组合物的完整性值。可以在不依赖参考核酸(尤其是rna)的情况下使用这个进一步的可选实施方案。如上所述，未降解的核酸(尤其是rna)应当产生一个尖峰，而核酸(尤其是rna)的降解导致长度不同的分子的混合物。因此，从代表未降解的核酸(尤其是rna)的ls信号(如mals信号)计算的分子量曲线应当是(接近)水平线，即，斜率约为0的连续曲线部分。相反，从代表部分降解的核酸(尤其是rna)的混合物(即，具有不同(优选递减)分子量的核酸(尤其是rna)混合物)的ls信号(如mals信号)计算的分子量曲线具有不同斜率的不同部分，其中斜率接近0的(优选连续的)部分理想地代表完整/未降解的核酸(尤其是rna)部分。因此，分子量曲线的(接近)水平部分分别开始和结束的保留时间(即，tb和te)可以视作代表“完整”/未降解的核酸(尤其是rna)的峰(uv、荧光或ri峰)的限制。为了确定这些保留时间，在这里分子量曲线的(接近)水平部分分别开始和结束，可以计算分子量曲线的一阶导数。然后，(优选连续的)部分的起点和终点，其中一阶导数约为0，代表期望的保留时间。因此，在这个进一步的可选实施方案中，样品组合物的完整性值优选确定或计算为(i)这些保留时间之间的峰(uv、荧光或ri峰)的面积与(ii)所述峰的总面积的比例。因此，在这个进一步的可选实施方案中，可以使用以下等式计算样品组合物中核酸(尤其是rna)的完整性(i)：其中apeak1是总峰面积(uv、荧光或ri峰)，apeak2是tb和te之间的峰面积(uv、荧光或ri峰)。为了验证峰最大值含有“完整”/未降解的核酸(尤其是rna)，可以从ls数据(如mals数据)确定或计算核酸(尤其是rna)的分子量并与样品的理论计算的分子量(基于核酸序列以及共价或非共价连接至核酸的任选存在的额外物质(例如，一种或多种染料))进行比较。为了避免核酸(尤其是rna)的更高分子结构，应当用能够防止颗粒聚集体形成的溶剂或溶剂混合物稀释样品。例如，溶剂混合物可以是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物(如60％(v/v))。优选地，这种稀释在临分析之前进行(例如，在分析之前5min)和/或在升高的温度下进行(例如，在40℃-80℃的范围内，如50℃-70℃或55℃-65℃，或者在约60℃)。形成较高分子结构倾向低的样品可以在不用能够防止颗粒聚集体形成的溶剂或溶剂混合物稀释的情况下进行分析。例如，图23说明在不使用参考核酸的情况下确定或计算核酸完整性的上述进一步的可选实施方案。特别地，图23a示出用在90°的ls信号(点线)和在260nm处的uv信号(实线)的sarna(具有11,917个核苷酸的长度)的af4分级图谱。粗黑线代表源自mals信号的分子量。为了确定未降解的/完整rna峰(峰2)的限值，对源自mals信号的分子量曲线(也显示在图23b的上图)进行微分以计算其一阶导数(显示在图23b的下图中)。根据图23b中示出的数据，大约为0的一阶导数的连续部分在t＝～15min(＝tb)开始，并且在t＝～31.8min(＝te)结束。[0784]如本文公开的，在本公开的方法和/或用途的步骤(b)中，测量一个或多个样品级分中至少一个的选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号，由此可以确定(样品)组合物中含有的核酸(尤其是rna)的量。因为核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)具有特征性消光系数，所以可以通过测量uv信号来确定所述核酸(尤其是rna)的量。如果核酸(尤其是rna)是荧光的(例如，因为核酸被荧光染料共价或非共价标记)或变成荧光的(例如，通过添加(特别是特异性地)粘附至核酸的荧光染料，如荧光嵌入性染料)，还可以通过测量荧光(fs)信号来确定核酸(尤其是rna)的量。或者，可以通过使用荧光染料标记的颗粒来确定与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量。在上述方法中可以使用任何荧光染料。荧光染料以及将荧光染料共价或非共价连接至核酸(尤其是rna)或另一物质(例如，构成如本文所述的颗粒的物质，如脂质和/或聚合物)的方法是技术人员已知的；参见，例如，"themolecularprobeshandbook-aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies",11thedt.(2010),i.johnsonandm.t.z.spence(editors)，其援引加入本文。此外，还可以通过测量折射率(ri)信号来确定核酸(尤其是rna)的量。[0785]b.核酸(尤其是rna)的总量[0786]一般来说，可以基于选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号确定或计算核酸(尤其是rna)的量。在一实施方案中，为此目的使用校准曲线，其中在含有不同已知量的对照核酸(尤其是rna)的几种对照组合物以及从所述对照核酸(尤其是rna)获得的选自uv信号、荧光信号和ri信号的至少一种信号的基础上建立所述校准曲线。[0787]核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)具有特征性消光系数。因此，在一可选和优选的实施方案中，通过测量uv信号(优选在260nm至280nm范围内的波长，如在260nm或280nm的波长)并使用lambert-beer定律来确定或计算核酸(尤其是rna)的量。例如，可以使用以下等式计算样品或对照组合物的核酸(尤其是rna)浓度：[0788][0789]其中c是核酸(尤其是rna)浓度(以mg/ml计)；a是uv峰面积(以aumin计)；f是场-流分级中使用的流速(以ml/min计)；ε是核酸的特定消光系数(例如，对于单链rna为0.025(mg/ml)-1cm-1)；d是细胞长度(以cm计)；v是样品或对照组合物或者其部分的注入体积。[0790]使用uv范围(例如，在260nm或280nm)的消光系数确定或计算核酸(尤其是rna)是有利的，因为其不需要建立校准曲线。[0791]如上所述，如果样品或对照组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，则核酸(尤其是rna)可以以游离形式(即，不结合/粘附至颗粒)和/或以结合形式(即，结合/粘附至颗粒)包含在组合物中。核酸(尤其是rna)的总量是游离核酸(尤其是rna)(即，未结合的核酸(如未结合的rna))和结合的核酸(尤其是rna)的总和。[0792]因此，为了确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的核酸(尤其是rna)的总量，(a)必须确定或计算所述样品或对照组合物的游离核酸(尤其是rna)的量和结合的核酸(尤其是rna)的量，或者(b)必须将一种形式的核酸(尤其是rna)(例如，结合的核酸(尤其是结合的rna))(优选完全)转化为另一种形式(例如，游离核酸(尤其是游离rna))并确定或计算后一种形式的量。这种转化可以例如通过向样品或对照组合物或者其部分添加释放剂来实现。释放剂能够从颗粒释放与颗粒结合的核酸(尤其是rna)(从而将结合的核酸(尤其是结合的rna)的量减少至零，并且将游离核酸(尤其是游离rna)的量增加至最大。释放剂的实例包括但不限于(i)表面活性剂，如阴离子表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)、两性离子表面活性剂(例如，正十四烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐(3-14))、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或它们的混合物；(ii)醇，如脂肪醇(例如，乙醇)，或醇的混合物；或者(iii)(i)和(ii)的组合。优选的释放剂是阴离子表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)、两性离子表面活性剂(例如，正十四烷基-n,n-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐3-14))或它们的组合。为了确保在场-流分级期间核酸(尤其是rna)不被重新吸收至颗粒中，在一实施方案中，待确定或计算其中含有的核酸(尤其是rna)的总量的样品或对照组合物或者所述样品或对照组合物的部分进行使用含有释放剂的液相的场-流分级。但是，如果使用3-14作为释放剂，则不必使用含有释放剂的液相。[0793]c.游离核酸(尤其是rna)的量[0794]与本文公开的颗粒相比，游离核酸(尤其是rna)的尺寸小得多，或者与本文公开的颗粒相比，在场-流分级中至少具有高得多的流体动力学移动性。因此，通过使用场-流分级，可以将游离核酸(尤其是rna)以及与颗粒结合的核酸(尤其是rna)分离为两个(优选基线分离的)峰，其中一个峰代表游离核酸(尤其是rna)，另一个峰代表与颗粒结合的核酸(尤其是rna)。例如，如果使用从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低值(如约0至约0.1ml/min)的交叉流速谱进行场-流分级，则较早保留时间的峰代表游离核酸(尤其是rna)，较晚保留时间的峰代表与颗粒结合的核酸(尤其是rna)。例如，图5说明通过对包含rna和颗粒的样品组合物进行场-流分级获得的代表性分级图谱，其中随时间记录uv信号(在260nm处记录；虚线)和光散射(ls)信号(实线)。浅灰色框表示游离rna的峰，而深灰色框表示与颗粒结合的rna(虚线)和颗粒(实线)。[0795]因此，可以以与上述用于确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的核酸(尤其是rna)总量相同的方式确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的游离核酸(尤其是rna)量。因此，在一实施方案中，基于选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的游离核酸(尤其是rna)的量，其中使用校准曲线。在一优选实施方案中，通过使用核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)的消光系数来确定或计算游离核酸(尤其是rna)的量。[0796]d.与颗粒结合的核酸(尤其是rna)的量[0797]如上所述，如果样品或对照组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，则核酸(尤其是rna)可以以游离形式(即，不结合/粘附至颗粒)和/或以结合形式(即，结合/粘附至颗粒)包含在组合物中。[0798]因此，在一实施方案中，可以从组合物中含有的核酸(尤其是rna)的总量和组合物中含有的游离核酸(尤其是游离rna)的量确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的结合的核酸(尤其是rna)的量，特别是通过从核酸(尤其是rna)的总量减去游离核酸(尤其是游离rna)的量。可以如上文所述确定或计算组合物中含有的结合的和游离核酸(尤其是rna)的量，例如，通过使用基于选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号的校准曲线，或者通过使用核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)的消光系数。[0799]e.表面核酸的量(如表面rna的量)[0800]如上所述，如果样品或对照组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，则所述核酸(尤其是rna)可以结合/粘附至所述颗粒的外表面(“表面核酸”(如“表面rna”))。可以通过向样品或对照组合物添加染料，特别是荧光染料来检测这种表面核酸(如表面rna)，其中所述染料(尤其是特异性地)与核酸(尤其是rna)结合，特别是与结合/粘附至颗粒外表面的核酸结合(即，所述染料优选不能与颗粒包裹的核酸结合)。适用于这个目的的染料，特别是荧光染料是技术人员已知的；参见，例如，"themolecularprobeshandbook-aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies",11thedt..(2010)。(特别是特异性地)与核酸(尤其是rna)结合，特别是与结合/粘附至颗粒的外表面的核酸结合的这类染料的具体实例包括嵌入性染料，例如，gelred(5,5'-(6,22-二氧代-11,14,17-三氧杂-7,21-二氮杂二十七烷-1,27-二基)双(3,8-二氨基-6-苯基菲啶-5-鎓)碘化物)、gelgreen(10,10'-(6,22-二氧代-11,14,17-三氧杂-7,21-二氮杂二十七烷-1,27-二基)双(3,6-双(二甲基氨基)吖啶-10-鎓)碘化物)、小檗碱、乙锭(如溴化乙锭)、亚甲蓝或原黄素，优选gelred。[0801]因此，在一实施方案中，可以由染料的信号，特别是荧光染料的荧光信号确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的表面核酸(尤其是表面rna)的量，如添加至样品或对照组合物的嵌入性染料(例如，gelred(5,5'-(6,22-二氧代-11,14,17-三氧杂-7,21-二氮杂二十七烷-1,27-二基)双(3,8-二氨基-6-苯基菲啶-5-鎓)碘化物)、gelgreen(10,10'-(6,22-二氧代-11,14,17-三氧杂-7,21-二氮杂二十七烷-1,27-二基)双(3,6-双(二甲基氨基)吖啶-10-鎓)碘化物)、小檗碱、乙锭(如溴化乙锭)、亚甲蓝或原黄素，优选gelred)，其中所述染料(尤其是特异性地)与核酸(尤其是rna)结合，特别是与结合/粘附至颗粒外表面的核酸(尤其是rna)结合。优选地，染料的光发射(例如，荧光发射)通过与表面核酸(尤其是表面rna)结合(如嵌入)而增强。[0802]在一实施方案中，为此目的，使用校准曲线，其中所述校准曲线是在几种含有染料(例如，荧光染料，如嵌入性染料，例如，gelred、gelgreen、小檗碱、乙锭(如溴化乙锭)、亚甲蓝或原黄素，优选gelred)和不同已知量的对照核酸(尤其是rna)的对照组合物以及来自染料的光发射信号(例如，来自荧光染料的荧光信号)的基础上建立的。[0803]f.包裹的核酸的量(如包裹的rna的量)[0804]如上所述，如果样品或对照组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，则核酸(尤其是rna)可以以结合形式(即，结合/粘附至颗粒)包含在组合物中，其中结合的核酸(尤其是rna)由结合/粘附至颗粒外表面的核酸(尤其是rna)(即，表面核酸(如表面rna))和包含/包裹在颗粒内的核酸(尤其是rna)(即，包裹的核酸(如包裹的rna))组成。[0805]因此，在一实施方案中，可以从组合物中含有的结合的核酸(尤其是结合的rna)的量和组合物中含有的表面核酸(尤其是表面rna)的量确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的包裹的核酸(尤其是包裹的rna)的量，特别是通过从结合的核酸(尤其是结合的rna)的量减去表面核酸(尤其是表面rna)的量。可以如上文所述确定或计算组合物中含有的结合和表面核酸(尤其是rna)的量。例如，可以如上文所述从组合物中含有的核酸(尤其是rna)的总量和组合物中含有的游离核酸(尤其是游离rna)的量确定或计算组合物中含有的结合的核酸(尤其是rna)的量(特别是通过从核酸(尤其是rna)的总量减去游离核酸(尤其是游离rna)的量，其中可以如上文所述确定或计算组合物中含有的结合的和游离核酸(尤其是rna)的量，例如，通过使用基于选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号的校准曲线，或者通过使用核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)的消光系数)。此外，可以如本文所述确定或计算组合物中含有的表面核酸(尤其是表面rna)的量，例如，从染料的光发射信号(例如，荧光染料的荧光信号，如添加至组合物的嵌入性染料(例如，gelred(5,5'-(6,22-二氧代-11,14,17-三氧杂-7,21-二氮杂二十七烷-1,27-二基)双(3,8-二氨基-6-苯基菲啶-5-鎓)碘化物)、gelgreen(10,10'-(6,22-二氧代-11,14,17-三氧杂-7,21-二氮杂二十七烷-1,27-二基)双(3,6-双(二甲基氨基)吖啶-10-鎓)碘化物)、小檗碱、乙锭(如溴化乙锭)、亚甲蓝或原黄素，优选gelred)，其中所述染料(尤其是特异性地)与结合/粘附至颗粒外表面的核酸(尤其是rna)结合。[0806]g.可接近的核酸的量(如可接近的rna的量)[0807]如上所述(参见，例如，图21)，如果样品或对照组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，则可接近的核酸(尤其是rna)是表面核酸(尤其是表面rna)和游离核酸(尤其是游离rna)的总和。或者，可以通过从核酸的总量(尤其是rna的总量)减去包裹的核酸(尤其是包裹的rna)的量来从核酸的总量(尤其是rna的总量)和包裹的核酸(尤其是包裹的rna)确定或计算可接近的核酸(尤其是rna)。[0808]因此，在一实施方案中，可以从组合物中含有的表面核酸(尤其是表面rna)的量和组合物中含有的游离核酸(尤其是游离rna)的量确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的可接近的核酸的量(尤其是可接近的rna的量)，特别是通过将表面核酸(尤其是表面rna)的量和表面核酸(尤其是表面rna)的量相加。在一可选实施方案中，可以从组合物中含有的核酸的总量(尤其是rna的总量)和组合物中含有的包裹的核酸(尤其是包裹的rna)确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的可接近的核酸的量(尤其是可接近的rna的量)，特别是通过从核酸的总量(尤其是rna的总量)减去包裹的核酸(尤其是包裹的rna)的量。可以分别如上文在b.、c.、e.和f.下所述确定或计算组合物中含有的核酸的总量(尤其是rna的总量)、组合物中含有的游离核酸(尤其是游离rna)的量、组合物中含有的表面核酸(尤其是表面rna)的量和组合物中含有的包裹的核酸(尤其是包裹的rna)。[0809]h.含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小、大小分布和定量大小分布[0810]如果样品或对照组合物包含核酸(尤其是rna)和颗粒，可以由通过使样品或对照组合物或者其至少部分进行场-流分级获得的一个或多个样品或对照级分的光散射(ls)信号确定或计算颗粒的大小和所述颗粒的分布。在一实施方案中，使用在多个角度测量的散射光强度，其中每个切片对应于描述洗脱颗粒散射的光的角度依赖性的曲线。通过用适当的形式(例如，berry图或zimm图或debye图)拟合曲线并外推至零角度，可以获得回转半径(rg)值和/或流体动力学半径(rh)值，由此可以确定或计算洗脱颗粒的大小。在另一实施方案中，可以利用基于不同颗粒大小标准品的保留时间的外部校准和回归分析，以便确定或计算洗脱颗粒的大小。在第三实施方案中，通过从洗脱颗粒的保留时间直接计算(即，无需校准)来确定洗脱颗粒的大小。如果分级通道的尺寸已知并且有恒定的交叉流，则可以凭经验从测量的空隙时间和保留时间的比例确定保留比。选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的信号(从这些信号中的任意一种可以如本文所述确定核酸(尤其是rna)的量，还可以确定含有核酸(尤其是rna)的颗粒的量)可以用于确定或计算颗粒大小分布和/或定量颗粒大小分布，其中选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号可以直接翻译为具有特定大小的颗粒的量。颗粒大小分布和/或定量颗粒大小分布可以作为颗粒的数量、颗粒的摩尔量或颗粒的质量，每个作为它们大小的函数给出。[0811]图11说明将样品组合物进行af4-uv-mals获得的分级图谱(图11a)中含有的数据转化为含有rna的颗粒的大小分布(图11c，实线)和定量大小分布(图11c，虚线)。利用berry图从颗粒峰的mals信号(洗脱时间：26-55min；参见图11a)确定回转半径(rg)值(在图11a和11b中显示为黑点)。通过将rg值拟合为多项式函数(参见图11b，浅灰色线)，基于多项式拟合重新计算rg值，并将重新计算的rg值作图为保留时间的函数来使实验确定的rg值平滑。将uv信号作图为重新计算的rg值的函数，从而创建大小分布曲线(图11c，实线)。将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对重新计算的rg值作图，得出定量大小分布曲线(图11c，虚线)。从定量大小分布曲线确定特征值(特别是d10、d50和d90)。[0812]因此，在一实施方案中，基于ls信号通过由其确定或计算回转半径(rg)值来确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小。优选地，确定或计算至少一个颗粒峰的rg值。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的rg值。[0813]在一实施方案中，使实验确定或计算的rg值平滑，例如，通过将实验确定或计算的rg值拟合为多项式函数(例如，f(t)＝a+b1x+b2x2+b3x3+b4x4)或线性函数(例如，f(t)＝a+a1x)并基于多项式或线性拟合重新计算rg值，并且任选地将重新计算的rg作图为保留时间的函数。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别对每个颗粒峰使实验确定或计算的rg值平滑(例如，如上文所述重新计算)。[0814]ls信号可以通过任何合适的检测器获得，并且优选是动态光散射(dls)和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。优选的mals信号是多角度激光散射(malls)信号。[0815]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)对(任选重新计算的)rg值作图来确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号对重新计算的rg值作图来确定或计算含有rna的颗粒的大小分布。含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布可以作为颗粒的数量、颗粒的摩尔量或颗粒的质量给出，每个作为它们大小的函数。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的大小分布。[0816]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)转化为累积重量分数并将累积重量分数对(任选重新计算的)rg值作图来从含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对重新计算的rg值作图来从含有rna的颗粒的大小分布确定或计算含有rna的颗粒的定量大小分布。含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布可以作为颗粒的数量、颗粒的摩尔量或颗粒的质量给出，每个作为它们大小的函数。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的定量大小分布。[0817]在一实施方案中，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布包括d10、d50、d90、d95、d99和/或d100值(特别是基于rg值)。在一实施方案中，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布包括d10、d50和/或d90值(特别是基于rg值)。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的d10、d50、d90、d95、d99和/或d100值(优选d10、d50和/或d90值)(特别是基于rg值)。[0818]图24说明将样品组合物进行af4-uv-mals获得的分级图谱(图23a)中含有的数据转化为不同类型的含有rna的颗粒的定量大小分布：(a)累积重量分数(图24b，实线)；(b)每颗粒级分的rna质量(δt＝1min)(图24c)；或(c)每颗粒级分的rna拷贝数或颗粒数量(δt＝1min)(图24d)。利用berry图从颗粒峰的mals信号(洗脱时间：24-55min；参见，图24a)确定回转半径(rg)值(在图24a中显示为粗线)。通过将rg值拟合为多项式函数，基于多项式拟合重新计算rg值，并将重新计算的rg值作图为保留时间的函数来使实验确定的rg值平滑。将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对重新计算的rg值作图，得出图24b中实线所示的定量大小分布曲线。在重新计算的rg值的基础上细分颗粒峰(δt＝1min)(从而产生31个rg级分)，从uv信号计算每个rg级分的rna质量，并将rna质量值对rg级分作图，导致特定的定量大小分布，显示每rg级分的rna质量；参见图24c。此外，将rna质量值转化为rna拷贝数并将后者对rg级分作图导致特定的定量大小分布，显示每rg级分的rna拷贝数；参见，图24d，条形。此外，将uv和mals信号转化为颗粒数量并将后者对rg级分作图导致特定的定量大小分布，显示每rg级分的颗粒数量；参见，图24d，点线曲线。对于上述计算和转化，可以使用以下方程和信息：[0819]·颗粒的体积：[0820]·作为rg函数的硬球体积：[0821]·一个拷贝的脂质复合物的体积：[0822]-使用的rna的长度：2000个核苷酸[0823]-总密度：1g/ml＝1g/cm3＝10-21g/nm3[0824]-每个核苷酸的摩尔质量(330da)：330g/mol[0825]-摩尔质量rna脂质复合物/核苷酸(核苷酸+dotma+1/2dope)：1370da[0826]-摩尔质量rna脂质复合物/拷贝：1370x2000＝2.74x106dag/mol[0827]-体积rna脂质复合物/拷贝：2.74x106x1021/6x1023＝4.6x103nm3[0828]因此，在一实施方案中，基于ls信号确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小，通过从ls信号确定或计算回转半径(rg)并将rg值细分为至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个)rg级分和/或最多100个(如最多90个、最多80个、最多70个、最多60个、最多50个、最多40个、最多30个或最多20个)rg级分，其中每个rg级分具有rg范围(其优选不与任何其他rg级分的rg范围重叠)。优选地，确定或计算至少一个颗粒峰的rg值和rg级分。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的rg值和rg级分。[0829]在一实施方案中，在将实验确定或计算的rg值细分为rg级分之前对其进行平滑处理，例如，通过将实验确定或计算的rg值拟合为多项式函数(例如，f(t)＝a+b1x+b2x2+b3x3+b4x4)或线性函数(例如，f(t)＝a+a1x)并基于多项式或线性拟合重新计算rg值，并且任选地将重新计算的rg作图为保留时间的函数。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别对每个颗粒峰使实验确定或计算的rg值平滑(例如，如上文所述重新计算)。[0830]ls信号可以通过任何合适的检测器获得，并且优选是动态光散射(dls)和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。优选的mals信号是多角度激光散射(malls)信号。[0831]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)对rg级分(通过细分(任选重新计算的)rg值获得)作图来确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号对通过细分重新计算的rg值获得的rg级分作图来确定或计算含有rna的颗粒的大小分布。含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布可以作为核酸质量(尤其是rna质量)、核酸拷贝数(尤其是rna拷贝数)或颗粒数量给出，每个作为rg级分的函数。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的大小分布。[0832]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)转化为累积重量分数并将累积重量分数对rg级分(通过细分(任选重新计算的)rg值获得)作图来从含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对rg级分(通过细分重新计算的rg值获得)作图来从含有rna的颗粒的大小分布确定或计算含有rna的颗粒的定量大小分布。含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布可以作为每rg级分的核酸质量(尤其是rna质量)、每rg级分的核酸拷贝数(尤其是rna拷贝数)或颗粒数量给出。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的定量大小分布。[0833]以上转化方法(参见，例如，图11和图24)已通过使用rg值进行说明。然而，在使用rh值时可以利用相同方法(图11或图24中未示出)。例如，通过将rh值拟合为多项式函数，基于多项式拟合重新计算rh值，并将重新计算的rh值作图为保留时间的函数来使实验确定的rh值平滑。任选地，将rh值细分为至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个)rh级分和/或多达100个(如多达90个、多达80个、多达70个、多达60个、多达50个、多达40个、多达30个或多达20个)rh级分，其中每个rh级分具有rh范围(其优选不与任何其他rh级分的rh范围重叠)。将uv信号作图为重新计算的rh值(或通过细分重新计算的rh值获得的rh级分)的函数，从而创建大小分布曲线(基于rh值或rh级分)。将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对重新计算的rh值作图，得出定量大小分布曲线。从定量大小分布曲线，可以确定基于rh值的特征值(特别是d10、d50和d90)。或者，将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对rh级分作图，得出可选的定量大小分布曲线。从可选的定量大小分布曲线，可以确定特征参数，特别是每rh级分的核酸质量(尤其是rna质量)、每rh级分的核酸拷贝数(尤其是rna拷贝数)或颗粒数量。[0834]因此，在一些实施方案中，特别是其中待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的那些实施方案，所述方法和/或用途可以包括测量从场-流分级获得的一个或多个样品级分中至少一个的动态光散射(dls)信号。可以以任何常规方式从dls信号确定或计算流体动力学半径，例如，通过使用stokes-einstein方程。优选地，确定或计算至少一个颗粒峰的rh值。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的rh值。[0835]任选地，将rh值细分为至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个)rh级分和/或多达100个(如多达90个、多达80个、多达70个、多达60个、多达50个、多达40个、多达30个或多达20个)rh级分，其中每个rh级分具有rh范围(其优选不与任何其他rh级分的rh范围重叠)。[0836]在一实施方案中，使实验确定或计算的rh值平滑(优选在将它们细分为rh级分之前)，例如，通过将实验确定或计算的rh值拟合为多项式函数(例如，f(t)＝a+b1x+b2x2+b3x3+b4x4)或线性函数(例如，f(t)＝a+a1x)并基于多项式或线性拟合重新计算rh值，并且任选地将重新计算的rh值作图为保留时间的函数。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别对每个颗粒峰使实验确定或计算的rh值平滑(例如，如上文所述重新计算)。[0837]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)对(任选重新计算的)rh值(或通过细分(任选重新计算的)rh值获得的rh级分)作图来确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号对重新计算的rh值(或通过细分重新计算的rh值获得的rh级分)作图来确定或计算含有rna的颗粒的大小分布。含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布可以作为颗粒的数量、颗粒的摩尔量或颗粒的质量给出，每个作为它们大小的函数(例如，作为rh值或通过细分重新计算的rh值获得的rh级分的函数)。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的大小分布。[0838]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)转化为累积重量分数并将累积重量分数对(任选重新计算的)rh值(或通过细分(任选重新计算的)rh值获得的rh级分)作图来从含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小分布确定或计算含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对重新计算的rh值(或通过细分重新计算的rh值获得的rh级分)作图来从含有rna的颗粒的大小分布确定或计算含有rna的颗粒的定量大小分布。含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布可以作为颗粒的数量、颗粒的摩尔量或颗粒的质量给出，每个作为它们大小的函数。或者，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布可以作为每rh级分的核酸质量(尤其是rna质量)、每rh级分的核酸拷贝数(尤其是rna拷贝数)或颗粒数量给出。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的定量大小分布。[0839]在一实施方案中，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布包括d10、d50、d90、d95、d99和/或d100值(基于rh值)。在一实施方案中，含有核酸(尤其是rna)的颗粒的定量大小分布包括d10、d50和/或d90值(基于rh值)。如果场-流分级导致多于一个颗粒峰，优选分别确定或计算每个颗粒峰的d10、d50、d90、d95、d99和/或d100值(优选d10、d50和/或d90值)(基于rh值)。[0840]在一些实施方案中，特别是其中待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的那些实施方案，基于如上文所述的含有核酸(如rna)的颗粒的rg值并分别基于如上文所述的含有核酸(如rna)的颗粒的rh值计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这些实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。[0841]在一些实施方案中，特别是其中待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括含有核酸(尤其是rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的那些实施方案，如上文所述将rg值细分为至少两个rg级分并如上文所述将rh值细分为至少两个rh级分，基于如上文所述的含有核酸(如rna)的颗粒的rg级分并分别基于如上文所述的含有核酸(如rna)的颗粒的rh级分计算含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这些实施方案产生含有核酸(如rna)的颗粒的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg级分，一个基于rh级分)。[0842]i.核酸(尤其是rna)的大小、大小分布和定量大小分布[0843]当核酸(尤其是rna)为游离形式(即，不结合或粘附至包含核酸(尤其是rna)和颗粒的样品或对照组合物中含有的颗粒)或未配制形式(即，在组合物中缺少如本文所述的颗粒，如缺少构成脂质体的组分(特别是阳离子两亲脂质和/或阳离子两亲聚合物)和/或病毒样颗粒)时，也可以确定或分析核酸(尤其是rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(特别地，基于核酸(尤其是rna)的回转半径(rg)和/或核酸(尤其是rna)的流体动力学半径(rh))。[0844]因此，在一实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途分析或确定的额外参数(特别是如果样品或对照组合物包含游离或未配制形式的核酸(尤其是rna))包括核酸(尤其是rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(特别地，基于核酸(尤其是rna)的rg和/或rh值或者核酸(尤其是rna)的rg和/或rh级分，在将核酸(尤其是rna)的rg和/或rh值细分为核酸(尤其是rna)的rg和/或rh级分之后)。一般来说，核酸(尤其是rna)的大小分布和/或定量大小分布可以作为核酸(尤其是rna)分子的数量、核酸(尤其是rna)的摩尔量或核酸(尤其是rna)的质量给出，每个作为它们大小的函数。或者，核酸(尤其是rna)的大小分布和/或定量大小分布可以作为每rg和/或rh级分的核酸质量(尤其是rna质量)或者每rg和/或rh级分的核酸拷贝数(尤其是rna拷贝数)给出。[0845]可以如上文对含有核酸(尤其是rna)的颗粒指定的那样确定或分析这些参数。[0846]例如，在一实施方案中，基于ls信号通过由其确定或计算回转半径(rg)值和/或流体动力学半径(rh)值来确定或计算核酸(尤其是rna)的大小。优选地，确定或计算至少一个核酸(尤其是rna)峰的rg(或rh)值。如果场-流分级导致多于一个核酸(尤其是rna)峰，优选分别确定或计算每个核酸(尤其是rna)峰的rg(或rh)值。[0847]任选地，将rg(或rh)值细分为至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个)rg(或rh)级分和/或多达100个(如多达90个、多达80个、多达70个、多达60个、多达50个、多达40个、多达30个或多达20个)rg(或rh)级分，其中每个rg(或rh)级分具有rg(或rh)范围(其优选不与任何其他rg(或rh)级分的rg(或rh)范围重叠)。[0848]在一实施方案中，使实验确定或计算的rg(或rh)值平滑(优选在将它们细分为rg(或rh)级分之前)，例如，通过将实验确定或计算的rg(或rh)值拟合为多项式函数(例如，f(t)＝a+b1x+b2x2+b3x3+b4x4)或线性函数(例如，f(t)＝a+a1x)并基于多项式或线性拟合重新计算rg(或rh)值，并且任选地将重新计算的rg(或rh)值作图为保留时间的函数来。如果场-流分级导致多于一个核酸(尤其是rna)峰，优选分别对每个核酸(尤其是rna)峰使实验确定或计算的rg(或rh)值平滑(例如，如上文所述重新计算)。[0849]ls信号可以通过任何合适的检测器获得，并且优选是动态光散射(dls)和/或静态光散射(sls)，例如，多角度光散射(mals)信号。优选的mals信号是多角度激光散射(malls)信号。[0850]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)对(任选重新计算的)rg(或rh)值(或通过细分(任选重新计算的)rg(或rh)值获得的rg(或rh)级分)作图来确定或计算核酸(尤其是rna)的大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号对重新计算的rg(或rh)值(或通过细分重新计算的rg(或rh)值获得的rg(或rh)级分)作图来确定或计算rna的大小分布。核酸(尤其是rna)的大小分布可以作为核酸(尤其是rna)分子的数量、核酸(尤其是rna)的摩尔量或颗粒的核酸(尤其是rna)给出，每个作为它们大小的函数。或者，核酸(尤其是rna)的大小分布可以作为每rg和/或rh级分的核酸质量(尤其是rna质量)或者每rg和/或rh级分的核酸拷贝数(尤其是rna拷贝数)给出。如果场-流分级导致多于一个核酸(尤其是rna)峰，优选分别确定或计算每个核酸(尤其是rna)峰的大小分布。[0851]在一实施方案中，通过将选自uv信号、荧光信号和ri信号的信号(优选uv信号)转化为累积重量分数并将累积重量分数对(任选重新计算的)rg(或rh)值(或通过细分(任选重新计算的)rg(或rh)值获得的rg(或rh)级分)作图来从核酸(尤其是rna)的大小分布确定或计算核酸(尤其是rna)的定量大小分布。因此，在一优选实施方案中，通过将uv信号转化为累积重量分数并将累积重量分数对重新计算的rg(或rh)值(或通过细分重新计算的rg(或rh)值获得的rg(或rh)级分)作图来从rna的大小分布确定或计算rna的定量大小分布。核酸(尤其是rna)的定量大小分布可以作为核酸(尤其是rna)分子的数量、核酸(尤其是rna)的摩尔量或颗粒的核酸(尤其是rna)给出，每个作为它们大小的函数。或者，核酸(尤其是rna)的定量大小分布可以作为每rg和/或rh级分的核酸质量(尤其是rna质量)或者每rg和/或rh级分的核酸拷贝数(尤其是rna拷贝数)给出。如果场-流分级导致多于一个核酸(尤其是rna)峰，优选分别确定或计算每个核酸(尤其是rna)峰的定量大小分布。[0852]在一实施方案中，核酸(尤其是rna)的定量大小分布包括d10、d50、d90、d95、d99和/或d100值(基于rg或rh值)。在一实施方案中，核酸(尤其是rna)的定量大小分布包括d10、d50和/或d90值(基于rg或rh值)。如果场-流分级导致多于一个核酸(尤其是rna)峰，优选分别确定或计算每个核酸(尤其是rna)峰的d10、d50、d90、d95、d99和/或d100值(优选d10、d50和/或d90值)(基于rg或rh值)。[0853]在一些实施方案中，特别是其中待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括核酸(尤其是rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的那些实施方案，基于如上文所述的核酸(如rna)的rg值并分别基于如上文所述的核酸(如rna)的rh值计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这些实施方案产生核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg值，一个基于rh值)。[0854]在一些实施方案中，特别是其中待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括核酸(尤其是rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的那些实施方案，如上文所述将rg值细分为至少两个rg级分并如上文所述将rh值细分为至少两个rh级分，基于如上文所述的核酸(如rna)的rg级分并分别基于如上文所述的核酸(如rna)的rh级分计算核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布(即，这些实施方案产生核酸(如rna)的大小、大小分布和/或定量大小分布的两个数据集，一个基于rg级分，一个基于rh级分)。[0855]j.形状因子/形式因子[0856]对于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的一些应用，如治疗或预防应用，所述颗粒应当是某种形状(例如，球样形状)。提供颗粒形状信息的参数是形状因子和形式因子(参见，例如，图13)。[0857]因此，在一些实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括形状因子和/或形式因子。可以基于rg值(如重新计算的rg值)和流体动力学半径(rh)值来确定或计算形状和形式因子，优选如上文h.至j.节中任一个中确定或计算的那样。例如，可以通过将如上文确定或计算的rg值(如重新计算的rg值)对如上文确定或计算的流体动力学(rh)值作图并将这个图的数据点拟合为函数(例如线性函数)来确定或计算形状因子。例如，线性回归的约0.774(如0.74)的斜率指示所分析的颗粒的球形形式。线性回归的约0.816的斜率指示所分析的颗粒的螺旋形形式，而线性回归的约1.732的斜率指示所分析的颗粒的棒形形式。参见，例如，w.burchard(1990)"laserlightscatteringinbiochemistry"。相似地，可以通过将如上文确定或计算的流体动力学半径(rh)值对如上文确定或计算的rg值(如重新计算的rg值)作图并将这个图的数据点拟合为函数(例如线性函数)来确定或计算形式因子。[0858]k.核酸(尤其是rna)包裹效率[0859]对于含有核酸(尤其是rna)的颗粒的一些应用，如治疗或预防应用，有必要知道将核酸(尤其是rna)包裹至颗粒中的效率如何。[0860]因此，在一些实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括核酸(尤其是rna)包裹效率。可以基于(i)包含核酸和颗粒的样品或对照组合物中含有的包裹的核酸(尤其是rna)的量以及(ii)所述样品或对照组合物中含有的核酸(尤其是rna)的总量来确定或计算核酸(尤其是rna)包裹效率，其中优选如b.和f.节中指定的那样确定或计算核酸(尤其是rna)的总量和包裹的核酸(尤其是rna)的量。在一实施方案中，通过将包裹的核酸(尤其是rna)的量除以核酸(尤其是rna)的总量来确定或计算核酸(尤其是rna)包裹效率。[0861]l.核酸(尤其是rna)的分子量[0862]可以从ls数据确定或计算核酸(尤其是rna)的分子量并与其理论计算的分子量进行比较。可以基于核酸(尤其是rna)序列以及共价或非共价连接至核酸的任选存在的额外物质(例如，一种或多种染料、帽结构等)来确定或计算核酸(尤其是rna)的理论分子量。[0863]因此，在一些实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括核酸(尤其是rna)的分子量。在这些实施方案中，本公开的方法和/或用途包括测量获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号的步骤，其中可以基于ls信号确定或计算核酸(尤其是rna)的分子量。任选地，将基于ls信号确定或计算的核酸(尤其是rna)的分子量与核酸(尤其是rna)的理论分子量进行比较，其中核酸(尤其是rna)的理论分子量是如本文所述确定或计算的或者是技术人员已知的(例如，基于核酸(尤其是rna)序列以及共价或非共价连接至核酸(尤其是rna)的任选存在的额外物质(例如，一种或多种染料、帽结构等)来计算或确定)。[0864]m.与颗粒结合的核酸(如rna)的量与颗粒形成化合物的总量的比例[0865]在一些实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括与颗粒结合的核酸(如rna)的量与颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出。[0866]可以如上文所述确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的结合的核酸(尤其是rna)的量，例如，从组合物中含有的核酸(尤其是rna)的总量和组合物中含有的游离核酸(尤其是游离rna)的量，特别是通过从核酸(尤其是rna)的总量减去游离核酸(尤其是游离rna)的量。可以如上文所述确定或计算组合物中含有的结合的和游离核酸(尤其是rna)的量，例如，通过使用基于选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号的校准曲线，或者通过使用核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)的消光系数。可以由用来制备颗粒的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的量确定或计算颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量。或者，可以通过技术人员已知的方法和/或技术确定颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的量，例如，基于hplc的那些(参见，例如，rocesetal.,pharmaceutics.8,29(2016))。可以通过将确定或计算的与颗粒结合的核酸(如rna)的量除以确定或计算的颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量来确定或计算与颗粒结合的核酸(如rna)的量与颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例。[0867]在其中与颗粒结合的核酸(如rna)的量与颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的总量的比例作为颗粒大小的函数给出的上述实施方案中，本公开的方法和/或用途优选包括测量通过使样品或对照组合物或者其至少部分进行场-流分级获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号的步骤。基于ls信号，可以获得rg值和/或rh值(优选如上文所述)，由此可以确定或计算洗脱颗粒的大小(如上文所述)。[0868]n.颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例[0869]在一些实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例，其中所述比例可以作为颗粒大小的函数给出。[0870]可以由用来制备颗粒的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的量和所述颗粒形成化合物的化学组成(例如，由颗粒形成化合物中含有的带电荷部分的数量)确定或计算颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量。或者，可以通过技术人员已知的方法和/或技术确定颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的量，例如，基于hplc的那些(参见，例如，rocesetal.,pharmaceutics.8,29(2016))。可以如上文所述确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的结合的核酸(尤其是rna)的量，例如，从组合物中含有的核酸(尤其是rna)的总量和组合物中含有的游离核酸(尤其是游离rna)的量，特别是通过从核酸(尤其是rna)的总量减去游离核酸(尤其是游离rna)的量。可以如上文所述确定或计算组合物中含有的结合的和游离核酸(尤其是rna)的量，例如，通过使用基于选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号的校准曲线，或者通过使用核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)的消光系数。可以通过将确定或计算的颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量除以确定或计算的与颗粒结合的核酸(如rna)的量来确定或计算颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例。[0871]在其中颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的量的比例作为颗粒大小的函数给出的上述实施方案中，本公开的方法和/或用途优选包括测量通过使样品或对照组合物或者其至少部分进行场-流分级获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号的步骤。基于ls信号，可以获得rg值和/或rh值(优选如上文所述)，由此可以确定或计算洗脱颗粒的大小(如上文所述)。[0872]o.颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比[0873]在一些实施方案中，待通过本公开的方法和/或用途确定或分析的一个或多个参数包括颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比。所述电荷比通常表示为n/p比，并且可以作为颗粒大小的函数给出。[0874]可以由用来制备颗粒的颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的量和所述颗粒形成化合物的化学组成(例如，由颗粒形成化合物中含有的带电荷部分的数量)确定或计算颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量。或者，可以通过技术人员已知的方法和/或技术确定颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的量，例如，基于hplc的那些(参见，例如，rocesetal.,pharmaceutics.8,29(2016))。可以由与颗粒结合的核酸(如rna)的量和所述核酸(如rna)的化学组成，例如核酸中含有的带负电荷部分(例如，磷酸基团)的数量，确定或计算与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量。可以如上文所述确定或计算包含核酸(尤其是rna)和颗粒的本公开的样品或对照组合物中含有的结合的核酸(尤其是rna)的量，例如，从组合物中含有的核酸(尤其是rna)的总量和组合物中含有的游离核酸(尤其是游离rna)的量，特别是通过从核酸(尤其是rna)的总量减去游离核酸(尤其是游离rna)的量。可以如上文所述确定或计算组合物中含有的结合的和游离核酸(尤其是rna)的量，例如，通过使用基于选自uv信号、荧光信号和折射率(ri)信号的至少一种信号的校准曲线，或者通过使用核酸(尤其是rna)在uv范围内(例如，在260nm或280nm)的消光系数。可以通过将确定或计算的颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量除以确定或计算的与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量来确定或计算颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比。[0875]在其中颗粒中颗粒形成化合物(特别是脂质和/或聚合物)的带正电荷部分的量比与颗粒结合的核酸(如rna)的带负电荷部分的量的电荷比作为颗粒大小的函数给出的上述实施方案中，本公开的方法和/或用途优选包括测量通过使样品或对照组合物或者其至少部分进行场-流分级获得的一个或多个样品级分中至少一个的ls信号的步骤。基于ls信号，可以获得rg值和/或rh值(优选如上文所述)，由此可以确定或计算洗脱颗粒的大小(如上文所述)。[0876]场-流分级[0877]场-流分级是一种色谱技术，其使用非常薄的流，对其施加垂直力场并实现高分辨率分离。场-流分级的实例包括非对称流场-流分级(af4)和中空纤维流场-流分级(hf5)，例如由wyatt销售并且例如在wo2018/165627中描述的eclipsetm系统(dualtectm或af4tm)，其全部公开内容援引加入本文。因此，在一实施方案中，本公开的方法和/或用途中使用的场-流分级是流场-流分级，如非对称流场-流分级(af4)或中空纤维流场-流分级(hf5)。[0878]通常，非对称流场-流分级系统(如af4系统)包括由两个板组成的一个通道，这两个板由间隔箔(其通常具有100-500μm的厚度)隔开，并且其中发生流动和分离。上板是不可渗透的，而底板是可渗透的(例如，由多孔熔块材料制成)。此外，底板覆盖有具有适合防止核酸(尤其是rna)和较大分析物(如本文公开的颗粒)渗透膜的截留分子量(mw)的膜。在一实施方案中，所述膜具有在2kda-30kda范围内的截留mw，例如，在3kda-25kda(如4kda-20kda、5kda-15kda或5kda-12kda)范围内的截留mw，如10kda的截留mw。可以使用任何适用于以上目的的膜。在一实施方案中，所述膜是聚醚砜(pes)膜、再生纤维素膜或聚偏氟乙烯(pvdf)膜(这样的任何一种已知的具有上文指定的截留mw的超滤膜)。[0879]通常，非对称流场-流分级系统(如af4系统)包括位于通道一端的入口端口、位于通道另一端的出口端口以及位于入口和出口端口之间的注入端口，优选靠近入口端口。[0880]由于液相的层流，在流动通道内产生抛物线流动剖面：液相在靠近边界边缘处比在通道流中心处移动得慢。当向层流施加垂直力场时，液相的组分(包括待分离的分析物，特别是核酸(尤其是rna)和颗粒(如果存在))被趋向通道的边界层，优选在膜侧。与布朗运动相关的扩散产生抵消运动。因此，具有较高扩散速度的较小分析物倾向于在通道中较高的位置达到平衡位置，在那里纵向流动较快。因此，通道内的速度梯度流动能够分离不同大小的分析物。因为较小的分析物比较大的颗粒沿通道传输更快，所以较小的分析物在较大的分析物之前洗脱，这与例如其中大分析物首先洗脱的大小排阻色谱(sec)正交。[0881]上文描述的关于非对称流场-流分级系统(如af4系统)的原理也适用于hf5系统，除了hf5系统不含上板，而是包含下板以及已卷成管状的膜。这种配置可以使用非常小的通道体积，导致高灵敏度和非常快的运行时间。[0882]因为场-流分级不依赖于待分离的分析物与固定相的相互作用，并且不需要填充有所述固定相的相应柱，所以不需要高压来移动液相通过通道，从而避免(除其他外)高剪切力。实际上，场-流分级是温和、快速和无损的。[0883]一般来说，场-流分级包括两个步骤：注入和洗脱/分级。任选地，在注入步骤之后和洗脱/分级步骤之前，场-流分级可以包括集中步骤。优选地，在场-流分级包括集中步骤的情况下，在前两个步骤期间，将液相分流，从两端(入口端口和出口端口)进入通道并且优选平衡以在注入端口下相遇(例如，通过入口和出口端口的流(即，以这样的方式相互适应，使得通过注入端口注入的分析物不会向入口端口或出口端口移动(优选不会洗脱)，而是会集中)。在前两个步骤期间，液相将仅渗透通过膜。当注入样品或对照组合物或者其至少部分(优选通过注入端口)时，所述样品或对照组合物或者其至少部分中含有的分析物任选地集中在带中(优选尽可能薄)，并且优选向膜集中。在完成样品注入之后，停止注入流。任选地，所述集中持续一段时间(例如，约0.5至约2min，如约1min)。然后，将流动转换为洗脱/分级模式，其中液相仅从入口端口进入并在连接至一个或多个检测器(例如，uv检测器(例如，能够(优选同时)监测uv和cd信号的uv检测器)、荧光检测器、折射率检测器、一个或多个ls检测器(如mals检测器和/或dls)检测器，和/或粘度计)的出口端口离开。分析物根据大小(或流体动力学移动性)洗脱分离，并且通过一个或多个检测器(例如，不同检测器的阵列)检测和/或监测。这种检测和/或监测优选在线进行，即，立即进行，这避免需要储存从场-流分级获得的级分。但是，在一实施方案中，在线检测和/或监测已完成之后收集至少一个级分，以便允许所述至少一个级分的离线分析。在一实施方案中，所述一个或多个参数的计算或确定在线进行。[0884]因此，在一些实施方案中，如本文所用的表述“使样品组合物的至少部分进行场-流分级”优选包括以下步骤：将样品组合物的至少部分注入场-流分级装置；任选地在场-流分级装置内将所述样品组合物的至少部分中含有的组分(特别是核酸(尤其是rna)和颗粒(如果存在))集中；以及根据它们的大小或流体动力学移动性对所述组分(特别是核酸(尤其是rna)和颗粒(如果存在))进行分级。相似地，在一些实施方案中，如本文所用的表述“使对照组合物的至少部分进行场-流分级”优选包括以下步骤：将对照组合物的至少部分注入场-流分级装置；任选地在场-流分级装置内将所述样品组合物的至少部分中含有的组分(特别是核酸(尤其是rna)和颗粒(如果存在))集中；以及根据它们的大小或流体动力学移动性对所述组分(特别是核酸(尤其是rna)和颗粒(如果存在))进行分级。不管进行场-流分级的组合物的类型(即，样品组合物、对照组合物、两者中任一种的至少部分等)，分级步骤产生至少一个级分，但也可能产生至少两个(如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个)级分和/或多达100个(如多达90个、多达80个、多达70个、多达60个、多达50个、多达40个、多达30个或多达20个)级分。级分中的每个可以代表(1)一定大小(如直径在约10至约400nm或20至300nm范围内的核酸(尤其是rna))或某种类型(例如，游离核酸(尤其是游离rna)或结合的核酸(尤其是结合的rna))的核酸(尤其是rna)或者(2)一定大小(如直径在约200至1200nm范围内的含有核酸(尤其是rna)的颗粒)或某种类型(例如，含有脂质复合物颗粒的核酸(尤其是rna)或含有核酸(尤其是rna)的病毒样颗粒)的含有核酸(尤其是rna)的颗粒。[0885]一般来说，场-流分级中使用的交叉流速(如用于非对称流场-流分级系统(如af4系统)或中空纤维系统(如hf5系统)可以高达约10ml/min。在一实施方案中，本公开的方法和/或用途中使用的场-流分级使用高达8ml/min，优选高达4ml/min，更优选高达2ml/min的交叉流速进行。在一优选实施方案中，本公开的方法和/或用途中使用的场-流分级使用交叉流谱进行，即，交叉流速并非在场-流分级的所有阶段(注入、任选地集中和洗脱/分级)期间恒定，而是因阶段而异。例如，优选在注入阶段和集中阶段(如果存在)，交叉流是恒定的，并且优选是在如本文公开的核酸(尤其是rna)和颗粒(如果存在)未洗脱的速度下。可以基于本公开的教导来确定适合这个目的的交叉流速。[0886]在一实施方案中，所述交叉流速谱优选含有分级阶段，其允许对照或样品组合物中含有的组分通过它们的大小分级/分离以产生一个或多个样品级分。优选交叉流速在这个分级阶段期间发生变化(例如，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，或者从一个值(如约0至约0.1ml/min)开始然后增加至较高的值(如约1至约4ml/min))，其中可以通过任何方式变化，例如，连续(如线性或指数)变化或逐步变化。优选地，交叉流速谱含有分级阶段，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)。分级阶段可以具有适合将样品组合物中含有的组分按其大小分级/分离的任何长度，例如，约5min至约60min，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min。交叉流速谱可以含有附加阶段(例如，1、2、3或4个阶段)，其可以在分级阶段之前和/或之后(例如，分级之前1个并且分级之后1、2或3个)，并且可以用来将样品组合物中含有的非核酸(尤其是非rna)组分(例如，蛋白、多肽、单核苷酸等)与样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)分开，以集中样品组合物中含有的核酸(尤其是rna)和/或再生场-流分级装置(例如，去除与装置的膜结合的所有组分)。优选地，这些附加阶段的交叉流速对于每个附加阶段是恒定的，并且附加阶段中的每一个的长度对于附加阶段中的每一个而言独立地在约5min至约60min的范围内(如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)。例如，交叉流速谱可以含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速相同(第一附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且与第二附加阶段的那个不同(第三附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约10min或约20min或约30min)。在其中交叉流速谱含有分级阶段的实施方案中，其中交叉流速连续地(优选呈指数地)变化，从一个值(如约1至约4ml/min)开始然后降低至较低的值(如约0至约0.1ml/min)，优选交叉流速谱进一步含有(i)在分级阶段之前的第一附加阶段，其中所述第一附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段开始时的交叉低速相同(如约1至约4ml/min)(第一附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)；(ii)在分级阶段之后的第二附加阶段，其中所述第二附加阶段的交叉流速是恒定的并且与分级阶段结束时的交叉低速相同(如约0.01至0.1ml/min)(第二附加阶段的长度可以在约5min至约60min的范围内，如约10min至约50min、约15min至约45min、约20min至约40min或约25min至约35min，或者约30min)；以及任选存在的(iii)在第二附加阶段之后的第三附加阶段，其中所述第三附加阶段的交叉流速是恒定的并且低于第二附加阶段的那个(例如，所述第三附加阶段的交叉流速是0)(第三附加阶段的长度可以在约5min至约30min的范围内，如约6min至约25min、约7min至约20min或约8min至约15min或约10min至约12min，或者约5min或约10min或约12min)。这样的交叉流速谱的优选实例如下：1.0-2.0ml/min持续10min，在30min内从1.0-2.0ml/min至0.01-0.07ml/min的指数梯度；0.01-0.07ml/min持续30min；以及0ml/min持续10min。[0887]因此，在一实施方案中，注入阶段和集中阶段(如果存在)期间的交叉流速是恒定的，并且在一段时间内(例如，5-15min)在至少约1.0(如约1.3至约3.0ml/min、约1.5至约2.5ml/min或约1.8至约2.0ml/min)的范围内。此外，在一实施方案中，洗脱/分级阶段的交叉流在一段时间(如20-40min)内逐渐降低至极低速度(例如，0.01-0.07ml/min)。任选地，在交叉流达到极低速度之后，这个速度保持一段时间(如20-40min，例如，用来将交叉流速降低至极低速度的相同时间)和/或将交叉流设置为0ml/min一段时间(如5-20min)。注入、集中和洗脱/分级阶段的完整循环的示例性交叉流谱如下：1.0-2.0ml/min持续10min，在30min内从1.0-2.0ml/min至0.01-0.07ml/min的指数梯度；0.01-0.07ml/min持续30min；以及0ml/min持续10min。本公开中使用的交叉流谱的特定实例在图1中示出。[0888]在一实施方案中，本公开的方法和/或用途中使用的场-流分级使用在0.05-0.35ml/min的范围内，优选在0.10-0.30ml/min的范围内，更优选在0.15-0.25ml/min的范围内的注入流速进行。[0889]在一实施方案中，本公开的方法和/或用途中使用的场-流分级使用在0.30-0.70ml/min的范围内，优选在0.40-0.60ml/min的范围内，更优选在0.45-0.55ml/min的范围内的检测器流速进行。在一实施方案中，检测器流速在场-流分级的所有阶段(注入、集中和洗脱/分级)都是恒定的。[0890]场-流分级中使用的用于注入流的液相可以是与场-流分级系统相容并适合溶解核酸(尤其是rna)的任何液体。优选液体是水性液体，例如，主要由水组成的液体(即，液体的水含量大于50％(v/v)或(w/w)(如大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或大于95％(v/v)或(w/w))。液相可以含有缓冲剂、盐和/或额外的赋形剂(如螯合剂)。[0891]在一实施方案中，本公开的方法和/或用途中使用的场-流分级使用能够(优选同时)监测uv和cd信号的uv检测器进行。[0892]如果待通过本公开的方法和/或用途分析的参数之一是核酸(尤其是rna)的总量，优选场-流分级中使用的液相含有释放剂，其能够从颗粒释放与颗粒结合的核酸(尤其是rna)(从而将结合的核酸(尤其是结合的rna)的量减少至零并将游离核酸(尤其是游离rna)的量增加至其最大值。相反，如果待通过本公开的方法和/或用途分析的参数之一是游离核酸(尤其是游离rna)的量，则优选场-流分级中使用的液相不含释放剂。[0893]在一实施方案中，在使样品或对照组合物的至少部分进行场-流分级之前，将样品或对照组合物的至少部分例如用液相或者用溶剂或溶剂混合物稀释，所述溶剂或溶剂混合物能够防止颗粒聚集体的形成。在一实施方案中，所述溶剂混合物是水和有机溶剂如甲酰胺的混合物。实施例[0894]缩写[0895]在整个说明书中使用以下缩写：[0896]ivtrnaꢀꢀꢀ体外转录的rna[0897]sarnaꢀꢀꢀꢀ自我扩增rna[0898]npꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ纳米颗粒(lpx、lnp、plx、vlp)[0899]lnpꢀꢀꢀꢀꢀꢀ脂质纳米颗粒[0900]lpxꢀꢀꢀꢀꢀꢀ脂质复合物颗粒[0901]plxꢀꢀꢀꢀꢀꢀpolyplex颗粒[0902]vlpꢀꢀꢀꢀꢀꢀ病毒样颗粒[0903]rgꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ回转半径[0904]rhꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ流体动力学半径[0905]mwꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ分子量[0906]仪器[0907]使用用于水性溶液的af4(wyatt)以及相应软件进行场-流分级。分级中使用的膜是pes膜(wyatttechnologyeurope,dernbachgermany)，截留为10kda。具有在线真空脱气机的agilent1260系列四元泵递送载体流，agilent1260系列自动进样器将样品或对照组合物(对应于4μg注入的rna)提交至熔块-入口通道。通过使用agilent1260多波长检测器(260-280nmmwd；agilenttechnologies,waldbronn,germany)以及用波长660nm和功率60％的激光的多角度光散射(mals)检测器(dawnheleosii,wyatttechnologycorp.santabarbara,ca,usa)检测分析物(即，rna和颗粒)。将16号mals检测器通过玻璃纤维连接至qels(dynapronanostar,wyatttechnologycor.santabarbara,ca,usa)。[0908]材料[0909]方法[0910]af4分级方法[0911]注入流、检测器流和交叉流的液相是5mmnacl、10mmhepes、0.1mmedta，ph7.4，在水中。通过洗脱注入程序进行分离，注入流速vi为0.2ml/min，检测器流速vd为0.5ml/min，并且交叉流速vx为1.5ml/min，持续10min，随后vx梯度在30min内从1.5ml/min呈指数下降至0.04ml/min，使用斜率3.5。此后，vx在30min内保持恒定在0.04ml/min，随后是10min的零交叉流(参见图1)。[0912]通过使用多角度光散射(mals)检测器(dawnheleosii,wyatttechnologycorp.santabarbara,ca,usa)在多个波长(260-280nm)检测洗脱的分析物，用波长660nm的激光和60％的激光功率。将16号mals检测器通过玻璃纤维连接至qels(dynapronanostar,wyatttechnologycor.santabarbara,ca,usa)。对于cd实验，使用检测器cd-4095(jasco)。[0913]由astra软件版本7.1.3.25(wyatttechnologyeurope,dernbachgermany)使用berry图通过对在散射检测器获得的数据进行一阶拟合来计算大小分布。af4mals大小结果作为回转半径(rg)值给出，并且在颗粒峰面积上确定。耦合的dls同时提供流体动力学半径(rh)。uv信号用于样品或对照组合物中未结合的(即，游离)rna的直接定量分析，并且在使用释放剂(去污剂)溶解颗粒后确定样品或对照组合物中rna的总量。通过将uv信号(例如，在260nm或280nm)对从mals信号获得的rg值作图获得的图提供关于样品或对照组合物中含有的颗粒的大小分布的信息，并且相应的累积重量分数分析(通过将uv信号转化为累积重量分数获得)提供关于样品或对照组合物中含有的颗粒的定量大小分布的信息。[0914]rna完整性的确定[0915]用大量不同的热处理(降解)的rna样本(从986nt至10000nt)进行rna完整性的确定。用af4分级方法(见上文)分离rna(每次运行注入量4μg)，并且在260nm处在线检测rna。分离并分析在相同缓冲液中包含未处理(未降解)的rna的对照组合物，与处理的rna样品组合物进行比较。将rna样品组合物用甲酰胺(60％(v/v))稀释并在临测量之前在60℃下孵育5min。可以在没有甲酰胺的情况下分析形成更高分子结构的倾向低的rna。为了计算rna完整性，首先分析rna对照组合物。确定最大峰高度的洗脱时间，并且计算从最大峰高度至运行结束(基线)的峰面积，从而获得a50％(对照)(参见图2a)。第二，计算总峰面积，从而获得a100％(对照)(参见图2b)。第三，确定比例(半峰面积/总峰面积＝a50％(对照)/a100％(对照))并设置为100％，从而获得对照rna的完整性(i(对照))。第四，通过计算从先前确定的洗脱时间点(对照rna)至运行结束的峰面积来分析处理的rna样品组合物之一，从而获得a50％(样品)(参见图2c)。第五，计算总峰面积，从而获得a100％(样品)(参见图2d)。第六，计算a50％(样品)和a100％(样品)之间的比例，从而获得i(样品)，并且通过将i(样品)归一化至i(对照)来确定处理的rna样品的百分比完整性，从而获得样品组合物中含有的rna的完整性。[0916]rna量的确定[0917]为了从af4分级图谱确定rna量，使包含确定量(4μg)的rna(0.5mg/ml)的对照组合物进行af4分级方法(见上文)，并且检测在260nm或280nm处的uv信号。确定uv峰面积并用来根据以下等式利用lambert-beer定律直接从峰面积计算rna浓度：[0918][0919]其中c是核酸(尤其是rna)浓度(以mg/ml计)；a是uv峰面积(以aumin计)；f是场-流分级中使用的流速(以ml/min计)；ε是核酸的特定消光系数(例如，对于单链rna为0.025(mg/ml)-1cm-1)；d是细胞长度(以cm计)；v是样品或对照组合物或者其部分的注入体积。[0920]分析盐处理对rna的影响[0921]使用af4分级方法(见上文)并通过确定rna的几个特征(rg、rh、mw)系统地研究了不同氯化钠浓度对不同rna(ivt-rna和sarna)的影响。将不同rna用不同氯化钠浓度(例如，0-50mm)预孵育并进行af4分级方法，其中每次运行注入的rna量为30-100μg，并且af4分级方法使用相应的有不同的nacl浓度(0-50mmnacl)的液相。在mals信号的基础上使用zimm图确定用不同nacl浓度处理的每种rna的rg值并作图为nacl浓度的函数。如下文所述，使用在260nm或280nm处的uv信号通过累积重量分数分析计算用不同nacl浓度处理的每种rna组合物的rg(d50)和rg(d90)值。[0922]分析包含不同颗粒(lpx、lnp或vlp)的rna组合物[0923]对于一组广泛的不同np(lpx、lnp、vlp)的表征(例如大小分布的确定)，应用af4分级方法(见上文)。将每种np的注入量调整为总rna量(lpx和lnp4μg；vlp：20μg)。通过以下实现颗粒的在线检测：(i)将af4系统直接连接至uv-检测器(mwdagilent)和mals检测器(heleosii,wyatttechnology；用于确定rg值)，以及(ii)通过玻璃纤维将dls外部连接至mals检测器(16号)的一个角用于同时确定rh值。对于一些样品，还使用ri检测器(optilabt-rex,wyatt)同时检测ri信号。[0924]分析包含两种不同颗粒(vlp和lpx)的rna组合物[0925]制备包含短rna(40bp；用作佐剂以增强基于蛋白的疫苗的免疫应答)和f12脂质体(dotma/dope2/1)的脂质复合物颗粒，其具有脂质/rna比例为1.3/2的过量(access)rna。在第二步中将所得的短rna脂质复合物颗粒与vlp样品组合物以1/1的lpx/vlp比例混合，并且将4μg总rna进行af4分级方法(见上文)以确定所述短rna-lpxvlp样品组合物中含有的颗粒的大小分布。[0926]不同rna-np的定量大小分布(例如d90)[0927]为了分析基于rna-脂质的颗粒(lpx或lnp)，将4μg总rna进行af4分级方法(见上文)，而为了分析基于rna-聚合物的纳米颗粒，将10μg总rna进行af4分级方法。通过将af4系统直接连接至uv-检测器(mwdagilent)和mals检测器(heleosii,wyatttechnology；用于确定rg值)来实现颗粒的在线检测。为了同时确定rh值，通过玻璃纤维将dls外部连接至mals。为了提供关于rna(游离和结合)的额外信息，在260nm或280nm处的在线uv检测也应用于af4-mals-dls。对于定量大小分布，将实验获得的rg值直接对颗粒峰级分的uv信号作图。例如，较大颗粒的rg值可以作图为保留时间的函数，数据点可以拟合至多项式方程(例如，f(t)＝a+b1x+b2x2+b3x3+b4x4)或线性方程(例如，f(t)＝a+a1x)，并且可以基于多项式或线性拟合重新计算rg值。在下一步中，将颗粒级分的uv信号作图为重新计算的rg值的函数。uv信号与结合至相应颗粒级分的rna量成正比，并且相当于重量分数。在最后一步中，将记录的uv信号以及相应的累积重量分数分析值(包括(d10、d50和d90值))作图为rg值的函数。uv信号轨迹与颗粒大小(rg值)的图直接提供关于颗粒量的定量信息。[0928]未结合的rna(游离rna)的量的确定[0929]为了确定rna-lpx中的未结合的rna(游离rna)，如上文所述将lpx颗粒中4μg总rna进行af4分级方法(参见，例如，图1)。未结合的/游离rna的量优选需要使用在260nm或280nm处的uv-吸收将未结合的/游离rna与颗粒(例如，lpx)进行基线分离。为了确定未结合的/游离rna，可以应用两种方法：[0930]1)使用校准曲线的方法：通过将未结合的/游离rna的uv峰面积与对照rna的uv峰面积(校准曲线)相关联来确定rna-lpx颗粒中未结合的/游离rna的的相对量(％)。[0931]2)直接方法：可以如上文所述使用lambert-beer定律和rna消光系数将uv吸收直接转化为浓度。[0932]还可以使用af4分级方法确定或计算在不同的脂质与rna比例(“np比例”)下未结合的/游离rna的定量。通过将脂质混合物(dotma/dope2/1)与rna以不同电荷比(0.1-0.9)混合(没有或有nacl(100mm))来制备样品组合物，其中rna浓度保持恒定并且脂质的量变化。为了确定这些样品组合物中的未结合的/游离rna，将40μl形成的纳米颗粒(4μg总rna)进行af4分级方法。根据上文描述的方法进行分析。[0933]rna-lpx样品组合物中rna含量的总量的确定[0934]在使用af4分级方法定量确定rna的总量之前，必须通过添加释放剂(例如0.5％sds或0.1％zwittergent(zw))来破坏纳米颗粒，以从颗粒释放rna。如上文所述将40μl样品组合物(4μg总rna)进行af4分级方法，变化是液相含有释放剂(例如，0.05％(w/v)sds)以防止在分离过程中重新形成纳米颗粒。使用lambert-beer定律和rna消光系数，可以将测量的曲线下uv-峰面积直接转化为rna浓度(并由此转化为样品组合物中含有的rna的总量)。此外，可以通过mals信号监测np破坏的完成度。[0935]实施例1-使用af4分级方法确定rna[0936]通过使用uv检测器和ri检测器的af4分级方法(af4-uv-ri)分析不同注入体积的rna储备溶液。将曲线下的峰面积(uv实线；ri虚线)对注入体积作图，并且拟合线性回归(参见图3a)。通过af4-uv-ri用相同注入体积测量rna的连续稀释，并且如前所述进行分析(参见图3b)。[0937]图3a和b中示出的数据证明信号(ri和uv)与rna量之间的直接线性相关性。因此，这些数据证明直接确定rna(即，不使用校准曲线)是可行的。此外，无需样品稀释(与通过测量比色皿中rna溶液的uv信号来确定rna量相比)。因此，可以使用宽浓度范围的样品rna组合物(可以调整注入体积)。af4分级方法的其他优点如下：[0938]-低标准差(《2％)；[0939]-低盐效应(因为在af4分级过程中“洗涤”样品)；[0940]-可以分析和确定rna消光系数的变化。[0941]实施例2-rna完整性的确定[0942]对rna进行热处理(98℃持续2min、4min或10min)以不同程度地降解rna。通过af4分级方法(af4-uv-ri)分析包含未处理的rna、处理的rna(在98℃下2min、4min或10min)或者确定的热降解和未处理的rna混合物的样品组合物，不使用标准品。不同样品组合物(n＝3)的代表性af4分级图谱在图4a中示出。从这些分级图谱，应用lambert-beer定律将曲线下的平均面积直接转化为rna浓度，并且将所得的浓度作图为rna降解时间的函数(参见图4b)。[0943]从图4b可以看到，不同程度的rna降解(在0-50％降解的范围内)对使用af4分级方法的rna定量影响较小(《2％)。相比之下，其他定量方法(琼脂糖凝胶、片段分析仪)表现出信号强度与降解的强依赖性。[0944]实施例3-复杂混合物的分离[0945]制备样品颗粒组合物(含有摩尔比为1.3/2的脂质和rna)并进行本文公开的af4方法，其中检测uv和光散射(ls)信号。从af4方法获得的代表性分级图谱在图5中示出，其中实线代表在90°角的ls信号并指示颗粒峰(t＝～35min)，而虚线代表uv信号(在260nm处记录)并反映结合(t＝～38min)和未结合的rna(t＝～20min)。[0946]图5证明af4方法能够分离组分(游离rna和lpx颗粒)的复杂混合物，其中所述组分作为它们的流体动力学半径(rh)的函数洗脱。uv轨迹(虚线)显示两个不同的峰，在18-25min和25-60min的保留时间。第一个峰(浅灰色框)代表溶液中游离、未结合的rna，这是由于制剂中rna的摩尔过量(access)，而第二个峰代表lpx颗粒(深灰色框)。[0947]因此，根据图5中展示的数据，af4方法适用于宽尺寸范围(从nm至μm)的样品组合物，并且有效分离rna和纳米颗粒的复杂混合物的不同组分(rna和np)。此外，该方法能够分离较大尺寸范围内的多分散纳米颗粒级分(lnp、lpx、vlp、rna)，这是常用技术如sec无法完成的。因此，af4方法满足包含复杂颗粒混合物的组合物的大小分离的要求。[0948]实施例4-rna完整性的确定[0949]制备包含长度不同的不同热降解的rna(rna#1-4；大小：986-1688nt)的样品组合物和包含未处理的rna的对照组合物并进行af4分级方法(参见图6a)。相似地，制备使用不同比例(未处理(对照)、完全热降解和未处理与完全热降解的50:50混合物)的包含rna#2的样品组合物并进行af4分级方法(参见图6c)。如上文所述在uv信号的基础上确定每个样品组合物的rna完整性(对于样品和对照组合物，使用半峰面积/总峰面积的比例；至少一式三份测量)并与理论计算值进行比较。样品组合物(深、中和浅灰色条)和理论计算值(黑色条)的rna完整性百分比在图6b和6d中示出。[0950]从图6a和c可以看到，用af4方法可以分离和检测不同热降解的rna。计算的rna完整性显示热-时间依赖性降解动力学(图6b)，完整性对于热处理2min为～95％，4min为～90％和10min为～70％。为了验证该方法，以受控方式将降解和未降解rna的确定混合物组合并进行分析(图6d)。测量的rna完整性值与理论计算值非常吻合(图6d)。[0951]rna的一个主要重要质量参数是完整性。本文描述的af4方法适用于确定来自不同的非配制rna样本的rna完整性，范围从小的40nt至非常大的10000ntrna。该方法能够检测rna完整性的非常小的变化，并且与嵌入性染料的定量问题无关。[0952]实施例5-使用af4方法和基于荧光的方法进行rna定量的比较[0953]制备包含rna和荧光标记的颗粒的样品组合物并进行本文描述的af4方法，其中注入增加的体积并检测uv信号和荧光(fs)信号。确定每个样品组合物的uv和fs颗粒峰并对注入的rna量作图(参见图7a)。此外，计算样品组合物的uv与fs颗粒峰面积的比例并对注入的rna量作图(参见图7b)。[0954]图7证明两种检测系统的auc随注入rna浓度的增加呈线性增加，并且所得的图在宽的浓度范围内提供可比的结果。两种信号的线性行为表明由于与脂质体结合的高rna浓度的主要uv吸收，uv信号不受散射影响，即，没有显著的散射影响。因此，图7证明uv信号用于定量与颗粒结合的rna的适用性。[0955]实施例6-游离rna和与颗粒结合的rna的uv信号比例的确定[0956]制备包含不同量的rna和脂质复合物颗粒的样品组合物并进行本文描述的af4方法，其中检测uv信号。从uv信号确定游离rna和与颗粒结合的rna的峰面积，并且对各自样品组合物中rna的总量作图；参见，图8a。此外，对于每个样品组合物，确定与颗粒结合的rna的峰面积与游离rna的峰面积的比例，并且对各自样品组合物中rna的总量作图；参见，图8b。[0957]从图8a可以看到，在广泛的rna总量中，游离rna峰和lpx峰之间存在线性关系。此外，发现确定的与颗粒结合的rna的峰面积与游离rna的峰面积的比例以及消光系数在宽的lpx浓度范围内是恒定的(参见图8b)。这种比例可以是颗粒制剂的额外质量参数。[0958]实施例7–颗粒的大小分布的确定-通过uv或荧光信号获得的结果的比较[0959]制备包含rna和atto594标记的颗粒的样品组合物并进行本文描述的af4方法，其中检测uv信号(在260nm处)、mals信号和荧光信号(fs)(在624nm处发射)。代表性分级图谱在图9a中示出。计算uv/fs比例，并且将来自颗粒峰级分(洗脱时间：22-60min)的uv信号以及uv/fs比例对rg值(在mals信号的基础上确定)作图；参见图9b。在图9b中突出显示变化低于uv/fs比例的50％的rg区域(框)。在50和300nm之间的rg范围内，uv/fs比例的变化很小，并且给出可靠的大小值。较小的rg值受rna信号的影响，较大的rg值受散射的影响。总的来说，这些受影响的rg值低于总信号量的10％。基于使用在624nm处的荧光发射(黑条)和在260nm处的uv信号的累积重量分数分析计算d10、d50和d90值；参见图9c。[0960]用荧光检测器获得的分级图谱(参见图9a)仅显示一个峰，这归因于脂质复合物颗粒(lpx)，因为使用了荧光标记的辅助脂质，其只允许检测纳米颗粒。在整个洗脱范围内，uv和fs的迹线非常相似，在较高的保留时间处存在较小的偏差，表明随着大小的增加，散射的影响较小。为了进一步证明使用uv获得关于颗粒大小分布的定量信息的可行性，计算lpx(通过本文描述的af4方法分级)的总uv吸收与fs信号(在620nm处同时记录)并对相应的rg值作图(参见图9b)。发现所得的uv/fu-比例在很宽的大小范围内是恒定的，而在较大的尺寸时偏差增加。使用提供定量d10、d50和d90值的两种信号来分析累积重量分数；参见图9c。当将这些基于uv信号确定的d10、d50和d90值与基于fs信号确定的那些值进行比较时，未观察到颗粒大小d10和d50的显著差异，并且仅在较大尺寸(d90)时检测到小的差异。因此，这些数据表明纳米颗粒仅贡献可忽略不计的消光量，并且uv信号不受散射的强影响。[0961]因此，这些结果证明在不需要散射校正因子的情况下使用在线uv检测用于定量大小测量的可行性。本文描述的af4方法提供在一次运行中根据它们的扩散系数分离颗粒(例如，从含有rna的lpx分离未结合的/游离rna)并定量确定游离rna的量以及含有rna的lpx的大小分布的机会，这是传统方法如dls无法实现的。其他方法如nta(纳米颗粒追踪分析)也可以提供关于颗粒大小分布的信息，但是有其他缺点(参见，例如，上文的“发明背景”部分)。例如，对于nta，样品必须稀释10-1000倍，这可能会导致问题，尤其是取决于浓度的颗粒聚集或分解，这可能导致关于颗粒大小分布的不正确信息。[0962]实施例8-颗粒的几个参数的确定[0963]制备包含rna和颗粒的样品组合物并进行本文描述的af4方法，其中检测uv信号(在260nm处)、mals信号(在90°)和dls信号。代表性分级图谱在图10中示出(dls信号未在图10中示出)。[0964]图10中示出的分离谱包括uv信号(虚线)以及在90°的mals信号(实线)。使用berry图在lpx峰(25-60min保留时间)的mals信号的基础上确定rg值(灰色方块)，并且rg在80nm-400nm的范围内。在dls信号的基础上确定流体动力半径(rh)值(灰色圆圈)，并且rh在130nm-300nm的范围内。[0965]大小和大小分布是药物递送媒介物的两个关键参数(例如fda的"liposomedrugproductsguidance"2018)。如这个实施例证明的，af4方法不仅能够有效地分离复杂纳米颗粒的组分(rna与纳米颗粒)，而且还允许在宽的大小范围(nm-μm)内在线确定纳米颗粒的大小和大小分布。[0966]实施例9-颗粒的定量大小分布的确定[0967]进一步分析用实施例8中制备和分析的样品组合物获得的实验数据以确定颗粒的定量大小分布。图10中示出的分级图谱在图11a中再次示出。在确定定量大小分布的第一步中，提取图11a中示出的分级图谱中含有的颗粒峰(洗脱时间：26-55min)的实验确定的rg值并拟合为多项式方程(浅灰色线)；参见图11b。然后，基于多项式拟合重新计算rg值。在下一步中，将颗粒级分的uv信号作图为重新计算的rg值的函数(参见图11c，实线)。uv信号与颗粒数量成正比，相当于重量分数。在最后一步中，将记录的uv信号转化为相应的累积重量分数值(包括d10、d50和d90值)，作图为重新计算的rg值的函数(参见图11c，虚线)。uv信号与颗粒大小(rg值)的图直接提供关于颗粒量的定量信息。[0968]如这个实施例和其他实施例(参见，例如，实施例5和7)证明的，uv信号和相应的累积重量分数分布允许确定和分析定量颗粒大小分布谱。本文描述的af4方法是稳健、可重复的，并且提供分离的样品的深入表征，因此允许检测样品组合物内的变化。结果说明af4方法同时提供关于大小和大小分布的定性和定量信息，即，用于颗粒如np的表征。[0969]实施例10-分析不同脂质/rna比例对颗粒参数的影响[0970]通过以不同的脂质/rna比例(0.1-0.9)混合脂质和rna，有或没有100mmnacl，制备不同的样品组合物，并且进行本文描述的af4方法。对于每种不同的样品组合物，确定uv信号(在260nm)、光散射信号(在90°)和相应的rg值(使用berry图计算)。图12a显示相应的rg数据点一起的分级图谱的叠加。确定累积重量分数，将rg值对累积重量分数值作图，并且确定9种样品组合物中每一种的d90值(参见图12b)。将这些rg(d90)值作图为具有100mmnacl(黑点)或没有nacl(空心点)的脂质/rna比例的函数。[0971]图12a显示通过使用af4方法，可以有效地从物理化学异质纳米颗粒(lpx)中分离游离rna并进行定量。此外，图12a说明在样品组合物合成期间不同脂质/rna比例对样品组合物组分(即，游离rna和颗粒)的物理化学特性/参数(例如，rg)的影响。根据图12b和12c，颗粒的大小没有随着颗粒显著变化(在0.1和0.4之间的脂质/rna比例)。在较高的比例(》0.4)下形成较大的颗粒。对于lpx样品，大小随着脂质体量的增加而线性增加，这看来不受离子强度影响。数据表明脂质体过量(access)的增加导致所得颗粒的大小增加。盐的不存在导致在所示电荷比下大小减小。[0972]这个实施例表明af4方法允许分离和定量游离rna和颗粒以及确定在不同电荷比下颗粒的定量大小分布和表征。因此，已经证明该方法是分析rna-lpx相互作用的有用分析工具，并且可以在单次运行中提供关于不同纳米颗粒的定量和定性信息。[0973]实施例11-颗粒形式的估计[0974]通过将计算的rg值(例如，来自实施例8)对rh值(在dls信号的基础上确定)作图并将数据拟合为线性方程，可以接收关于颗粒形状的进一步信息。线性回归的斜率提供关于颗粒形状的信息。例如，0.74的斜率表明所分析的纳米颗粒呈球形。rg与rh值的比例也称为形状因子。[0975]实施例12-不同类型颗粒的分离和表征[0976]使用本文描述的af4方法制备和分析包含不同类型颗粒lpx、lnp、plx、脂质体、vlps+lpx)的样品组合物。图14显示af4-uv-mals-dls分离/检测。在90°角的ls显示为实线，并且表示颗粒峰。虚线代表在260nm处记录的uv信号(用于rna检测)。回转半径(rg)值(黑点)源自使用zimm图(rna和vlps)和berry图(lnp)的多角度光散射(mals)信号。动态光散射(dls；灰点)提供流体动力学半径(rh)。单个颗粒峰级分通过灰色条突出显示。图14a示出在af4-uv-mals-dls分离/检测之后，含有摩尔比为1.3/2的脂质和rna的lpx样品的代表性分级图谱。图14b示出包含两种类型的颗粒(短rna-lpx:vlp，1:1混合物)的组合物的代表性分级图谱。图14c示出脂质体样品(带正电荷的脂质体，由摩尔比为2/1的dotma和dope组成)的代表性分级图谱。图14d示出lpx样品(带正电荷的lpx(含有dotma和胆固醇)和rna，摩尔比为4/1)的代表性分级图谱。图14e示出脂质纳米颗粒(lnp)样品的代表性分级图谱，含有dodma、胆固醇、dope、peg(摩尔比为1.2/1.44/0.3/0.06)和rna，摩尔比为3/1。图14f示出颗粒的代表性分级图谱，含有jetpei聚合物以及ivt-rna或sarna，颗粒与rna的比例为12/1。[0977]图14证明af4方法可以应用于广泛的颗粒样本。洗脱谱允许例如确定颗粒的大小分布。此外，可以检测样品中的聚集体(例如图14b)，并且可以有效地分离不同类型的颗粒与未结合的游离rna(图14a/b/f中未标记的uv峰)。[0978]实施例13-用盐处理后非配制rna的表征[0979]af4方法用来分析在离子(氯化钠)存在下的rna行为。通过用不同的氯化钠浓度(0-50mm)预孵育各种rna(ivt-rna)来制备样品组合物。来自不同氯化钠浓度(0-50mm)中的非配制rna的示例性af4分级图谱(示出在90°的光散射信号)在图15中示出。rg值源自mals信号，使用zimm图。[0980]在图15中可以看到，用af4方法可以分离和检测不同处理的rna。仅可以检测到非常少量的较高分子量有序聚集体。有趣的是，rnarg值随着氯化钠浓度的增加而降低，因此与离子浓度成反比(从没有nacl的～80nm至有50mmnacl的20nm)。此外，随着盐浓度的增加，保留时间向较长的时间点移动(从没有nacl的～15min至有50mmnacl的18min)。这种移动表明rna的rh的变化(从较小至较大的rh值)。可以计算形式因子(rh/rg)并指示在盐的存在下rna的压缩。[0981]对以上数据进行累积重量分数分析以确定用不同氯化钠浓度(0-50mm)处理的每种样品组合物的定量大小分布以及rg(d50)值；参见图16a。将rnarg(d50)值(来自图16a)对氯化钠浓度作图，并且计算比例(mm氯化钠对nmrg)。从0至10mmnacl值的比例的线性拟合由粗线表示，而点线表示从10至50mmnacl的拟合。灰线和黑线代表用两种不同rna浓度测量的实例。[0982]从图16可以看到，如果盐以低浓度(0-5mmnacl)存在，则rg值会大大降低(～30％)。在较高的盐浓度(10mmnacl)下，rg降低的进展减少。根据图16b，在较低nacl浓度(0-10mm)下有线性相关性，而在高nacl浓度(50mm)下可以看到非线性相关性。这可以通过在低浓度离子的存在下rna的强压缩(有5mmnacl时30％rg降低)来解释，而rna的进一步压缩(～30％)在一定程度上仍可以发生，但是，这需要更高的离子浓度(50mmnacl)。[0983]离子是驱动rna折叠/压缩的一个关键因素，这对纳米颗粒的rna负载能力有影响。本文描述的af4方案适合用于分析氯化钠处理的rna(如ivt-rna和sarna)的rg值变化。[0984]实施例14-复杂样品组合物中游离rna的分离和定量[0985]这个实施例说明复杂样品组合物中游离/未结合的rna的定量。为了显示af4方法对确定包含rna和颗粒的样品组合物中游离rna的适用性，使用在260nm处的uv检测进行裸rna的校准曲线。[0986]使用本文公开的af4方法，在没有颗粒的组合物中通过在260nm处的uv吸收检测不同量的游离rna(1-15μg)。将rna量对各自的uv峰曲线下面积(auc*min)作图以产生线性校准曲线(参见图17a)。通过af4方法分析不同量的样品组合物(含有1-15μg总rna)。叠加的af4分级图谱示出260nm处的uv信号(参见图17b)。第一个峰(洗脱时间：～20min)对应于游离rna，而第二个峰(洗脱时间：～38min)对应于颗粒(结合的rna)。可以相对于参考rna(＝100％)计算颗粒组合物中游离、未结合的rna的量(见图17a)。为了显示该方法的线性，将游离rna(见图17b)以及参考、裸rna(见图17a)的uv峰积分作图为不同rna量(1-15μg)的函数(参见图17c)。作为用于定量游离rna的第二种优选程序(直接方法)，定义未结合的rna峰，并且可以使用rna的特定消光系数(lambert-beer定律)直接计算rna量(参见图17d)。[0987]从图17可以看到，发现uv信号面积与指定范围内的样品浓度成正比，具有可重复性。图17a示出作为不同rna量的函数的uv信号的auc，表明使用uv信号定量rna的线性行为。此外，根据图17b，未观察到未结合的rna的洗脱行为的变化。在图17c中，裸rna以及纳米颗粒的游离rna的uv信号积分显示为不同rna量的函数。两个图都是线性拟合的，并且显示直接相关性。这表明uv信号(auc*min)可以直接用来定量np样品中的游离rna而无需用裸rna进行校准曲线的可行性。因此，在指定线性范围内，可以相对于相同量的适当裸rna直接定量游离rna。结果给出胶体制剂中游离rna的百分比(％)。[0988]因此，这个实施例表明af4方法可以用作无标准品方法，用于包含颗粒的样品组合物中游离rna的直接定量，不需要参考样品或标准化。此外，可以确定游离rna与np的比例作为包含颗粒的样品组合物的额外质量指标。[0989]实施例15-不同样品组合物中游离rna的分离和定量[0990]这个实施例显示具有不同物理化学行为的样品组合物中游离rna量的分析。在没有nacl(参见图18a)或有100mmnacl(参见图18b)的情况下制备样品颗粒组合物(以可变电荷比(0.1-0.9)混合的(dotma/dope2/1)/rna复合物)并使用本文描述的af4方法分析。所有混合物均一式两份制备并至少一式两份测量。将计算的有100mmnacl(黑色圆圈)和没有nacl(空心圆圈)的未结合的rna的百分比对电荷比作图。[0991]图18a和b表明af4方法可以有效地分离和定量来自物理化学异质np(lpx)样品(脂质/rna电荷比)的游离rna，并且可以进一步分离不同的lpx。将游离rna的相对量计算为脂质/rna电荷比的函数，其中rna浓度保持恒定(0.1mg/ml)并且脂质体的量变化。混合物的离子强度(0对100mmnacl)也有所不同。可以看到游离rna量的明显变化，取决于脂质/rna比例和离子强度(0-100mmnacl)。对于所有样品，所有样品组合物的游离rna的保留时间相似(图18a/b)。对于有或没有nacl的lpx样品，游离rna的量随着脂质体量的增加而线性减少(图18c)。盐的存在导致可检测的游离rna的量减少(达15％)。从这些数据可以得出结论，盐的添加可以将与lpx结合的rna的量增加～15％。图18d示出有100mmnacl(黑色圆圈)和没有nacl(空心圆圈)的情况下未结合的rna的浓度(μg/ml)，显示相似结果。[0992]这个实施例证明af4方法允许分离未结合的rna以及在线定量异质lpx样品中的游离药物(rna)。该方法是用于确定rna-lpx相互作用的有用分析工具，并且可以在单次运行中提供关于颗粒的定量信息。[0993]实施例16-样品组合物中总rna的定量[0994]这个实施例说明使用本文描述的af4方法定量颗粒组合物中的总rna。[0995]图19a示出通过af4方法分离的zwittergent处理的裸rna的分级图谱。在260nm处的uv信号由黑线表示，在90°的ls信号由虚线表示。图19b示出具有uv检测(实线)，有游离rna(以灰色突出显示)和结合的rna(第二个峰)，在90°角的ls信号(虚线)的颗粒组合物的代表性分级图谱。图19c示出rna组合物的相应分级图谱，其中已使用释放剂(含有0.1％zwittergent的液相)溶解颗粒，具有uv检测(实线)和90°的光散射(虚线)。图19d示出用释放剂(zwittergent)处理之后裸rna和总rna的直接定量。[0996]在fda指南中被视为重要质量参数的参数是样品组合物中的游离、结合的和总rna浓度。使用uv检测来定量基于脂质的制剂中的总rna的挑战在于游离和结合的rna的消光系数的差异。为了使用在260nm处的uv检测来定量lpx中的总rna浓度，必须消除这些差异。为了解决这些任务，可以应用两种不同方法。第一种方法是基于复合的rna的消光系数的确定，由于需要大量rna用于测定，这更加复杂。第二种方法是基于从制剂释放结合的rna。在总rna的定量确定之前，必须通过添加释放剂(例如，表面活性剂，如0.5％sds或0.1％zwittergent(zw))来破坏纳米颗粒，以从颗粒释放rna。用含有例如0.05％(w/v)sds或0.05％(w/v)zw的液相进行溶解的lpx的分离以防止在分离期间重新形成纳米颗粒。溶解的lpx的分离导致ls峰随着分级图谱中uv信号的增加而降低(图19c)。裸对照rna的uv信号(图19a)与记录的从颗粒释放的rna的uv信号(图19c)可比。[0997]因此，可以将获得的溶解的lpx的uv峰面积直接转化为颗粒制剂中的总rna浓度(mg/ml)。使用两种rna的相同消光系数以mg/ml计算的浓度显示裸对照以及从lpx释放的rna的可比结果(图19d)。[0998]结果表明af4方法允许确定游离rna的量以及定量包含rna和颗粒的组合物中rna的总量。[0999]实施例17-样品组合物中游离rna和总rna完整性的确定[1000]这个实施例说明使用本文公开的af4方法确定含有rna和颗粒的样品组合物中游离rna和总rna的完整性。[1001]图20a示出使用af4方法的具有rna完整性不同的rna的分离的颗粒的uv迹线(未处理的rna：黑色实线；部分热降解的rna：点线；混合物(以定义的方式将50％未处理的和50％完全降解的混合)：虚线；颗粒中完全降解的rna：灰色实线)。图20b示出颗粒中完整游离rna(深灰色)以及总游离rna(黑色)和完全降解的(浅灰色)游离rna的定量。图20c示出af4分离(在液相中使用释放剂)之后溶解的颗粒的uv迹线。图20d示出通过颗粒中游离和总rna的af4-uv测量分析的确定的完整性。条形图表示与颗粒中总rna值的确定的完整性(黑色条)相比游离rna的相对rna完整性(灰色条)。[1002]如上所述，rna完整性是重要的质量参数。这个实施例证明af4方法允许确定裸rna和总rna的完整性，然而，这无法通过其他方法(例如，毛细管电泳)实现。[1003]图20a示出用不同降解的rna(未降解至热降解)制备的lpx的叠加uv分级图谱。完整的未处理的rna给出2个不同的峰，在13–25min(游离rna)和25-60min(纳米颗粒)洗脱。完全降解的rna(98℃，16h)显示为灰色实线，在0-10min(游离降解的rna)和22-50min有2个不同的峰。未处理和完全降解的rna的混合物(通过将50％未处理的rna与50％完全降解的rna混合制备)显示为点线，在0-10min(游离降解的rna)、13-25min(游离完整的rna)和25-55min(纳米颗粒)有3个不同的峰。另一样品组合物包含部分降解的rna(在98℃热处理15min的rna)和lpx。通过af4方法分离这些样品组合物并使用uv检测进行分析。分离的lpx的uv信号显示为黑色虚线，并且两个明显的峰出现在5-25(游离rna，部分降解)和25-55min(lpx)。游离完整rna的数量差异在图20b中示出，对应于rna的降解程度。对于包含完全降解的rna的lpx组合物，不可检测到完整的游离rna，而包含混合物的样品组合物含有22％的游离完整rna，包含未处理的rna的样品组合物含有52％的游离完整rna。观察游离rna的总量，观察到几乎可比的结果。随着rna降解的增加，观察到游离rna略有增加(55–60％)。但是，包含混合物的样品组合物中游离rna的完整性比预期(50％)低(37％)，表明与完全降解的rna相比，完整rna优先与阳离子脂质相互作用。由于制剂中游离降解rna的量较高，完全降解的rna的完整性影响游离rna的完整性(12％，图20)。这些发现(完整和降解rna的混合物中较高的总rna完整性值，较低的游离rna完整性)表明完整rna优先与阳离子脂质结合，而包含混合物的样品组合物中游离rna的完整性以及含量看来是可比的。[1004]图20c示出包含释放剂的相应lpx样品组合物的叠加uv分级图谱。所有lpx颗粒在较高洗脱时间处的uv峰消失，并且结合的rna的洗脱时间迁移至游离rna的洗脱时间。[1005]因此，这个实施例证明本文描述的af4方法能够分离lpx中不同的rna级分(游离、结合的、总的)并确定分级的rna的完整性。此外，af4方法允许在单次运行中同时计算颗粒的rna完整性和rna数量(基于uv检测)。用其他常规技术无法实现这些参数的同时分析。[1006]实施例18-样品组合物中游离的、可接近的和包裹的rna的确定[1007]这个实施例说明使用本文公开的af4方法确定样品组合物中游离的、可接近的和包裹的rna。[1008]af4方法的荧光检测的线性在图22a中示出：注入不同量的rna(0mm对100mmnacl)并通过本文描述的af4方法分离。在注入之前，将嵌入性染料(gelred)添加至rna用于荧光检测(600nm)。图22b示出条形图，显示在没有或有nacl(100mm)的lpx组合物中可接近(黑色条)和包裹(灰色条)的rna的相对量。为了检测荧光发射信号，在lpx形成之前或之后添加嵌入性染料(gelred；600nm)。图22c显示使用本文公开的af4方法和图21中示出的方案比较颗粒组合物(lpx)中游离rna的相对量，其中已使用不同rna检测确定所述量：在260nm处的uv吸收(黑色条)和在600nm处的荧光发射信号(fs)(灰色条)。[1009]实施例19-在不使用参考rna的情况下分析rna完整性[1010]这个实施例提供使用本文公开的af4方法且不使用参考rna来估计rna，特别是长sarna的(相对)完整性的程序的概述。[1011]将长度为11,917nt的sarna进行本文公开的af4方法。图23a示出具有在90°的ls信号(点线)和在260nm处的uv信号(实线)的sarna的示例性af4分级图谱。粗黑线代表源自mals信号的分子量曲线。在图23b中，为了更好的概述，在图23b的上图中仅将来自图23a的分子量曲线显示为实线。基于总uv峰信号(即，从t＝10min至t＝40min)设置总rna峰(峰1)的限值。这里，由如下来自分子量曲线的一阶导数(源自mals)设置“完整”rna峰(峰2)的限值。计算分子量曲线的一阶导数(图23b下图中的点线)。分子量曲线的接近水平部分反映保留时间，其中存在未降解的rna的级分。在这个基础上，可以选择积分限值(integrationlimit)，并且计算样品中未降解的rna的量。[1012]实施例20-游离和结合的rna的定量分析，使用uv确定颗粒大小分布、累积rna重量分数、lpx级分中的rna质量和每个lpx级分的rna拷贝数[1013]将rna脂质复合物(lpx)样品组合物进行本文公开的af4方法。图24a示出具有在90°的ls信号(实线)和在260nm处的uv信号(虚线)的所述rnalpx样品组合物的代表性af4分级图谱。uv信号显示两个峰，其中第一个峰代表游离的、未结合的rna的量，而第二个峰来自包含rna的lpx纳米颗粒。uv信号直接代表不同级分中的rna量，作为洗脱时间的函数。回转半径(rg；粗线)源自mals信号。[1014]图24b示出来自图24a的260nm处的uv信号(虚线)，实线显示基于uv信号下面积的累积重量分数。对于未结合的rna的绝对定量，曲线下的第一个峰面积与特定rna消光系数一起用来计算未结合的rna级分的量。因此，可以将第一个峰定量转化为未结合的rna的绝对量(此处：1.4μg；36μg/ml)。可以通过将rnalpx样品组合物中未结合的rna的绝对量(μg)与总rna(实线)相关联来获得未结合的rna级分的相对量(36％)。通过两种额外的正交方法(琼脂糖凝胶电泳测定和离心测定)证实这个值的合理性。通过证实36％的未结合的rna值，可以得出结论，剩余量的rna(3.66μg；64μg/ml)结合在lpx级分中。这表明来自af4分级图谱的直接uv数据也定量地对应于颗粒中的rna，具有接近100％的回收率(recovery)。如果来自颗粒的更强散射发挥作用，则可以将定量确定的游离rna与来自其他测量的游离rna级分的数据一起用于缩放颗粒的uv峰。[1015]图24c示出rnalpx样品组合物中结合的rna量，通过使用不同大小级分(δt＝1min)中260nm处的吸收。根据它们的扩散系数分离纳米颗粒，并且使用barry图从mals导出回转半径(rg)。为了计算不同rg级分的rna量，仅使用lpx峰(即，图24a和b的第二个峰，从t＝～24min开始，并且在t＝～60min结束)。图24d示出从图24c中示出的结果计算的每rg级分的计算rna拷贝数(条形，左侧y-轴)。每rg级分的计算颗粒数量由相应的点线曲线表示。[1016]这个实施例证明本文描述的af4方法能够在单次运行中同时确定rnalpx样品组合物的累积rna重量分数(参见，图24b)、lpx级分中的rna质量(参见，图23c)、每lpx级分的rna拷贝(参见，图23d，条形)和每lpx级分的颗粒数量(参见，图23d，点线曲线)。用其他常规技术无法实现这些参数的同时确定。[1017]实施例21-在af4方法中使用圆二色谱(cd)光谱[1018]这个实施例证明cd光谱也可以在本文公开的af4方法中用于测量uv信号。[1019]将rna脂质复合物(lpx)样品组合物进行本文公开的af4方法，使用cd光谱作为测量uv信号的手段。图25a示出具有在90°角的ls信号(实线)和在260nm处记录的cd信号(点线)的rnalpx样品组合物的代表性af4分级图谱，其中后者代表未结合的rna(第一个峰；t＝18min)和结合的rna(第二个峰；t＝35min)。[1020]图25b显示本文公开的af4方法中cd检测用于纳米颗粒制剂中游离和结合的rna的定量的适合性。平行使用在260nm处的uv以及cd检测产生裸rna的校准曲线。将曲线下的峰面积(cd：实心正方形和实线；uv：实心三角形和虚线)对注入的rna量作图。cd和uv信号的峰面积的比例显示为点(第二个右侧y-轴)。cd信号面积的值符合良好的线性(r2＝0.999)，并且发现与rna的量(和uv信号)成正比。cd和uv信号的峰面积比例表明在宽校准范围(4-20μg)内的恒定行为。因此，这个实施例证明cd也可以用于定量纳米颗粒中rna(游离和结合的)的量。[1021]图25c示出在本文公开的af4方法中使用cd检测定量游离和结合的rna。来自适当裸rna的cd信号的曲线下面积(auc)与适当的总auccd信号相关。将不同量的rnalpx样品组合物(2-15μg)进行af4方法并对各自的cd峰auc作图，并且这些值是线性拟合的(r2＝0.998)。发现cd信号面积与游离以及结合的rna的量成正比。通过将未结合的rna和结合的rna的量与总rna量关联来确定rnalpx样品组合物中未结合的rna(空心正方形)和结合的rna(空心圆圈)的相对量(％)。结合与未结合的rna级分的相对比例在所示校准范围内是恒定的。当前第1页12当前第1页12