亲和型传感器、特别是QCM传感器的制作方法

applications to protein adsorption and cell adhesion[应用于蛋白质吸附和细胞粘附的聚乙二醇纳米结构的制造]”nanotechnology[纳米技术]2005,16(10),2420-2426中，使用荧光分析来将纳米图案化的peg表面在与均质peg表面相比时对测试蛋白质吸附的影响绘图。它还解决了荧光增加与表面积增加的关系，但不排除与表面能相关的其他影响的可能性。
[0010]
旨在通过蛋白质吸附研究来改善锗纳米锥体上的细胞行为以实现较少的炎症反应的同时，riedel,m.；m
ü
ller,b.；wintermantel,e.在“protein adsorption and monocyte activation on germanium nanopyramids[锗纳米锥体上的蛋白质吸附和单核细胞活化],”，biomaterials[生物材料]2001,22(16),2307-2316中达到共识：纳米锥体的密度直接影响蛋白质本身的可用活性位点。将结果与表面积增加进行比较。2.5-3倍的增加远远超过了表面积的7％增加。此外，当密度按比例增加时，牛γ球蛋白的活性持续降低，直到它在可用的最大密度下完全失活。riedel等人的工作利用背景与图案之间的材料对比，这在其他工作中通常不会显示，并且这可能解释了更高的吸附覆盖率，因为锗和硅在暴露于蛋白质时可能具有不同的质量吸收或吸附动力学，或者如该论文暗示的那样，在椎体顶部发生的吸附的量可能比在背景上的要多。
[0011]
dolatshahi-pirouz,a.；rechendorff,k.；hovgaard,m.b.；foss,m.；chevallier,j.；besenbacher,f.的论文“bovine serum albumin adsorption on nano-rough platinum surfaces studied by qcm-d[qcm-d研究的纳米粗糙铂表面上的牛血清白蛋白吸附],”colloids surfaces b biointerfaces[胶体与表面b辑生物界面]2008,66(1),53-59研究了随机纳米粗糙铂表面与平坦表面相比对牛血清白蛋白吸附的影响。通过比较归一化的质量吸收，作者注意到了不能仅指示表面积增加的增量。此增量归因于被吸附物在表面上更好的空间布置，导致质量吸收增加了大约30％-35％。
[0012]
在上文介绍的大多数工作中，人们能够鉴定当蛋白质吸附发生时发挥作用并且不能仅追溯于表面积增加的第3方影响。某些场景可以被认为是污垢背景上的污垢纳米图案，因为背景的贡献仍然明显有助于总体溶质吸附以及可用表面。另一方面，valsesia等人和krishnamoorthy等人的工作提出了溶质在表面的特定区域上的吸附(防污背景方法中的污垢贴片)。
[0013]
发明概述
[0014]
在现有技术中，纳米图案如何影响溶质的吸附尚未确定。虽然一些作者证明了纳米图案上溶质吸附的增强，超出了人们由于表面积而预期的吸附，但没有报道只有比被吸附物物种(species)大几个数量级的位点可用于吸附的情形。
[0015]
在此情境下，一个重要的挑战是将吸附事件限制在预先确定的下至分子尺寸的区域内。此外，这些区域需要在相对较大的表面(例如几平方毫米)上以足够高的密度可用，从而能够以高信噪比进行分析和/或迎合具有大的测量占用面积的技术，诸如qcm、spr(表面等离激元共振)和椭圆偏振技术。
[0016]
本发明的第一方面涉及一种用于感测流体(液体或气体)中的分析物的亲和型传感器，特别是亲和型生物传感器，该传感器包括用于接触流体和吸附分析物的界面。该界面包括对分析物具有亲和力的纳米级区域的二元图案、和钝化区域。纳米级区域通过钝化区域彼此隔开，其方式为使得分析物在界面上的吸附被限制于纳米级区域。纳米级区域具有
包括在从5至200nm的范围内的直径。此外，纳米级区域一起具有等于界面的表面积的至少15％的表面积。
[0017]
如本文所用，术语“亲和型传感器”表示依赖于分析物(待定性地或优选定量地检测的物种)与选择性组分的结合的传感器，然而，在化学反应中不消耗分析物。在本公开的上下文中，亲和型传感器还是生物传感器(亲和型生物传感器)，其中选择性组分包括敏感的生物元件，例如分析物结合的抗体或受体。分析物优选包括生物分子，例如蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸。此种生物分子可以附着到一些其他实体(另一个分子或生物分子、纳米粒子等)。
[0018]
使用根据本发明的第一方面的亲和型传感器，发明人能够证明将被吸附物限制到表面上的纳米级区域上可以显著影响受体密度和吸附动力学。他们进一步指出，生物分子或具有可比尺寸的合成纳米级物体的影响在定性上相似。
[0019]
在本文件的上下文中，术语“直径”意指可以在与所考虑的物体的凸包相切的两个相对的平行平面之间形成的最小距离。直径的测量可以通过sem和/或afm使用直接和/或间接测量来进行。如果由于所考虑的物体边界不整齐(在高度充电的表面的情况下)导致使用sem直接测量直径变得困难，则可以使用afm或通过sem间接测量进行测量。众所周知，afm受到尖端卷积效应的影响，尖端卷积效应会影响横向分辨率。然而，通过考虑尖端规格，这些影响可以在一定程度上得以纠正。特征结构直径也可以通过sem间接测量。根据此技术，将已知直径的导电(例如金属)纳米粒子吸附在所考虑的物体上，以便提高导电性和分辨率。然后可以使用双纳米粒子直径作为最大可能偏差来确定所考虑的物体的直径。
[0020]
值得注意的是，传感器界面可以是平坦的或具有三维(3d)表面。对于纳米级区域也是如此。因此，要计算a
纳米
/a
界面
的比率(填充因子)，其中a
纳米
是纳米级区域合在一起的表面积，并且a
界面
是界面的总表面积(包括纳米级区域和钝化区域)，必须考虑表面的3d形状。优选地，纳米级区域一起具有等于界面的表面积的至少20％、更优选至少25％并且最优选至少30％的表面积。据诸位发明人所知，在文献中尚未报道具有高达15％的填充因子的纳米图案化亲和型传感器。可以理解的是，高填充因子意味着纳米级区域中吸附的增强可能导致总体吸附质量与使用未图案化传感器可获得的吸附质量相比相当或甚至更高，尽管可用于吸附的表面积更小。
[0021]
纳米级区域可以包括从钝化区域突出的纳米圆顶(纳米级圆顶或柱)。可替代地或除此之外，纳米级区域可以包括从钝化区域和/或与钝化区域齐平的纳米级区域凹入的纳米孔(纳米级孔)。实验已表明，使用相对平坦的纳米圆顶可以观察到吸附密度的提高，使得填充因子高于60％。通过增加纳米级区域的高度可以实现更高的填充因子(例如95％)，从而形成纳米级柱。
[0022]
如果亲和型传感器具有纳米圆顶，则这些纳米圆顶优选包括二氧化硅核心。然而，存在二氧化硅的替代品并且不被排除在外。可能的替代品包括金属(特别是：金)和聚合物。
[0023]
纳米级区域优选地具有对分析物具有选择性的表面功能化。在此上下文中，“选择性功能化”是指由特定受体介导的溶液中物种与表面之间的相互作用(例如生物素/抗生物素蛋白相互作用或抗原/抗体相互作用)。
[0024]
纳米级区域优选具有包括在从40至170nm的范围内的平均直径。
[0025]
纳米级区域优选地被布置成六方点阵(也称为“三角点阵”)，其中每个点阵点具有
6个最近邻点，这些最近邻点以约60
°
的角度隔开并且位于与所考虑的点阵点的相同距离处。应当注意，六方点阵在实践中可能具有不规则部分或缺陷。除了相隔开的缺陷，这些缺陷可以将点阵结构分成晶粒，这些晶粒本身具有基本规则的构型。优选地，点阵具有等于点阵间距的至少5倍、优选至少6、7、8、9或10倍的平均晶粒直径。
[0026]
优选地，当纳米级区域形成六方点阵时，最近邻的纳米级区域之间的平均中心距等于纳米级区域的平均直径的1.3与5倍之间(更优选1.4与4.7倍之间)。优选地，中心距表现出小于平均中心距的20％(更优选地：小于15％)的标准偏差。
[0027]
钝化区域可以包括防污层。例如，钝化区域可以包括抗蛋白质的聚乙二醇部分的层。
[0028]
在另一方面，本发明涉及一种作为如本文所述的亲和型传感器实现的石英晶体微天平芯片，其中界面对应于用于吸收质量的qcm表面。qcm芯片包括与电极接触的基底，用于通过压电效应在其中引起剪切变形。优选地，qcm芯片在具有耗散监测的qcm(qcm-d)中实现。
[0029]
根据一个优选实施例，qcm芯片作为亲和型生物传感器来实现，其中：
[0030]
ο纳米级区域包括从所述钝化区域突出的纳米圆顶；
[0031]
ο纳米级区域具有对分析物具有选择性的表面功能化，而钝化区域包括防污层，例如抗蛋白质的聚乙烯部分的层；
[0032]
ο纳米级区域具有包括在从40至170nm的范围内的平均直径；
[0033]
ο纳米级区域被布置成六方点阵；并且
[0034]
ο最近邻的纳米级区域之间的平均中心距等于纳米级区域的平均直径的1.5与5倍之间
[0035]
根据又一方面，本发明涉及一种感测待分析流体中的分析物的方法。
[0036]
该方法包括：
[0037]
ο提供作为如所述的亲和型生物传感器来实现的qcm芯片，
[0038]
ο使界面与待分析流体接触，从而允许分析物吸附在界面上，该吸附被限制于纳米级区域；以及
[0039]
ο测定所吸附的分析物的量(例如质量，摩尔)。
[0040]
优选地，在界面已经与待分析流体接触之后冲洗界面并且在冲洗之后测定所吸附的分析物的量。应当注意，所吸附的分析物的量的测定也可以在冲洗之前和/或期间进行。优选地，所吸附的分析物的量在吸附过程和冲洗期间连续或重复地测定，以便随时间推移监测被吸附物的(表观)量。
[0041]
优选地，为了充分受益于限制效应，纳米级区域的平均直径与分析物的大小的比率处于从3至50的范围内，优选从3至30的范围内，更优选从3至20的范围内，甚至更优选从5至15的范围内，并且还更优选从5至12的范围内。在此上下文中，分析物的大小被认为对应于其最大尺寸(直径)。如果分析物是较大化合物的部分，例如附着到较大的粒子或分子，则将化合物的最大尺寸算入上述比率的计算。
[0042]
感测可以在静态条件(基本上没有流体流动)或动态条件(流动流体)下进行。在静态条件下灵敏度可能会增加。
附图说明
[0043]
通过举例，现在将参考附图详细地描述本发明的优选的、非限制性的实施例，其中：
[0044]
图1：分别示出了未图案化和图案化的qcm芯片表面在au纳米粒子沉积之前(a)和c))和之后(b)、d))的afm图像以及与b)和d)中相同的表面的sem显微照片(e)和f))。
[0045]
图2：是分别沿图1a)、b)、c)和d)所示的线的高度轮廓表示。
[0046]
图3：是纳米点在金纳米粒子吸附之前和之后的高度分布的示意图。
[0047]
图4：示出了如通过qcm所测量的金纳米粒子从0.85mm浓度的悬浮液中吸附在图案化和未图案化的传感器表面上的密度(a)和动力学(b)的比较；图4(c)示出了通过qcm观察到的纳米粒子密度对应于通过sem获得的纳米粒子密度。
[0048]
图5：是表示吸附密度随悬浮液浓度变化的图。
[0049]
图6：是图5的在x轴上具有线性标度的图。
[0050]
图7：示出了通过sem获得的金涂覆基底上的二氧化硅纳米圆顶的图案(左侧)，通过afm线扫描获得的纳米圆顶的高度轮廓(右下)和更高分辨率的图案细节(右上)。
[0051]
图8：示出了通过qcm-d测量的bsa吸附曲线，(a)纳米图案化的传感器表面，其中sind之间的金区域用peg钝化，(b)未图案化的对照表面(由si制成)和(c)纳米图案化的比较表面，其中sind在si上，sind之间的硅区域没有钝化。
[0052]
图9：示出了在纳米图案化的界面(上曲线)和均质si界面(下曲线)上bcl-2抗体的吸附质量(通过qcm-d测量)的演变。
[0053]
图10：示出了在流动下沉积的au纳米粒子饱和时的质量密度随浓度的变化，通过可用于吸附的表面积进行归一化。
[0054]
图11：示出了图10中所吸附的au纳米粒子的密度，通过可用于吸附的表面和对应的表面覆盖率(作为拥塞极限(jamming limit)的百分比)进行归一化。
[0055]
图12：示出了不同的未图案化的界面和两个具有不同填充因子的纳米图案化的界面的au纳米粒子饱和时的吸附质量(没有通过可用表面积进行归一化)。
[0056]
图13：示出了图12的通过可用表面积进行归一化之后的吸附质量。
[0057]
图14：是纳米图案化的qcm传感器界面的示意性部分横截面透视图。
[0058]
图15：是包括携带对生物分子具有特异性的捕获抗体的纳米圆顶的二元图案的亲和型生物传感器的示意图。
[0059]
图16：是示出了与未图案化的金表面相比，山羊抗小鼠igg抗体(在pbs中24μg/ml)在具有纳米圆顶的图案化的表面上的吸附的图。
[0060]
图17：是示出了与未图案化的参考样品相比，目标生物分子在图15的亲和型生物传感器上的吸附的图。
[0061]
图18：是与图15的亲和型生物传感器的捕获抗体结合的目标生物分子的示意图。
[0062]
优选实施例和实例的详细说明
[0063]
图14示出了用于感测流体中的分析物的qcm传感器的细节。qcm传感器具有用于接触流体和吸附分析物的界面12。该界面由纳米级区域14和钝化区域16构成，分析物可以吸附在纳米级区域14上。纳米级区域14被钝化区域16彼此隔开，就像海中的岛屿。由于钝化，分析物在界面上的吸附被限制于纳米级区域14。纳米级区域具有从5至200nm的直径。优选
地，直径仅等于分析物的大小的几倍(例如最高达20倍)。纳米级区域的大小和密度被选择成使得纳米级区域一起具有等于整个界面12的表面积的至少10％的表面积。
[0064]
实例1：金纳米粒子在qcm传感器表面上的吸附
[0065]
可以在qcm芯片表面上使用自组装共聚物胶体模板来制备能够选择性吸附到纳米级区域上的二元纳米图案。关于这种允许跨越大的区域创建纳米级特征结构的高密度图案的方法的细节可见于例如yap,f.l.；thoniyot,p.；krishnan,s.；krishnamoorthy,s.的论文nanoparticle,“cluster arrays for high-performance sers through directed self-assembly on flat substrates and on optical fibers[纳米粒子，通过平坦基底和光纤上的定向自组装实现的高性能sers的簇阵列],”acs nano[美国化学学会纳米期刊]2012,6(3)以及nurmawati,m.h.；ajikumar,p.k.；renu,r.；valiyaveettil,s.的论文“hierarchical self-organization of nanomaterials into two-dimensional arrays using functional polymer scaffold[使用功能性聚合物支架将纳米材料分层自组织成二维阵列],”adv.funct.mater.[先进功能材料]2008,18(20),3213-3218。
[0066]
表面上的有机共聚物模板可以转化为能够在表面上明确定义的纳米级特征结构上进行受限制的、选择性吸附的图案。通过选择具有低的大小(高度、直径和间距)标准偏差的模板，特征结构(纳米级区域)的尺寸和特征结构密度(每单位面积的特征结构数量)将相对均匀。在实际实验中，可以证明不同几何变量(高度、直径和间距)的标准偏差低至5％-15％。这使得纳米级区域的表面积可以很容易地计算出来，并将此表面积与qcm测量值相关联。
[0067]
具体地，由于反胶束的核心内存在碱性吡啶基基团，将表面上的聚苯乙烯-嵌段-聚乙烯基吡啶(ps-b-pvp)反胶束阵列浸入中性ph的水中以产生正电荷阵列。关于此过程的细节，可见于meiners,j.c.；quintel-ritzi,a.；mlynek,j.；elbs,h.；krausch,g.的论文“adsorption of block-copolymer micelles from a selective solvent[从选择性溶剂中吸附嵌段-共聚物胶束]”,”macromolecules[大分子]1997,30(17),4945-4951。由于静电引力，带正电荷的特征结构可以将带负电荷的柠檬酸盐稳定化的金纳米粒子选择性地吸引到特征结构上。
[0068]
此方法用于研究与未图案化的带正电荷的对照表面相比，限制金纳米粒子(具有10.9
±
1.7nm的直径)的吸附对所得的特征结构密度和动力学的影响。使用qcm-d测量吸附密度和动力学。向金涂覆的qcm芯片上涂覆ps-b-p2vp(聚(苯乙烯-嵌段-2-乙烯基吡啶)，248kda-b-195kda，购自加拿大蒙特利尔的聚合物来源公司(polymer source inc.(montreal,canada))，在间二甲苯中0.5mg/ml)的反胶束膜。阵列的周期性可以通过蒸发速度来控制，而蒸发速度继而可以通过旋涂速度来改变。然后，在plasmatherm 790(美国佛罗里达州圣彼得堡(st.petersburg,fl,usa))中，使用20w和15sccm的气压，在氧等离子体气氛中将涂覆的表面暴露于反应离子蚀刻(rie)20-30s。然后测量金纳米粒子在如此制备的界面上的吸附。
[0069]
图1示出了未图案化(a)、b))和图案化(c)、d))的qcm芯片表面在au纳米粒子沉积之前(a)和c))和之后(b)、d))的afm图像。图1e)和f)分别示出了与b)和d)相同的表面的sem显微照片。使用sem和afm测量纳米粒子在纳米图案化的表面上的吸附终点，并且证实了吸附确实选择性地发生在反胶束特征结构上。
[0070]
图2示出了分别沿图1a)、b)、c)和d)所示的线的高度轮廓。图3示出了点在金纳米粒子吸附之前和之后的高度分布。可以看出，点的平均高度增加了约纳米粒子的平均直径。
[0071]
图4示出了如通过qcm所测量的金纳米粒子从0.85mm浓度(每升0.85毫摩尔的金纳米粒子)的悬浮液中吸附在图案化和未图案化的传感器表面上的密度(a)和动力学(b)的比较。使用sauerbrey方程将qcm传感器频率的降低转换为质量。图4(a)的曲线被归一化为相应的有效表面积。图4(b)的曲线是通过将吸附质量除以每个纳米粒子的(估计的)质量以得到纳米粒子的数量(np)并通过归一化为相应的饱和构型而获得的。
[0072]
图4(c)示出了通过qcm观察到的纳米粒子密度与通过sem获得的纳米粒子密度基本一致。将结果与在未图案化的对照表面(覆盖有均匀自组装4-氨基苯硫酚(4-atp)单层或均匀自组装4-乙烯基吡啶(4-vp)单层的金表面)上获得的结果进行进一步比较。
[0073]
将图案化的表面所获得的吸附曲线归一化为可用于吸附的有效表面积(即纳米圆顶的表面积)。归一化因子是由从afm和sem测量获得的每个纳米圆顶的表面积和纳米圆顶的密度(每单位面积的纳米圆顶数量)获得的。每个纳米圆顶的表面积是通过将纳米圆顶建模为半球而获得的，其中高度由afm测量，并且直径由sem测量。
[0074]
纳米图案的表面积表示为每纳米圆顶9800nm2，每μm2具有33个纳米圆顶。因此，纳米圆顶的表面积占总表面积的约33％。
[0075]
表1总结了在图案化的界面和未图案化(均匀)的对照表面上吸附au纳米粒子所获得的结果。来自qcm的值(吸附曲线)被标记为“(qcm)”，并通过sem进行交叉检查。基于sem的对应值在表1中被标记为“(sem)”。
[0076]
表1
[0077][0078][0079]
由于纳米图案化，纳米粒子饱和时的密度可以增加188％(基于sem显微照片计数：188％＝2350/1250)。此外，在85分钟内在图案化的表面上达到了95％(相对于饱和值)的覆盖率，而在未图案化的表面上则需要130分钟，因此证实了吸附动力学的明显增加。
[0080]
此外，观察到纳米图案化的传感器界面在浓度比未图案化的传感器界面低一个数量级时是敏感的(参见图5和图6)。在线性状态下，表面密度相对于分析物浓度的变化对于
纳米图案化的界面而言具有11.2ng/(μm
·
cm2)的斜率，而对于未图案化的界面而言，斜率仅为2.8ng/(μm
·
cm2))。这表示由于纳米图案而引起的灵敏度的6倍增加。尽管纳米图案的表面覆盖率较低(在实例中约33％)，但它们的纳米粒子密度与均匀表面的纳米粒子密度相比处于同等或更高水平。
[0081]
如果假设纳米粒子对传感器界面的吸附可以通过随机顺序吸附(rsa)过程进行建模，则最大表面覆盖率(理论极限，“拥塞极限”)为54.7％。纳米圆顶上的纳米粒子覆盖率饱和时接近28％(对应于拥塞极限的51％)，而在未图案化的界面的情况下，纳米粒子覆盖率仅为11％(对应于拥塞极限的19％)。
[0082]
实例1a：金纳米粒子在流动下在qcm传感器表面上的吸附
[0083]
实例1的实验是在静态条件下进行的。在流动条件下重复这些实验。如实例1所述，在qcm芯片上制备二元图案。对金纳米粒子具有亲和力的纳米级区域具有等于总界面表面积的33％的表面积。金纳米粒子从具有85nm与0.85mm之间的浓度的悬浮液中沉积。悬浮液的流速设置为10μl/min(微升/分钟)，传感器表面上方的腔室具有40μl的体积，并且温度在室温下保持恒定。通过qcm-d监测金纳米粒子的沉积。图10示出了饱和时的沉积质量密度随浓度的变化，通过可用于吸附的表面积进行归一化。可以看出，在流动下也可以获得比在未图案化的表面上显著更高的吸附密度。此结果表明微流体装置可以从本发明中受益。图11是基于图10并示出了所吸附的纳米粒子的密度，通过可用于吸附的表面和对应的表面覆盖率(作为拥塞极限的百分比)进行归一化。
[0084]
实例1b：纳米图案的填充因子的影响
[0085]
使用具有不同填充因子的纳米图案化的传感器界面，如前面实例中一样，对金纳米粒子的吸附进行qcm-d测量。第一个二元图案对应于实例1和实例1a中使用的二元图案，并且具有33％的填充因子。第二个纳米图案具有61％的填充因子：对金纳米粒子具有亲和力的纳米级区域与第一个二元图案的纳米级区域大小相同，但区域的密度增加了。据观察，当填充因子增加时，总体吸附(考虑整个传感器界面)增加。为了了解填充因子是否对具有亲和力的区域内的吸附密度有影响，将吸附质量通过可用于吸附的表面积进行归一化。未发现显著差异，这表明每个特征结构内所吸附的纳米粒子的密度对于测试的填充因子保持相同。当填充因子增加到61％时，纳米图案对吸附密度的积极影响仍然存在。这是值得注意的结果，因为它允许减少“无效”区域(此处不发生吸附)，而不会损害优先吸附到纳米图案上的效果。
[0086]
图12示出了不同的未图案化的界面和两个纳米图案化的界面饱和时的吸附质量，没有通过可用表面积进行归一化。具有33％的填充因子的纳米图案被标记为“d0.5”，而具有61％的填充因子的纳米图案被标记为“d1.4”。值得注意的是，d0.5纳米图案的占用面积(具有亲和力的区域相对于基底的垂直投影)等于16％。可以看出，具有61％的填充因子的纳米图案化的界面上的总体吸附质量，甚至超过了均匀界面上吸附的质量。图13示出了通过可用表面积进行归一化之后的饱和时的吸附质量。
[0087]
实例2：蛋白质吸附(bsa)
[0088]
虽然实例1证明了纳米级限制对纳米粒子静电附着的影响，但需要证实这种效果可以通过不同类型的吸附事件获得。在此实例中，研究了纳米级限制对两种不同生物分子牛血清白蛋白(bsa)和免疫球蛋白(igg)的物理吸附的影响。
[0089]
在第一步中，制造了可以将生物分子吸附限制于传感器界面的预定义区域的纳米图案。
[0090]
通过使用二氧化硅和金获得二元图案，而这一系列实验的未图案化的对照是裸露的二氧化硅表面。
[0091]
通过利用ps-b-pvp自组装，产生反胶束的六方点阵堆积，在qcm芯片的金表面上，形成了硬质材料对比图案：金表面上的二氧化硅纳米区域。将ps-b-pvp涂覆的金表面暴露于原硅酸四乙酯(teos)气氛6小时，以使硅酸盐扩散到反胶束中，并且由此获得二氧化硅纳米区域的六角点阵，这是反胶束图案的图像。该机制在cha,j.n.；zhang,y.；philip wong,h.s.；raoux,s.；rettner,c.；krupp,l.；deline,v.,“biomimetic approaches for fabricating high-density nanopatterned arrays[用于制造高密度纳米图案化阵列的仿生方法],”chem.mater.[材料化学]2007,19(4),839-843中得到更详细解释。teos的水解发生在胶束的亲核核心中(即在乙烯基吡啶域中)，基本上不改变聚苯乙烯外壳，并因此使得后者可以被氧等离子体去除。产生的二氧化硅纳米圆顶(从此处开始为sind)的形貌和顶视图在图7中示出。发现sind的高度等于35
±
5nm，并且直径等于40nm
±
4.3nm。
[0092]
为了防止bsa和igg的物理吸附，sind之间的金区域使用通过硫醇基团与金表面结合的抗蛋白质的聚乙二醇(peg)部分选择性地功能化。测试了抗蛋白质的peg涂覆的效率，并发现其等于80％。效率如下进行测量：
[0093][0094]
其中m
bsa on peg
是用抗蛋白质的分子(peg)功能化的表面上所吸附的bsa质量。m
bsa on au
是规则金表面(标准品)上所吸附的bsa质量。如上所测量的，钝化的效率优选地为至少80％。通过钝化金区域，生物分子的吸附被迫(几乎完全)发生在sind上，在此实例中，sind占界面的约17％(考虑其3d形状)。
[0095]
图8示出了在以下情况下通过qcm-d测量的bsa吸附曲线：
[0096]
a.纳米图案化的传感器表面，其中sind之间的金区域用peg钝化；
[0097]
b.未图案化的对照表面(由si制成)；以及
[0098]
c.在si上具有sind的纳米图案化的比较表面，sind之间的硅区域没有钝化。
[0099]
将图8中的吸附质量归一化以考虑分别可用于吸附的表面积。
[0100]
bsa的吸附测试如下进行：将bsa溶解在pbs(磷酸盐缓冲盐水)1mg/ml中，并且以10μl/min流速的速率流动1h(图8中的阶段i和ii)。在第二步中，使pbs流动60min以去除过量的bsa。未图案化的对照上的bsa吸附(图8，曲线b)给出了400ng/cm2的吸附密度，而在限制条件下，纳米图案化的传感器表面上的吸附密度等于180ng/cm2(图8，曲线a)。考虑到sind占传感器界面的约17％，基于未图案化的对照表面的值并考虑钝化层中的缺陷，人们会预期测量的吸附密度为65ng/cm2而不是180ng/cm2。因此，二元纳米图案在吸附密度方面引起了190％的增量。图8中的曲线c示出了bsa在没有钝化的硅基底上的sind上的吸附。如果考虑到表面积由于sind而相对于平坦基底增加，则会发现与未图案化的对照表面的吸附行为非常相似的吸附行为。这证明了具有对分析物具有亲和力的纳米级区域和围绕它们的钝化区域的二元图案的重要性。在冲洗阶段(图8，阶段iii)期间吸附质量的明显减少可以通过在阶段i和阶段ii期间存在松散结合的或处于离传感器表面的短距离处的bsa来解释。当将
流切换到缓冲溶液(阶段iii)时，这种“表观”质量消失。
[0101]
预期质量在考虑图案时会出现，并且计算如下：
[0102]mexp
＝m
unpattsfeature
[0103]
其中m
unpatt
是吸附在未图案化的对照上的质量，并且s
feature
是图案化的对照上可用于吸附的表面。然后将密度方面的增强百分比计算如下：
[0104][0105]
增强百分比如上所示，其中：m
patt
是通过实验获得的质量，m
unspec
是在钝化区域上非选择性累积的质量，s
bck
是钝化表面积，并且m
exp
是如上所定义的预期质量。
[0106]
实例3：bcl-2捕获抗体的物理吸附
[0107]
如实例2中一样制备纳米图案化的qcm传感器界面(在金涂覆基底上的二氧化硅纳米圆顶，暴露的金表面用防污层钝化)。作为比较，对具有裸露二氧化硅表面的qcm芯片进行了相同的实验。
[0108]
将人总bcl-2捕获抗体在pbs中复溶，然后稀释至27μg/ml备用。以10μl/min的流速将bcl-2捕获抗体带到测试表面，持续30min，然后将流切换到缓冲液20min。图9示出了纳米图案化的界面(上曲线)和均质si界面(下曲线)上的吸附质量(如通过qcm-d所测量)的演变。在阶段ii期间注射抗体。在阶段iii期间，将系统用缓冲溶液冲洗。
[0109]
在此实例中，品质因数与上述实例2中报告的相同。m
unpatt
等于450ng/cm2。m
patt
为185ng/cm2。如果考虑抗蛋白质层中的类似效率(85％效率)，则预期质量等于125ng/cm2。增强的百分比则为180％。抗蛋白质层的效率为m
unspec
计算如下：
[0110][0111]
其中m
unpatt
是未图案化的对照上的吸附质量，并且m
防污
是吸附在用防污部分特定功能化并针对bcl-2测试的对照上的质量。
[0112]
实例4
[0113]
图15示意性地示出了包括纳米圆顶22的二元图案的亲和型生物传感器20。纳米圆顶22之间的区域24覆盖有钝化层26，例如甲氧基聚乙二醇硫醇(sh-peg-ch3)层。纳米圆顶22携带对生物分子(例如小鼠igg)具有亲和力的捕获抗体28(例如山羊抗小鼠igg)。
[0114]
通过ps-b-pvp自组装在基底30(具有金涂层的qcm传感器)上制造纳米圆顶，从而形成反胶束的六方点阵堆积。然后在氧等离子体气氛中将表面暴露于反应离子蚀刻(rie)20-30s。然后使用气相沉积工艺用金薄层32涂覆所获得的表面。然后用钝化层涂覆金层32。
[0115]
纳米圆顶22上的钝化层的去除通过首先用pmma涂覆整个表面，接着在氧等离子体气氛中进行另一个rie步骤来实现。由于纳米圆顶之间的pmma层的厚度最高，因此在该区域中，钝化层一直受到pmma的保护，直到其完全蚀刻。结果，金涂层暴露在纳米圆顶上，但仍被纳米圆顶22之间的钝化层26覆盖。
[0116]
在该实例中，实现了33个特征结构/μm的特征结构密度，其中可用于吸附的表面为总界面表面的约21％。
[0117]
图16示出了与未图案化的金表面相比，山羊抗小鼠igg抗体(在pbs中24μg/ml)在
具有纳米圆顶的图案化的表面上的吸附的图。所得生物传感器20在图15中示意性示出。
[0118]
将图15的亲和型生物传感器针对小鼠igg(在pbs中25μg/ml)进行测试。与未图案化的参考样品相比，对应的吸附曲线图在图17中示出。图18示出了与捕获抗体28结合的靶分子34。
[0119]
实例中使用的材料
[0120]
金涂覆石英晶体(标称频率5mhz，at切割)购自瑞典耶尔费拉的石英专业公司(quartzpro(sweden))，并且在用丙酮和乙醇彻底清洁，接着在购自美国加利福尼亚州尔湾的杰莱特公司(jelight company inc.(irvine ca,usa))的紫外线臭氧清洁器中彻底清洁30min之后使用。
[0121]
聚(苯乙烯-嵌段-2-乙烯基吡啶)(ps-b-p2vp)(248kda-b-195kda)购自加拿大蒙特利尔的聚合物来源公司。
[0122]
4-氨基苯硫酚(4-atp)、4-硫醇吡啶(4-tp)、原硅酸四乙酯(teos)和四氯金(iii)酸(haucl4·
3h2o)购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)。
[0123]
光谱级间二甲苯、乙醇和丙酮也购自西格玛奥德里奇公司。
[0124]
牛血清白蛋白(bsa)也购自西格玛奥德里奇公司。
[0125]
磷酸盐缓冲液(pbs)、人总bcl-2抗体购自美国明尼苏达州明尼阿波里斯市的r&d系统公司(r&d system(minneapolis,mn,usa))。
[0126]
不同长度和大小的聚乙二醇硫醇(peg-硫醇)购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的broadpharm公司(broadpharm(san diego,ca,usa))：具有-oh官能团的peg3(mw＝166.2)和具有-cooh官能团的peg12(mw＝634.8)。
[0127]
实例中使用的方法
[0128]
通过将金涂覆的石英晶体浸入4-atp溶液(在乙醇中5mm)中典型地》16h，然后洗涤并吹干，来制备未图案化的对照。
[0129]
胶束模板通过meiners,j.c.；quintel-ritzi,a.；mlynek,j.；elbs,h.；krausch,g.的论文“adsorption of block-copolymer micelles from a selective solvent[从选择性溶剂中吸附嵌段-共聚物胶束]”,”macromolecules[大分子]1997,30(17),4945-4951中报道的方法获得。简而言之，将ps-b-p2vp(在间二甲苯中0.5mg/ml)涂覆在qcm芯片上。阵列的周期性通过蒸发速度来控制，而蒸发速度继而通过旋涂速度来改变。然后，使用plasmatherm790(美国佛罗里达州圣彼得堡(st.petersburg,fl,usa))，使用20w和15sccm的气压，在氧等离子体气氛中将表面暴露于反应离子蚀刻(rie)20-30s。
[0130]
使用柠檬酸钠作为还原剂制备10nm直径的金纳米粒子。
[0131]
金基底上的二氧化硅粒子：ps-b-p2vp图案在特定表面上形成，然后在60℃的烘箱中在teos和水(各1ml)存在下在干燥器中放置不同的时间(1-24h)。一旦将样品从干燥器中取出，将它们暴露于o2等离子体3分钟以确保完全去除构成壳的聚合物，从而获得具有与原始模板相匹配的周期性的sio2粒子阵列。
[0132]
蛋白质物理吸附的表面准备：如上所述获得金基底上的二氧化硅粒子。然后将表面浸渍在聚乙二醇硫醇溶液(在水中5mm)中4h，直到未被二氧化硅粒子占据的样品的表面被peg分子占据并使得具有蛋白质抗性。
[0133]
蛋白质物理吸附：在将生物分子引入流中之前，使系统稳定一段可调的时间，直到
达到良好的基线。将牛血清白蛋白(bsa)溶解在pbs(1％)中并在表面上物理吸附1h，然后用缓冲液冲洗表面直到获得稳定的信号(缓冲液流动最多达60min)。典型流速为10μl/min。将人总bcl-2捕获抗体在pbs中复溶，然后稀释至27μg/ml备用。将bcl-2捕获抗体以10μl/min运行30min，然后将流切换到缓冲溶液20min。
[0134]
图案的表征：使用法国巴黎的布鲁克系统公司(bruker system(paris,france))的innova和来自瑞士纳沙泰尔的纳米传感器公司(nanosensors(neuchatel,switzerland))的铝涂覆硅探头(10-130n/m)以敲击模式通过原子力显微镜来研究纳米图案。通过使用helios 650fib-sem(来自美国俄勒冈州希尔斯伯勒)典型地在2-5kv加速电压和25pa电子束电流下获得扫描电子显微镜显微照片。qcm测量是使用从瑞典哥德堡百欧林科技公司(biolin scientific ab(gothenburg,sweden)获得并与流动模块组合使用的带耗散模块的石英晶体微天平(qsense explorer，qcm-d)进行的，该流动模块体积为40μl，用于分析物与基底之间的相互作用。使用sauerbrey方程提取与表面覆盖率相关的值：δm＝-cδf/n，其中c是相对于传感器特性的常数(c＝17.7ng/(hz/cm2))，n是奇泛频数(对于所有呈现的数据均取n＝9)，并且δf是频移。仅当传感器及其上方的层是刚性的时，才可能允许如上所述计算吸附质量。在数值项中，要求是：δd/(δf/i)《0.4
·
10-6
hz-1
。在本文提出的实验中全部都满足了这一要求。
[0135]
尽管本文已经详细描述了具体实施例和实例，但本领域技术人员将理解，根据本披露的全部教导，可以对这些细节进行各种修改和替换。因此，所披露的特定布置仅是说明性的，并不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书及其任何和所有等同物的全部范围给出。