免疫球蛋白E用逆向侧流免疫分析的制作方法

免疫球蛋白e用逆向侧流免疫分析
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月27日向美国专利与商标局提交的、专利号62/926,528、名称为“一种抗原特异性ige测量用逆向侧流免疫分析方法”的美国临时专利申请，在此通过引用将其整体结合入本文。
技术领域
3.本发明涉及利用将抗原偶连到有色纳米颗粒的过程通过逆向侧流免疫分析检测和量化生物样品中人抗原特异性免疫球蛋白e(ige)的方法和组合物，ige对抗原具有特异性并与其反应。所形成的抗原特异性ige-抗原-纳米粒子复合物随后被固定在侧流免疫设备中的试纸条的测试线或区域上的抗-ige抗体捕获并检测。


背景技术：

4.过去几十年，公布了许多涉及免疫层析设备的专利。这些设备的标准部件包括以下部件：
5.a.在侧流分析方式中能观察到吸水条上反应区域的塑料壳或纸壳；
6.b.能够添加样品(尿、全血、血浆、血清、唾液或其他体液)的壳体一端的开口；
7.c.具有能与抗原或抗体反应的固定特异性结合单元吸水材料；
8.d.吸收性吸水材料垫，例如吸收垫，该吸收垫附在样品口相对的端上用以吸收横向流动的样品、缓冲液和胶体；
9.e.用于样品口端的吸水材料条，其初步吸收所用样品；
10.f.与样品口材料和侧流条接触的包含干色固相试剂的吸水材料条，固相涂覆有抗体或其他蛋白。
11.通常描述了两种色谱免疫分析，在其中一种色谱免疫分析中，检测到体液(尿、全血、血浆、血清以及唾液)中包含的分析物(蛋白、半抗原或小分子)。分析物包括hcg、fsh、tsh、肌钙蛋白、肌球蛋白、血清蛋白、病毒蛋白或细菌蛋白、半抗原、治疗药和滥用药。
12.在另一种色谱免疫分析中，检测到的分析物为各类与制剂诸如病毒蛋白或细菌蛋白(hiv、甲肝丙肝、幽门螺杆菌、ebv、风疹、cmv、hsv、登革热、莱姆病、恰加斯、tb、弓浆虫、自身免疫抗原等)或过敏原(花粉、霉菌、尘螨、食物、动物上皮细胞等)特异性反应的人源抗体。检测抗体时，通常使用以下三种格式：
13.1)有色固相或纳米颗粒和与人igg抗体反应的蛋白或凝集素[a蛋白、g蛋白、晶状体凝集素、木菠萝素、刀豆球蛋白a、甘露聚糖结合蛋白、麦胚凝集素、花生凝集素等]。固相可由与待分析样品中包含的igg、igm和iga特异性反应的抗免疫球蛋白涂覆。在这种情况下，吸水条将包含目标分析物，该目标分析物与样品中含有的特异性抗体反应。
[0014]
2)有色固相包含与人免疫球蛋白反应的分析物。在这种情况下，吸水条也将包含目标分析物，该目标分析物与样品中含有的特异性抗体反应。
[0015]
3)有色固相或纳米粒子包含与免疫球蛋白反应的分析物。吸水条包含针对各类免
疫球蛋白或物质诸如a蛋白、g蛋白、凝集素、晶状体凝集素、木菠萝素、刀豆球蛋白a、甘露聚糖结合蛋白、麦胚凝集素、花生凝集素或免疫球蛋白类igg、iga、igm抗体的混合物的蛋白。
[0016]
美国专利(专利号us6,528,325)(胡布舍尔等)及其后来的补充版本美国专利(专利号6,528,325b1)(胡布舍尔等)要求一种利用将抗原偶连到色谱粒子的方法检测抗原特异性igm、igg和iga的侧流方法。包含igm、igg和iga的免疫复合物随后由硝酸纤维素膜的测试线中分配的抗igm抗体、抗igg抗体和抗iga抗体捕获。在该专利的另一个实施例中，发明人还要求使用抗ige抗体偶连的色谱粒子检测过敏原特异性ige的方法。在该ige检测方法中，过敏原固定在吸水硝酸纤维素膜的测试线中以检测含ige的复合物。因此，这种基于抗ige抗体结合粒子的抗原特异性ige检测方法以下也称为“传统侧流免疫分析法”。
[0017]
美国专利(专利号7,629,127)(胡布舍尔等)公开了美国专利(专利号6,528,325)(胡布舍尔等)中描述的侧流免疫分析的改进版本以通过设计样品口上游缓冲液口并在样品口施加样品后在缓冲液口中施加淋洗液，利用“两步法”提高过敏原特异性ige检测的读数敏感性和检测敏感性。在这种方法中，抗ige抗体标记的缀合物在缓冲液口和样品口之间的位置干燥。在传统lfia的“两步式”替代方式中，过敏原固定在试纸条的测试区域。
[0018]
欧洲专利ep1891447a1(rundstrom等)公开了一种ige检测用“传统侧流免疫分析”的替代方式，其中两步法用于过敏原特异性ige的改进检测。在这种“两步法”分析中，在将电泳缓冲液施加到位于样品口上游的缓冲液口后，含ige的样品首先施加到样品口，让其流向吸水垫。干燥的抗ige抗体缀合物在缓冲液口和样品口之间的位置沉降。在传统lfia的“两步式”替代方式中，过敏原固定在试纸条的测试区域。
[0019]
由于敏感性限制和/或特异性限制，先前用于过敏原特异性ige检测的“传统侧流免疫分析”的发明不能广泛应用于过敏诊断，特别是食物过敏诊断。最好进行高敏感性、高特异性侧流分析，这种分析能够作为快速筛查和诊断工作克服现有技术中的低敏感性问题用以检测量化生物样品中过敏原特异性ige以便诊断ige介导的过敏症，包括食物过敏。


技术实现要素：

[0020]
本发明涉及能够快速在即时环境中作为诊断工具高敏感性地、高特异性地检测过敏原特异性和抗原特异性ige的新型逆向侧流免疫分析(r-lfia)平台，该平台能够诊断包括过敏性疾病和自身免疫疾病的ige介导的疾病。
[0021]
因此，本发明的一个目的是涉及能够检测可溶性ige，特别是各种抗原和过敏原特异性人ige的新型r-lfia平台，各种抗原和过敏原包括但不限于ige介导的过敏性疾病、自身免疫性疾病和其他ige介导的疾病引起的食物过敏原、自身抗原、环境过敏原、昆虫抗原、寄生虫抗原、细菌抗原和病毒抗原以及合成药抗原或半抗原。
[0022]
因此，本发明的另一个目的是诊断食物过敏诸如花生、牛奶、鸡蛋、贝类、树坚果、红肉、小麦、大豆及芝麻籽；抗可溶性蛋白、膜蛋白、胞内蛋白、蛋白-dna复合物和蛋白-rna复合物形式的自身抗原的ige介导的疾病，这些蛋白和复合物作为引起基自身免疫肥大细胞和嗜碱粒细胞活化如慢性自发性荨麻疹及其他特发性急慢性荨麻疹的自身抗原；环境过敏原诸如尘螨、蟑螂、花粉、宠物毛屑和霉菌；抗ige昆虫过敏原诸如蜜蜂、黄蜂、大黄蜂、胡蜂和火蚁的毒液；抗ige寄生虫抗原诸如蠕虫、钩虫和其他寄生虫；以及抗ige合成药、抗生素和抗肿瘤药。
[0023]
本发明的另一个目的在于提供一种新型逆向侧流免疫分析法，其包括试纸条和/或容纳试纸条的盒，在即时环境中，该方法能够快速定性、半定量及定量检测样品中一个或多个过敏原特异性或抗原特异性ige。
附图说明
[0024]
图1为试纸条的示例图。图1a为不具有独立样品垫的试纸条，图1b为作为替代设置格式的具有独立样品垫的试纸条。
[0025]
图2为新型逆向侧流免疫分析的机制图。图2a为以花生过敏原特异性ige为例，阳性过敏原特异性ige的检测图。图2b为以花生过敏原特异性ige为例，阴性过敏原特异性ige的检测图。图2c为显示r-lfia检测的花生阳性结果或隐性结果的真实试纸条示例。
[0026]
图3为逆向侧流免疫分析(r-lfia)与传统侧流免疫分析(c-lfia)对比。图3a为r-lfia的机制图，图3b为c-lfia的机制图。图3中分别标记和示出了r-lfia和c-lfia中对应部件。
[0027]
图4为利用相同花生过敏血浆样品检测r-lfia和c-lfia之间敏感性对比的示例。星号表示各自方法检测的最终稀释度。
[0028]
图5为三种花生过敏血浆样品的r-lfia检测的最终稀释度的示例。immunocap方法测量的对应国际单元(iu)水平用于对比。
[0029]
图6为利用不同容积的r-lfia检测结果的示例。
[0030]
图7为来自无已知花生过敏的随机正常人群的代表性r-lfia检测结果的示例。
[0031]
图8为检测r-lfia的花生过敏性ige的特异性示例，其特异性地检测花生过敏性ige而非其他过敏原特异性ige。
[0032]
图9为粒细胞活化试验确认的花生过敏性血清样品用r-lfia测试结果的示例。
[0033]
图10为用于确定初始诊断截断值用花生非过敏性和过敏样品的测试结果的概述。
[0034]
图11为28个血浆样品的r-lfia测试结果的示例，该28个血浆样品的花生过敏性ige值高于immunocap方法类别的第四类的值。
[0035]
图12为来自三个虾过敏性血浆样品的r-lfia检测的最终稀释度的示例。immunocap方法测量的对应iu水平用于对比。
[0036]
图13为19个血浆样品的r-lfia测试结果的示例，该19个血浆样品的虾过敏性ige值高于immunocap方法类别的第四类的值。
具体实施方式
[0037]
参照以下说明书、权利要求以及附图理解本发明。下面陈述的能够实施本发明的实施例说明书不限定优选实施例而是作为其特定示例。本领域的技术人员应该理解到他们可以很容易地将本发明所揭示的概念和特定实施例用作基础，改进或设计其它的结构来实现本发明的相同目的。本领域的技术人员还应该意识到，这些等价的结构在最广义的形式上未脱离本发明的精神和范围。
[0038]
超过3200万美国人遭受食物过敏，例如，花生过敏之苦。现有诊断法中，他们其中一些人的假阳性率未必很高。因此，口服食物激发(ofc)仍然是确诊食物过敏的金标准。然而，由于ofc是在装备精良的医疗设施中需要密切监视的高风险且大量占用资源的过程，大
部分食物过敏患者无法常规使用。许多人并未确诊，直到过敏反应偶然发生。人们一致同意急性食物过敏诊断是迫切的医疗需求。
[0039]
流免疫分析被广泛用作适用于各种疾病，包括环境过敏的即时(poc)环境的廉价快速诊断法。然而，现有c-lfia格式不能实现足够高的敏感性以作为对多种过敏有意义的诊断方法。考虑到所有可用的商业过敏原特异性-ige测试的高假阳性和c-lfia的低敏感性限制，本发明的过敏原特异性ige检测用r-lfia设计用于缓解这些问题。
[0040]
花生过敏ige测试用r-lfia格式不但通过过滤低亲和力交叉反应ige显示出高特异性，而且相对于c-lfia格式，大大提高了ige检测敏感性(30倍)，达到花生过敏诊断临床应用的阈值。
[0041]
r-lfia格式也适用于具有相同或相似高敏感性和特异性的其他食物过敏ige以及其他环境过敏原和自身抗原特异性ige测试。
[0042]
所述r-lfia为包括以下部件的试纸条，其具有以下特征：
[0043]
1.样品垫；
[0044]
2.缀合垫；
[0045]
3.作为替代物用于样品垫和缀合垫目的的组合垫(图1a)；
[0046]
4.包含偶连到抗原或过敏原的金粒子的缀合物，抗原或过敏原在缀合垫上全部弄干；
[0047]
5.预分配于测试线位置的抗人ige抗体的蛋白结合膜以及预分配于控制线位置的抗抗原抗体；
[0048]
6.吸收垫；
[0049]
7.上述所有部件安装到基底支架上；
[0050]
8.样品垫和缀合垫之间、缀合垫和蛋白结合膜之间以及蛋白结合膜和吸收垫之间相互重叠；
[0051]
所述逆向侧流免疫分析用所述测试过程包括以下步骤：
[0052]
1.直接向样品口施加体积为0.1ul到1ul或1ul到50ul(以0.1ul为间隔)稀释或未稀释的试样。
[0053]
2.在样品添加到样品口后，可以立即向样品口滴加一滴电泳缓冲液或以1”为间隔，等待设计时间范围，该时间范围可能是1”到60”以及60”到120”，滴加电泳缓冲液。
[0054]
3.另选地，各种体积的稀释的或未稀释的待测样品可以与电泳缓冲液预混，随后施加到侧流设备的样品口。
[0055]
4.根据样品中分析物的浓度，在5秒到10分钟或10分钟后能够看到色密度指示的测试结果。
[0056]
5.色密度能够由设计的侧流设备显示或读取。
[0057]
试样中抗原(下面以花生过敏原为例)特异性ige与预缀合到金纳米颗粒(gnp)的过敏原相结合，金纳米颗粒在缀合垫上全部弄干，而其他ige未结合(图2)。流向吸收垫时，花生特异性ige-花生过敏原-gnp复合物被印在测试线位置的抗-ige抗体(ab)捕获，形成可见/可检测测试线信号。无ige花生过敏原-gnp缀合物越过测试线被印在控制线上的抗花生mab捕获，形成控制线信号(图2a)。在非花生过敏的情况下，没有形成复合物的花生特异性ige，该复合物具有测试线上待抗ige ab捕获的花生过敏原-gnp，因此，没有可见/可检测测
试线信号。然而，花生过敏原-gnp缀合物能够由抗-花生mab捕获以形成控制线(图2b)。图2c示出了花生阳性和阴性样品的真实样品。
[0058]
在r-lfia格式中，过敏原特异性ige以及其他ig同型抗原能够直接竞争与偶连到gnp的过敏原相结合(图3a)。包含过敏原特异性ige的gnp被固定在测试线上的抗ige抗体捕获，而不包含过敏原特异性ige的gnp能够通过测试线随后被固定在控制线上的抗花生mab捕获。因此，样品中非过敏原特异性ige(例如其他ige)水平理论上能够与结合到测试线的过敏原特异性ige竞争。然而，由于固定抗-ige ab的量极大，这种可能性在lfia环境中不是问题，使得血清ige水平不能使测试线中所有ige结合能力饱和。
[0059]
与传统侧流免疫分析(c-lfia)对比。对于c-lfia(图3b)，抗ige抗体缀合到gnp。来自血浆的总ige以及过敏原特异性ige被偶连到金纳米颗粒(抗ige-金缀合物)的抗ige mab捕获。当含金纳米颗粒的复合物流过涂覆的过敏原(后为花生过敏原)所在的测试线，仅复合物携带的过敏原特异性ige能够被涂覆的过敏原捕获而沉积为可见(或可检测)信号，由于过敏原特异性ige作为在测试线固定复合物的桥梁，而金纳米颗粒复合物携带总ige而非过敏原特异性ige，复合物能够通过测试线并被控制线处涂覆的抗(抗ige)mab捕获。在这种格式中，由于样品中总ige水平可能直接和与偶连到金纳米颗粒的抗ige结合的过敏原特异性ige竞争，总ige/过敏原特异性ige比例水平可能是影响分析敏感性的主要变量。在这个格式中，由于它们不能特异性与gnp相结合以影响分析过敏性，因此过敏原特异性ig(igm、igg和iga)无关紧要。
[0060]
实施例
[0061]
实施例1。使用相同花生过敏样品(pl14231)比较r-lfia和c-lfia之间的检测敏感性。星号表示各自方法检测的最终稀释度(图4)。在最佳打点条件下，r-lfia能够获取1:300稀释度的阳性信号，而c-lfia能够检测到1:10稀释度的阳性信号，表明花生特异性ige检测的r-lfia的敏感性是c-lfia的30倍。
[0062]
实施例2。通过r-lfia，从三种(pa2、pa3和pa6)花生过敏血浆样品检测最终稀释度。immunocap方法测量的相应iu水平用于与确定r-lfia敏感性极限相比较(图5)。一系列2倍稀释度测试表明r-lfia能够获取等于小于immunocap(0.35iu/ml或0.35kua/l)用敏感性极限的水平的信号水平，表明r-lfia的敏感性大于等于immunocap ige测试的敏感性。
[0063]
实施例3。r-lfia测试结果使用各种体积的花生过敏血浆。低至0.5ul的pa3样品足以引起r-lfia测量的可见阳性信号(图6)。递增的样品体积从0.5ul逐渐增加到9ul相应地近乎线性地增加了阳性信号水平，尤其是当au值归一化后。这些数据显示r-lfia是高敏感性的非常灵活的pa诊断工具，该诊断工具能够适应大范围的诊断测试用样品体积。
[0064]
实施例4。无已知对花生过敏的随机正常人群中花生特异性ige水平。而90％的随机正常人群未显示出任何可检测的花生特异性ige，约10％的人群显示出低阳性率，au小于6.0(例如，样品ns45，图7)。这些弱阳性样品能够完全由1ul 100ug/ml的初制花生提取物抑制，表明r-lfia从随机人群中获取低水平花生特异性ige。
[0065]
实施例5。花生特异性ige检测用r-lfia的特异性。花生ige r-lfia仅与ara h1和ara h2特异性重组ige反应，而不与100iu/ml牛奶(bos d5和bos d8)、虾(pen a1)、蛋类(gal d1)、鱼类(gad m1)、桦树花粉(bet v1)和家嗜甜螨(der p1)抗原特异性ige发生交叉反应。作为阳性对照，pa样品pl 26259显示出较强的阳性反应性(图8)。
[0066]
实施例6。r-lfia ige测试结果与粒细胞活化试验(bat)测试结果的相关性。使用ige r-lfia，所有11个bat确定的花生过敏样品显示出高au水平(图9)。
[0067]
实施例7。花生ige r-lfia的诊断截断值。在中试可用数据中，如果截断值设置为au等于6，r-lfia显示出花生过敏诊断100％(11/11)的阳性预测值和100％(251/251)的阴性预测值(图10)。
[0068]
实施例8。花生特异性ige水平大于17.5iu/ml(immunocap分类的iv级及更高级)的血浆样品的r-lfia ige测试结果(图11)。这些数据共同表明immunocap确定的21.5％的(28个中的6个)ps-ige iv级水平的样品不含r-lfia测量的au或含有较低的r-lfia测量的au。
[0069]
实施例9。通过r-lfia形式，从三个虾过敏血浆样品检测的最终稀释度。immunocap方法测量的相应iu水平用于与确定r-lfia敏感性极限相比较(图12)。一系列2倍稀释度测试表明r-lfia能够获取等于小于immunocap(0.35iu/ml或0.35kua/l)用敏感性极限的水平的信号水平，表明r-lfia的敏感性大于等于immunocap ige测试的敏感性。
[0070]
实施例10。虾特异性ige水平大于17.5iu/ml(immunocap分类的iv级及更高级)的血浆样品的r-lfia ige测试结果(图13)。这些数据共同表明immunocap确定的15.8％的(19个中的3个)ps-ige iv级水平的样品不含r-lfia测量的au或含有较低的r-lfia测量的au。