指示剂化合物、包括指示剂化合物的装置及其制备和使用方法与流程

指示剂化合物、包括指示剂化合物的装置及其制备和使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年5月1日提交的美国临时申请第63/019126号题为“指示剂化合物、包括指示剂化合物的装置及其制备和使用方法”和于2019年10月25日提交的美国临时申请第62/926323号题为“指示剂化合物及其制备和使用方法”的优先权，其中每一个均通过引用整体并入本文。
3.对序列表的参考
4.经由efs-web作为ascii文本文件提交的序列表在此根据35u.s.c.
§
1.52(e).通过引用并入本文。序列表ascii文本文件的名称为cerca161wo_st25.txt，ascii文本文件的创建日期为2020年10月17日，ascii文本文件大小为4.41mb。
技术领域
5.本公开一般涉及化合物、组合物、包括此类化合物和组合物的装置、制备前述中的任一个的方法，以及使用它们来检测分析物的方法。在一些实施方式中，分析物是葡萄糖。一些实施方式涉及使用那些化合物、组合物和/或装置来诊断和/或监测糖尿病患者的血糖的方法。


背景技术：

6.相关技术描述
7.识别和了解与糖尿病相关的风险因素对于制定和评估有效的干预策略非常重要。由于缺少正常的调节机制，因此糖尿病患者被鼓励通过调节的生活方式来努力控制血糖，该方法侧重于饮食控制、运动和血糖自测，并及时施用胰岛素或口服降糖药物。侵入性形式的自测可能会很痛苦，并且通常会被大多数糖尿病患者抵制。


技术实现要素：

8.在一些实施方式中，公开了指示剂化合物和包括指示剂化合物的装置。在一些实施方式中，指示剂化合物是融合蛋白。在一些实施方式中，指示剂化合物是或包括分析物结合化合物(例如，分析物结合蛋白)和/或包括分析物结合结构域(例如，分析物结合蛋白的结合结构域)。在一些实施方式中，分析物是糖。在一些实施方式中，分析物是葡萄糖。
9.一些实施方式涉及一种用于检测受试者体内是否存在分析物的装置。在一些实施方式中，装置包括透光材料。在一些实施方式中，透光材料配置为接收来自光源的激发波长的光。在一些实施方式中，装置包括波导。在一些实施方式中，波导包括围绕芯材料的包层。在一些实施方式中，波导配置为经由波导的近端接收激发波长的光。在一些实施方式中，波导配置为沿着波导将激发波长的光传输到波导的远端。在一些实施方式中，装置包括指示剂化合物。在一些实施方式中，指示剂化合物包括融合蛋白。在一些实施方式中，指示剂化合物设置在波导内。在一些实施方式中，指示剂化合物配置为接收激发波长。在一些实施方
式中，融合蛋白包括发光蛋白结构域和/或分析物结合蛋白结构域。在一些实施方式中，当分析物结合分析物结合蛋白结构域时，指示剂化合物经历从第一构象到第二构象的构象变化。在一些实施方式中，当处于第二构象时，指示剂化合物配置为接收激发波长并发射发光信号。在一些实施方式中，发光信号由波导接收并传输到透光材料。在一些实施方式中，透光材料配置为将发光信号递送到发光检测器。
10.在一些实施方式中，装置还包括将装置粘附到受试者的皮肤上的粘合层。在一些实施方式中，波导的远端配置为穿透受试者的皮肤。在一些实施方式中，波导的远端位于受试者的真皮中。
11.在一些实施方式中，波导还包括在包层上的保护性聚合物层。
12.在一些实施方式中，指示剂化合物分布在波导的芯中、在波导的芯和包层的界面处、在波导的包层中、在波导的包层的表面处，或上述任何一项的组合。
13.在一些实施方式中，发光蛋白是拆分发光蛋白。在一些实施方式中，指示剂化合物与seq id no:3-13或16-20中的一个或多个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。在一些实施方式中，分析物结合蛋白结构域是周质蛋白的结构域。在一些实施方式中，分析物结合结构域与seq id no:2、15、122-221或824-1746中的一个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。在一些实施方式中，分析物结合结构域的连续100个氨基酸部分与seq id no:2、15、122-221或824-1746中的一个的连续100个氨基酸部分具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
14.在一些实施方式中，发光蛋白结构域是荧光蛋白的结构域。在一些实施方式中，发光蛋白结构域与seq id no:1、14、34-121或222-823中的一个或多个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。在一些实施方式中，发光蛋白结构域的连续100个氨基酸部分与seq id no:1、14、34-121或222-823中的一个的连续100个氨基酸部分具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
15.一些实施方式涉及一种用于检测受试者体内是否存在葡萄糖的装置。在一些实施方式中，装置包括透光材料基体材料，配置为接收来自光源的激发波长的光。在一些实施方式中，装置包括指示剂化合物，包括拆分融合蛋白。在一些实施方式中，指示剂化合物设置在基体材料内。在一些实施方式中，指示剂化合物配置为接收激发波长。在一些实施方式中，融合蛋白包括发光蛋白结构域和/或葡萄糖结合蛋白结构域。在一些实施方式中，当葡萄糖结合葡萄糖结合蛋白结构域时，指示剂化合物经历从第一构象到第二构象的构象变化。在一些实施方式中，当处于第二构象时，指示剂化合物配置为接收激发波长并发射发光信号。在一些实施方式中，发光信号通过透光材料传输到发光检测器。
16.在一些实施方式中，装置包括发光检测器。在一些实施方式中，装置配置为植入皮肤的表面之下。
17.在一些实施方式中，基体材料是波导的一部分。在一些实施方式中，指示剂化合物分布在波导的芯中、在波导的芯和包层的界面处、在波导的包层中、在波导的包层的表面处，或上述任何一项的组合。
18.在一些实施方式中，发光蛋白是拆分发光蛋白。在一些实施方式中，葡萄糖结合蛋白结构域是周质蛋白的结构域。在一些实施方式中，葡萄糖结合结构域与seq id no:2、15、122-221或1703-1746中的一个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。在一些实施方
式中，葡萄糖结合结构域的连续100个氨基酸部分与seq id no:2、15、122-221或1703-1746中的一个的连续100个氨基酸部分具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
19.在一些实施方式中，发光蛋白结构域是荧光蛋白的结构域。在一些实施方式中，发光蛋白结构域与seq id no:1、14、34-121或222-823中的一个或多个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。在一些实施方式中，发光蛋白结构域的连续100个氨基酸部分与seq id no:1、14、34-121或222-823中的一个的连续100个氨基酸部分具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
20.在一些实施方式中，指示剂化合物与seq id no:3-13或16-20中的一个或多个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
21.一些实施方式涉及一种用于检测患者体内的分析物的系统。在一些实施方式中，系统包括提供光源的发光装置。在一些实施方式中，系统包括发光检测器。在一些实施方式中，发光检测器是发光装置的一部分。在一些实施方式中，由发光检测器接收的系统数据被传输到手持装置。在一些实施方式中，系统包括手持装置。
22.一些实施方式涉及一种指示剂化合物。在一些实施方式中，指示剂化合物包括发光蛋白结构域。在一些实施方式中，指示剂化合物包括分析物结合蛋白结构域。在一些实施方式中，指示剂化合物配置为经由结合蛋白结构域结合分析物。在一些实施方式中，指示剂化合物配置为当分析物被分析物结合蛋白结构域结合时经历从第一构象到第二构象的构象变化。在一些实施方式中，当处于第二构象时，指示剂化合物配置为接收激发波长并发射发光信号。
23.在一些实施方式中，指示剂化合物包括分析物结合结构域的连续100个氨基酸部分与seq id no:2、15、122-221或824-1746中的一个的连续100个氨基酸部分具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
24.在一些实施方式中，发光蛋白结构域的连续100个氨基酸部分与seq id no:1、14、34-121或222-823中的一个的连续100个氨基酸部分具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
25.在一些实施方式中，指示剂化合物包括发光蛋白是拆分发光蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白结构域是荧光蛋白结构域。
26.在一些实施方式中，分析物结合结构域与seq id no:2、15、122-221或824-1746中的一个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。在一些实施方式中，分析物结合蛋白结构域是周质蛋白糖结合结构域。
27.在一些实施方式中，发光蛋白结构域与seq id no:1、14、34-121或222-823中的一个或多个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。在一些实施方式中，发光蛋白结构域与seq id no:3-13或16-20中的一个或多个具有80％至100％的同一性、同源性或相似性。
28.在一些实施方式中，指示剂化合物由与seq id no:21-33中的一个或多个具有80％至100％同一性、同源性或相似性的dna编码。
29.一些实施方式涉及一种适合施用于人的组合物，包括如在本文中任何地方公开的指示剂化合物。
30.一些实施方式涉及一种制备如在本文中任何地方公开的指示剂化合物的方法。在
一些实施方式中，方法包括在重组宿主细胞中表达由载体编码的指示剂化合物，并且从重组宿主细胞中分离化合物。在一些实施方式中，载体包括编码发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段的核酸序列。在一些实施方式中，载体包括编码糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分的核酸序列。
31.在一些实施方式中，载体还包括信号序列。在一些实施方式中，重组宿主细胞选自昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞、动物细胞和转基因动物细胞。在一些实施方式中，重组宿主细胞为大肠杆菌细胞、cho细胞、hek293细胞等。
32.一些实施方式涉及一种用于检测患者体内的葡萄糖的方法。在一些实施方式中，方法包括将如在本文中任何地方公开的指示剂化合物施用于患者和/或将包括化合物的组合物施用于患者。在一些实施方式中，方法包括基于指示剂化合物的发光变化来量化患者体内的葡萄糖水平。
33.在一些实施方式中，使用细胞将指示剂化合物施用于患者。在一些实施方式中，细胞是患者自体的。在一些实施方式中，细胞包括具有编码指示剂化合物的区域的dna。在一些实施方式中，细胞是患者接收的皮肤移植物的一部分。在一些实施方式中，细胞是角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞、巨噬细胞、上皮细胞或红细胞。
34.在一些实施方式中，患者是人。
35.在一些实施方式中，方法包括用具有第一最大波长的光照射指示剂化合物并且检测在第二最大波长处的光发射。
36.一些实施方式涉及一种用于检测患者体内的分析物的方法。在一些实施方式中，方法包括选择需要分析物监测的患者。在一些实施方式中，方法包括将如在本文中任何地方公开的装置插入患者或将装置附接到患者。在一些实施方式中，方法包括将激发波长的光应用于指示剂化合物。在一些实施方式中，方法包括从装置收集发光信号。在一些实施方式中，方法包括将发光信号与指示未结合分析物的指示剂化合物的参考信号进行比较。在一些实施方式中，方法包括将发光信号的量量化为分析物的浓度。
37.在一些实施方式中，分析物结合化合物的分析物结合结构域包括糖结合蛋白、糖结合蛋白的糖结合部分或片段和/或糖结合蛋白或糖结合蛋白的糖结合部分或片段的模拟物，或主要由糖结合蛋白、糖结合蛋白的糖结合部分或片段和/或糖结合蛋白或糖结合蛋白的糖结合部分或片段的模拟物组成，或由糖结合蛋白、糖结合蛋白的糖结合部分或片段和/或糖结合蛋白或糖结合蛋白的糖结合部分或片段的模拟物组成。在一些实施方式中，糖结合蛋白、糖结合蛋白的糖结合部分或片段和/或糖结合蛋白或糖结合蛋白的糖结合部分或片段的模拟物与葡萄糖结合。在一些实施方式中，分析物结合化合物的分析物结合结构域包括葡萄糖结合蛋白、葡萄糖结合蛋白的葡萄糖结合部分或片段和/或葡萄糖结合蛋白的模拟物(例如，肽模拟物，旨在模拟葡萄糖结合蛋白或肽)、或葡萄糖结合蛋白的葡萄糖结合部分或片段的模拟物，或主要由葡萄糖结合蛋白、葡萄糖结合蛋白的葡萄糖结合部分或片段和/或葡萄糖结合蛋白的模拟物(例如，肽模拟物，旨在模拟葡萄糖结合蛋白或肽)、或葡萄糖结合蛋白的葡萄糖结合部分或片段的模拟物组成，或由葡萄糖结合蛋白、葡萄糖结合蛋白的葡萄糖结合部分或片段和/或葡萄糖结合蛋白的模拟物(例如，肽模拟物，旨在模拟葡萄糖结合蛋白或肽)、或葡萄糖结合蛋白的葡萄糖结合部分或片段的模拟物组成。在一些实施方式中，指示剂化合物还包括可检测结构域(例如，发光结构域)，其包括发光蛋白和/
no:34-121中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个的连续部分具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段是至少80％至100％与seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个的连续部分具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个的连续部分等于或至少约为200、150、100、80、60、50、40、30、20或10个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个的连续部分任选地具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些实施方式中，氨基酸差异包括插入、缺失和/或取代。在一些实施方式中，取代可包括将氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个取代为氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个。在一些实施方式中，在发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段被拆分的情况下(如在本文中别处公开的)，发光蛋白和/或其片段的两个或更多个连续部分可以与seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个的连续部分对齐。
42.在一些实施方式中，核酸序列翻译成具有seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121的序列的一种或多种发光蛋白。设想多个核酸序列可以转化成在本文中公开的发光蛋白。在一些实施方式中，核酸序列的不同之处在于编码相同氨基酸的密码子。在一些实施方式中，核酸序列针对某种生物(诸如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、山羊、猪、鸡、真菌、酵母、细菌或原生动物)进行密码子优化。
43.在一些实施方式中，发光蛋白或发光蛋白的发光片段是、获得或衍生自发光生物。在一些实施方式中，发光蛋白或发光蛋白的发光片段是、获得或衍生自荧光生物。在一些实施方式中，发光蛋白或发光蛋白的发光片段是、获得或衍生自多管水母(aequorea)、维多利亚多管水母(aequorea victoria)、大型多管水母(aequorea macrodactyla)、墨绿多管水母(aequorea coerulescens)、entacmaea、奶嘴海葵(entacmaea quadricolor)、anemonia、anemonia manajo、anemonia sulcate、鹿角珊瑚属(acropora)、羽珊瑚属(clavularia)、盔形珊瑚属(galaxea)、丛生盔形珊瑚(galaxea fascicularis)、花群海葵属(zoanthus)、pontellina、pontellina plumata、phialidium、verrillofungia、verrillofungia concinna、圆盘海葵(discosoma)、anthoatecata、heteractis、紫点海葵(heteractis crispa)、actinia、等指海葵(actinia equina)、trachyphyllia、八字脑珊瑚(trachyphyllia geoffroyi)、favia、黄癣蜂巢珊瑚(favia favus)、lobophyllia、联合瓣叶珊瑚(lobophyllia hemprichii)或echinophyllia。在一些实施方式中，发光蛋白或发光蛋白的发光片段是、获得或衍生自哺乳动物蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白或发光蛋白的发光片段是、获得或衍生自人蛋白。
44.在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是、获得或衍生自细菌蛋白。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是、获得或衍生自变形菌门蛋白质。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是、获得或衍生自大肠杆菌蛋白。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分
是周质蛋白或其糖结合部分。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是、获得或衍生自哺乳动物蛋白。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是、获得或衍生自人蛋白。
45.在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个相同和/或与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是至少80％至100％与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个相同和/或与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分(和/或糖结合蛋白的连续部分和/或糖结合蛋白的糖结合部分)是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是至少80％至100％与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分等于或至少约为300、250、200、150、100、80、60、50、40、30、20或10个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分任选地具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些实施方式中，氨基酸差异包括插入、缺失和/或取代。在一些实施方式中，取代可包括将氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个取代为氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个。在一些实施方式中，在糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分被拆分的情况下，糖结合蛋白的两个或更多个连续部分和/或糖结合蛋白的糖结合部分可以与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分对齐。
46.在一些实施方式中，指示剂化合物是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个相同和/或与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物是至少80％至100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个相同和/或与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个的连续部分具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分是至少80％至100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:3-13和16-20中的一
个或多个的连续部分具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分是等于或至少约为500、450、400、350、300、250、200、150、100、80、60、50或40个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的化合物的一部分。在一些实施方式中，seq id nos:3-13和16-20的连续部分是等于或至少约为500、450、400、350、300、250、200、150、100、80、60、50或40个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的那些蛋白质的一部分。在一些实施方式中，seq id no:3-13或seq id no:16-20中的一个或多个的连续部分任选地具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些实施方式中，氨基酸差异包括插入、缺失和/或取代。在一些实施方式中，取代可包括将氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个取代为氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个。在一些实施方式中，指示剂化合物的两个或更多个连续部分可以与seq id nos:3-13和16-20中的一个或多个的连续部分对齐。
47.在一些实施方式中，指示剂化合物由具有区域的dna编码，该区域与seq id no:21-33中的一个或多个是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同和/或与seq id no:21-33中的一个或多个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物由具有区域的dna编码，该区域与seq id no:21-33中的一个或多个是至少80％至100％相同和/或与seq id no:21-33中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，编码指示剂化合物的dna的连续部分是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％与seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，编码指示剂化合物的dna的连续部分是至少80％至100％与seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分相同和/或与seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，编码指示剂化合物的dna的连续部分等于或至少约为1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、150、100、80、60、50或40个核苷酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分是等于或至少约为1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、150、100、80、60、50或40个核苷酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的那些dna的一部分。
48.在一些实施方式中，使用细胞将指示剂化合物施用于患者。在一些实施方式中，细胞与患者同种异体。在一些实施方式中，细胞是患者自体的。在一些实施方式中，细胞包括具有区域的dna，该区域等于或至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与seq id no:21-33中的一个或多个相同(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，细胞包括具有区域的dna，该区域与seq id no:21-33中的一个或多个是至少80％至100％相同。在一些实施方式中，细胞是患者接收的皮肤移植物的一部分。在一些实施方式中，细胞是患者接收的合成皮肤移植物的一部分。在一些实施方式中，细胞是角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞、巨噬细胞、上皮细胞或红细胞。
49.一些实施方式中，分析物是nadph、h
+
(ph)、重金属、钙、钠、钾、氯化物、铁、铜、锌、
镁、磷、尿素、肌酐、磷酸盐、o2、co2、碳酸氢盐、胆固醇、高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)、甘油三酯、c反应蛋白、促甲状腺激素(tsh)、甲状旁腺激素(pth)、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白、胆红素、甲胎蛋白(afp)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)、癌胚抗原、前列腺特异性抗原(psa)、前列腺酸性磷酸酶(pap)、降钙素、睾酮、双氢睾酮、黄体酮、促卵泡激素(fsh)、黄体生成素(lh)、雌二醇、皮质醇、生长激素、醛固酮、维生素a、维生素b、维生素c、维生素d、维生素e、铅、乙醇、乳糖脱氢酶(ldh)或淀粉酶，或它们的任何组合，以及分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分对该分析物是特异性的。
50.在一些实施方式中，指示剂化合物包括多种分析物结合蛋白(和/或其模拟物)和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分，其中每种分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分是特定于一种独特的分析物。在一些实施方式中，指示剂化合物包括多种分析物结合蛋白(和/或其模拟物)和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分，其中每种分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分是特定于常见的分析物。在一些实施方式中，指示剂化合物还包括多种发光蛋白和/或发光蛋白的发光片段，其中每个发光蛋白和/或发光蛋白的发光片段可操作地连接到第一分析物结合蛋白或分析物结合蛋白的分析物结合部分，使得每个发光蛋白和/或发光蛋白的发光片段配置为仅在分析物与第一分析物结合蛋白或分析物结合蛋白的分析物结合部分结合时而不在当第二分析物与第二分析物结合蛋白或分析物结合蛋白的分析物结合部分结合时经历构象变化。在其它实施方式中，多个分析物中的每个发光蛋白和/或发光蛋白的发光片段配置为当多个分析物中的至少一个结合到各自的分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分时经历构象变化。
51.在一些实施方式中，指示剂化合物包括发光染料和分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分，其中指示剂化合物配置为当分析物被分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分结合时，经历从第一构象到第二构象的构象变化，并且由于发光染料的发光，指示剂化合物在处于第二构象时的发光不同于处于第一构象时的发光。在一些实施方式中，发光染料用于共振能量转移(fret)配置。
52.在一些实施方式中，患者是动物。在一些实施方式中，患者是哺乳动物。在一些实施方式中，患者是人。
53.在一些实施方式中，方法包括用具有第一最大波长的光照射指示剂化合物并且检测在第二最大波长处的光发射。
54.一些实施方式涉及如在本文中别处公开的指示剂化合物。例如，在一些实施方式中，指示化合物包含发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段。在一些实施方式中，指示剂化合物包括糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分。在一些实施方式中，指示剂化合物配置为在糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分处结合葡萄糖。在一些实施方式中，指示剂化合物配置成当葡萄糖结合在糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分时经历从第一构象到第二构象的构象变化。在一些实施方式中，指示剂化合物在处于第二构象时的光吸收或发射不同于在处于第一构象时的光吸收或发射。在一些实施方式中，指示剂化合物配置用于体内使用。
55.一些实施方式涉及一种适合施用于人的组合物，包括如在本文中别处公开的指示
剂化合物。
56.一些实施方式涉及一种制备如在本文中别处公开的指示剂化合物的方法，包括括在重组宿主细胞中表达由载体编码的指示剂化合物，并且从重组宿主细胞中分离化合物。在一些实施方式中，载体包括以下中的一种或多种:编码发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段的核酸序列；以及编码糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分的核酸序列。在一些实施方式中，载体还包括信号序列。在一些实施方式中，重组宿主细胞选自昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞、动物细胞系和转基因动物细胞。在一些实施方式中，重组宿主细胞为大肠杆菌细胞，cho细胞或hek293细胞等。
57.在一些实施方式中，提供了用于确定动物体内葡萄糖的存在或浓度的可植入葡萄糖传感器。在一些实施方式中，传感器可以包括具有围绕传感器主体的外表面的传感器主体。在一些实施方式中，传感器可以包括在所述传感器主体中的辐射源，其在所述传感器主体内发射辐射。在一些实施方式中，传感器包括如在本文中公开的指示剂化合物。在一些实施方式中，指示剂化合物受动物体内葡萄糖的存在或浓度影响。在一些实施方式中，传感器可以包括位于传感器主体中的光敏元件，定位成接收传感器主体内的辐射，其中光敏元件配置为响应于从指示剂化合物接收的辐射发射信号，该信号指示动物体内葡萄糖的存在或浓度。在一些实施方式中，传感器可以包括至少部分地围绕所述指示剂元件的保护屏障，该屏障包括银、钯、铂、锰或合金，或含金合金，或它们的组合。
58.一些实施方式涉及一种用于检测患者(例如糖尿病患者)体内葡萄糖的方法，包括向患者施用指示剂化合物。在一些实施方式中，指示剂化合物是融合蛋白，其包括：发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段；以及糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分；其中糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分配置为结合葡萄糖；其中，当葡萄糖被糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分结合时，指示剂化合物经历从第一构象到第二构象的构象变化；其中，指示剂化合物在处于第二构象时的发光不同于处于第一构象时的发光。
59.在一些实施方式中，方法进一步包括基于处于第二构象时的指示剂化合物的发光变化来量化患者体内的葡萄糖水平。
60.在一些实施方式中，发光蛋白是拆分发光蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白是荧光蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段是至少80％至100％与seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个相同和/或与seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是周质蛋白或其糖结合部分。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是至少80％至100％与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个相同和/或与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。
61.在一些实施方式中，指示剂化合物是至少80％至100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个相同和/或与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物由具有区域的dna编码，该区域与seq id no:21-33中的一个或多个是至少80％至100％相同和/或与seq id no:21-33中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。
62.在一些实施方式中，使用细胞将指示剂化合物施用于患者。在一些实施方式中，细胞是患者自体的。在一些实施方式中，细胞包括具有区域的dna，该区域与seq id no:21-33中的一个或多个是至少80％至100％相同。在一些实施方式中，细胞是患者接收的皮肤移植物的一部分。在一些实施方式中，细胞是角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞、巨噬细胞、上皮细胞或红细胞。
63.在一些实施方式中，患者是人。
64.在一些实施方式中，用具有第一最大波长的光照射指示剂化合物并且检测在第二最大波长处的光发射。
65.一些实施方式涉及一种指示剂化合物，其包括：发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段；以及糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分；其中，指示剂化合物配置为在糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分处结合葡萄糖；其中，指示剂化合物配置为当葡萄糖被糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分结合时，经历从第一构象到第二构象的构象变化；其中，指示剂化合物在处于第二构象时的发光不同于处于第一构象时的发光。
66.在一些实施方式中，指示剂化合物配置用于体内使用。在一些实施方式中，发光蛋白是拆分发光蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白是荧光蛋白。
67.在一些实施方式中，发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段是至少80％至100％与seq id no:1、seq id no:14或seq id no:34-121中的一个或多个相同和/或与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。
68.在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是周质蛋白或其糖结合部分。
69.在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分是至少80％至100％与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个相同和/或与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。
70.在一些实施方式中，指示剂化合物是至少80％至100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个相同和/或与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。
71.在一些实施方式中，指示剂化合物由具有区域的dna编码，该区域与seq id no:21-33中的一个或多个是至少80％至100％相同和/或与seq id no:21-33中的一个或多个具有至少80％至100％的同源性或相似性。
72.一些实施方式涉及一种适合施用于人的、包括如在本文中公开的化合物的组合物。
73.一些实施方式涉及一种制备指示剂化合物的方法，包括在重组宿主细胞中表达由载体编码的指示剂化合物，并且从重组宿主细胞中分离化合物。
74.在一些实施方式中，载体包括：编码发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段的核酸序列；以及编码糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分的核酸序列。在一些实施方式中，载体还包括信号序列。
75.在一些实施方式中，重组宿主细胞选自昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞、动物细胞和转基因动物细胞。在一些实施方式中，重组宿主细胞为大肠杆菌细胞、cho细胞或hek293
细胞等。
76.一些实施方式涉及一种用于检测患者体内的分析物的方法，包括：向患者施用指示剂化合物，其中指示剂化合物是融合蛋白，其包括：发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段；以及分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分；其中，当分析物被分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分结合时，指示剂化合物经历从第一构象到第二构象的构象变化；其中，指示剂化合物在处于第二构象时的发光不同于处于第一构象时的发光。
77.在一些实施方式中，基于处于第二构象时的指示剂化合物的发光变化来量化患者体内的分析物水平。
78.在一些实施方式中，发光蛋白是拆分发光蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白是荧光蛋白。在一些实施方式中，使用细胞将指示剂化合物施用于患者。在一些实施方式中，细胞是患者自体的。在一些实施方式中，细胞是患者接收的皮肤移植物的一部分。在一些实施方式中，细胞是角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞、巨噬细胞、上皮细胞或红细胞。
79.在一些实施方式中，患者是人。
80.在一些实施方式中，方法还包括用具有第一最大波长的光照射指示剂化合物并且检测在第二最大波长处的光发射。
81.一些实施方式涉及一种指示剂化合物。在一些实施方式中，指示剂化合物包括发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段。在一些实施方式中，指示剂化合物包括分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分。在一些实施方式中，指示剂化合物配置为当分析物被分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分结合时，经历从第一构象到第二构象的构象变化。在一些实施方式中，指示剂化合物在处于第二构象时的发光不同于处于第一构象时的发光。在一些实施方式中，指示剂化合物配置用于体内使用。在一些实施方式中，发光蛋白是拆分发光蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白是荧光蛋白。
82.一些实施方式涉及一种适合施用于人的、包括如在本文中别处公开的指示剂化合物的组合物。
83.一些实施方式涉及一种制备如在本文中任何地方公开的化合物的方法，包括在重组宿主细胞中表达由载体编码的指示剂化合物，并且从重组宿主细胞中分离化合物。
84.在一些实施方式中，载体包括：编码发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段的核酸序列；以及编码分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的分析物结合部分的核酸序列。在一些实施方式中，载体还包括信号序列。在一些实施方式中，重组宿主细胞选自昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞、动物细胞和转基因动物细胞。
85.在一些实施方式中，对于在本文中的任何装置、指示剂化合物、组合物或方法，分析物是糖、葡萄糖、nadph、h
+
(ph)、重金属、钙、钠、钾、氯化物、铁、铜、锌、镁、磷、尿素、肌酐、磷酸盐、o2、co2、碳酸氢盐、胆固醇、hdl、ldl、甘油三酯、c反应蛋白、tsh、pth、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白、胆红素、afp、hcg、癌胚抗原、psa、pap、降钙素、睾酮、双氢睾酮、黄体酮、fsh、lh、雌二醇、皮质醇、生长激素、醛固酮、维生素a、维生素b、维生素c、维生素d、维生素e、铅、乙醇、ldh或淀粉酶，或其任何组合。
附图说明
86.图1a-图1c是指示剂化合物及其通过分析物结合的活化的实施方式的描绘。
87.图2a描绘了荧光蛋白的实施方式的氨基酸序列(例如，seq id no:1)。
88.图2b描绘了分析物结合蛋白(例如，葡萄糖)的实施方式的氨基酸序列(例如，seq id no:2)。
89.图2c(1)至图2c(11)描绘了可用作指示剂化合物的融合蛋白的一些实施方式的氨基酸序列(例如，seq id no:3-13)。
90.图3a描绘了荧光蛋白的实施方式的氨基酸序列(例如，seq id no:14)。
91.图3b描绘了分析物结合蛋白(例如，葡萄糖)的实施方式的氨基酸序列(例如，seq id no:15)。
92.图3c(1)至图3c(5)描绘了可用作指示剂化合物的融合蛋白的一些实施方式的氨基酸序列(例如，seq id no:16-20)。
93.图4a(1)至图4a(8)描绘了编码如在本文中公开的指示剂化合物的一些实施方式的dna链(例如，seq id no:21-28)。
94.图5a(1)至图5a(5)描绘了编码如在本文中公开的指示剂化合物的一些实施方式的dna链(例如，seq id no:29-33)。
95.图6a(1)至图6a(54)描绘了可用于在本文中公开的指示剂化合物中的各种荧光蛋白。
96.图7a(1)至图7a(88)描绘了用于一些实施方式中的附加荧光蛋白的蛋白质和/或氨基酸序列(例如，seq id no:34-122)。
97.图8a(1)至图8a(100)描绘了在一些实施方式中使用的伴刀豆球蛋白的蛋白质和/或氨基酸序列(例如，seq id no:122-221)。
98.图9a(1)至图9a(43)描绘了在一些实施方式中使用的葡萄糖/半乳糖结合蛋白(ggbp)蛋白的蛋白质和/或氨基酸序列(例如，seq id no:1704-1746)。
99.图10a描绘了传感器和询问装置的实施方式。
100.图10b描绘了传感器的另一实施方式。
101.图10c描绘了具有波导的传感器的实施方式。
102.图10d描绘了图10c的波导的实施方式底视图。
103.图10e描绘了具有聚合物梯度的波导的实施方式。
104.图10f描绘了具有波导，包括多个聚合物光纤的传感器的实施方式。
105.图10g描绘了包括多个聚合物光纤的波导的附加实施方式。
106.图10h描绘了具有保护涂层的波导。
107.图10i描绘了正在组装的波导。
108.图10j提供了波导的另一实施方式。
具体实施方式
109.在本文中公开的一些实施方式提供化合物(例如，蛋白质、融合蛋白和/或编码它们的多核苷酸)、包括那些化合物的组合物、那些化合物和组合物的制备、包括那些化合物的装置，以及它们在检测分析物中的用途。在一些实施方式中，在本文中公开的化合物是指
示剂化合物。在一些实施方式中，响应于分析物的存在(例如，分析物与指示剂化合物内的结合区域的结合)，指示剂化合物引起可测量信号(例如，发射可测量信号)，从而允许量化分析物。在一些实施方式中，分析物是糖。在一些实施方式中，分析物是葡萄糖。在一些实施方式中，在分析物是葡萄糖的情况下，指示剂化合物可用于实时和/或体内测量葡萄糖水平，以允许受试者监测并帮助调节其葡萄糖水平。在一些实施方式中，受试者是糖尿病患者。在一些实施方式中，指示剂化合物在细胞中提供。在一些实施方式中，细胞是患者的细胞。在一些实施方式中，患者的细胞是皮肤细胞。在一些实施方式中，在皮肤的表面处测量从指示剂化合物发射的信号。以下描述提供了上下文和示例，但不应被解释为限制由本说明书所附的权利要求或要求本说明书优先权的任何其它申请所涵盖的本发明的范围。没有单一部件或部件集合是必不可少的或不可或缺的。在本说明书的任何实施方式中描述和/或示出的任何特征、结构、部件、材料、步骤或方法可以与在本说明书中的任何其它实施方式中描述和/或示出的任何特征、结构、部件、材料、步骤或方法一起使用或代替在本说明书中的任何其它实施方式中描述和/或示出的任何特征、结构、部件、材料、步骤或方法。
110.除非另有定义，否则在本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本主题所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。在本文中的主题的描述中所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的并且不旨在限制本主题。
111.冠词“一”和“一个”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(例如，至少一个)。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。
112.如在本文中所使用的，术语“约”或“左右”是指是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参比量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
113.可以设想，可以对在本文中公开的实施方式的具体特征和方面进行各种组合或子组合，并且这些组合或子组合仍然落入本发明的一个或多个范围内。此外，在本文中关于实施方式的任何特定特征、方面、方法、特性、特征、质量、属性、元素等的公开可以用于在本文中阐述的所有其它实施方式中。因此，应当理解，所公开的实施方式的各种特征和方面可以相互组合或相互替代，以形成所公开的发明的不同模式。因此，在此公开的本发明的范围不应受在本文中所述的特定公开的实施方式的限制。此外，虽然本发明易于进行各种修改和替代形式，但其具体示例已在附图中示出并在本文中详细描述。然而，应当理解，本发明不限于公开的特定形式或方法，相反，本发明将涵盖落入所描述的各种实施方式和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。在本文中公开的任何方法都不需要以所述的顺序执行。在本文中公开的方法包括从业者采取的某些行动；然而，它们也可以包括这些行动的任何第三方指令，无论是明示的还是暗示的。例如，“植入血糖监测装置”等行动包括“指示植入血糖监测装置”。另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此也根据马库什组的任何个体成员或成员亚组(例如，“a、b、c和/或d”还包括“a、b和/或c”)来描述。
114.在本文中公开的范围还包括任何和所有重叠、子范围及其组合。语言，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“少于”，“在
……
之间”等包括所列举的数字。在诸如“约”或“大约”等的术语之前的数字包括所列举的数字。例如，“约90％”包括“90％”。在一些实施方式中，序
列中至少95％相同包括在序列中与参考序列96％、97％、98％、99％和100％相同。此外，当序列被公开为“包括”核苷酸或氨基酸序列时，除非另有说明，否则此类引用还应包括序列“包括”所列举序列、“由所列举序列组成”或“基本上由所列举序列组成”。
115.在本技术中使用的术语和短语以及其变体，特别是在所附权利要求中的，除非另有明确说明，否则应被解释为开放式的而不是限制性。作为前述的示例，术语“包括”应理解为“包括，而不限于”、“包括但不限于”等；如在本文中所使用的，术语“包括”与“包括有”、“包含”或“特征在于”同义，并且是包容性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤；术语“具有”一词应解释为“至少具有”；术语“包括”一词应解释为“包括但不限于”；术语“示例”用于提供所讨论项目的示例性实例，而不是穷尽性或限制性的列表；以及如“优选的”、“优选”、“希望”或“期望”等术语以及类似含义词语的使用不应被理解为暗示某些特征对于本发明的结构或功能是关键的、必不可少的或甚至是重要的，而是仅旨在突出在本发明的特定实施方式中可能使用或可能不使用的替代或附加特征。此外，术语“包括”应与短语“具有至少”或“包括至少”同义地解释。当在过程的上下文中使用时，术语“包括”是指该过程至少包括所列举步骤，但可以包括另外的步骤。当在化合物、组合物或装置的上下文中使用时，术语“包括”是指化合物、组合物或装置至少包括所列举特征或部件，但还可以包括另外的特征或部件。除非另有明确说明，否则与连接词“或”关联的一组项目不应被理解为需要该组中的相互排他性，而应被理解为“和/或”。
[0116]“由
……
组成”是指包括，但不限于“由
……
组成”这一短语之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其它元素。“基本上由
……
组成”是指包括在短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于在公开中为列出的元素指定的活动或动作的其它元素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，但其它元素是任选的，可能存在也可能不存在，这取决于它们是否对列出的元素的活动或动作产生实质上的影响。
[0117]
在一些实施方式中，如在本文中公开治疗的“个体”、“患者”或“受试者”是人类患者，尽管应理解，当前公开主题的原理指示当前公开主题对于包括哺乳动物在内的所有脊椎动物物种是有效的，所述所有脊椎动物物种旨在包括在术语“个体”、“受试者”和“患者”中。适合的受试者通常是哺乳动物受试者。在本文中所述的主题可用于研究以及兽医和医学应用。在本文中所使用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人动物，包括灵长类、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)、猴等。人类受试者和患者包括新生儿、婴儿、青少年、成人和老年受试者。受试者可以是“需要”在本文中公开的方法的受试者，可以是经历疾病状态和/或预期经历疾病状态的受试者，并且本发明的方法和组合物用于治疗性和/或预防性治疗。受试者可以是患者，其是指呈现给医疗提供者用于诊断或治疗疾病的人。受试者可能患有或易于患有疾病或病症，但可能或可能不表现出疾病或病症的症状。
[0118]
如在本文中所使用的，术语“有效量”是指导致可观察效果的所述化合物的量，其例如可以允许监测与患者疾病状态相关的分析物。可以改变当前公开主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平，以便施用一定量的活性化合物，以有效实现特定受试者和/或应用的所需反应。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于组合物的活性、制剂、施用途径、与其它药物或治疗的组合、所治疗疾病的严重程度以及所治疗的受试者的身体状
况和先前病史。在一些实施方式中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量升级至最小有效量。在本文中考虑了有效剂量的确定和调整，以及评估何时以及如何进行此类调整。
[0119]
如在本文中所使用的，术语“功能”和“功能性”是指生物、酶或治疗功能。
[0120]
如在本文中所使用的，“药学上可接受的”是指在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒或具有可接受的毒性水平的载体、赋形剂和/或稳定剂。如在本文中所使用的，“药学上可接受的”、“稀释剂”、“赋形剂”和/或“载体”旨在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与对人或其它脊椎动物宿主的施用相容。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是由联邦、州政府或其他监管机构的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的，用于动物，包括人和非人哺乳动物。术语稀释剂、赋形剂和/或“载体”可以指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物稀释剂、赋形剂和/或载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。水、盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液可以用作液体稀释剂、赋形剂和/或载体，特别是对于可注射溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。生理学上可接受的载体的非限制性示例是ph缓冲水溶液。生理学上可接受的载体还可以包括以下一种或多种：抗氧化剂，诸如抗坏血酸、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白、亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸、碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖或糊精、螯合剂诸如edta、糖醇诸如甘露醇或山梨糖醇、成盐抗衡离子诸如钠，以及非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)和如果需要，组合物还可以包含少量润湿剂、填充剂、乳化剂或ph缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂等形式。制剂应适合施用方式。
[0121]
具有所需特性的另外的赋形剂包括但不限于防腐剂、佐剂、稳定剂、溶剂、缓冲剂、稀释剂、增溶剂、去污剂、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、醇、酮、醛、乙二胺四乙酸(edta)、柠檬酸、盐、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨糖醇、纤维素、血清、氨基酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、硬脂酸镁、辛基酚乙氧基化物、苄索氯铵、硫柳汞、明胶、酯、醚、2-苯氧乙醇、尿素或维生素，或它们的任何组合。一些赋形剂可以来自于制备免疫原性组合物或疫苗的过程中的残余量或污染物，包括但不限于血清、白蛋白、卵清蛋白、抗生素、灭活剂、甲醛、戊二醛、β-丙内酯、明胶、细胞碎片、核酸、肽、氨基酸或生长培养基部件或其任何组合。可以在免疫原性组合物或疫苗中存在赋形剂的量百分比为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％w/w或由上述数字中的任何两个限定的范围内的任何重量百分比。
[0122]
当值被描述为等于或至少约70％、80％、90％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)时，或在使用类似语言的情况下，该表述意在包括可以等于或至少约70％、等于或至少约80％、等于或至少约90％、和/或等于或至少约100％的值。该表述还意在包括范围，诸如，包括和/或跨越约70％至约100％、约80％至约100％、约70％至约80％、约80％至约90％
等等。此外，术语“关于”可以被撤回。因此，该表述还包括80％、90％、100％等的特定值。该相同的术语可以与等于或小于大约一个值的数字一起使用。
[0123]
如在本文中所使用的，术语“分离的”是指一种物质和/或实体，其(1)与最初生产时(无论是在自然界和/或在实验环境中)相关联的至少一些成分分离，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与等于或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、基本上100％或100％的与它们最初相关联的其它成分(或包括和/或跨越上述值的范围)分离。在一些实施方式中，分离的试剂等于或大于约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、基本上100％或100％纯(或包括和/或跨越上述值的范围)。如在本文中所使用的，术语“分离的”物质可以是“纯的”(例如，基本上不含其它成分)。如在本文中所使用的，术语“分离的细胞”可以指不包含在多细胞生物中的细胞。在一些实施方式中，例如，fp或葡萄糖结合蛋白可以在组合之前从天然来源中分离。
[0124]
如在本文中所使用的，术语“脱氧核苷酸”是指在糖部分的2'或3'位置缺少oh基团并具有适当的键和/或2'、3'末端双脱氧的核苷酸或多核苷酸，而不是具有氢与2'和/或3'碳键合。
[0125]
如在本文中所使用的，术语“脱氧核糖核苷酸”和“dna”是指包括至少一个核糖基部分的核苷酸或多核苷酸，该核糖基部分在其核糖基部分的2'位置具有h而不是oh。dna可以是以例如反义分子、质粒dna、预缩合dna、pcr产物、载体(pac、bac、yac、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体dna或这些组的衍生物和组合的形式。
[0126]
在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、未修饰的核苷酸或碱基、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过dna或rna聚合酶掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和它们的类似物。在本文中所使用的术语“核酸”是指含有至少两个单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，包括dna和rna。核酸包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，包括例如锁核酸(lna)、未锁核酸(una)和拉链核酸(zna)，它们可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2'-o-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(pna)。除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。“核苷酸”包含脱氧核糖(dna)或核糖(rna)、碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置新反应基团的修饰，例如但不限于胺、醇、硫醇、羧化酶和卤代烷。如在本文中所使用的，“寡核苷酸”通常是指短的、通常合成的多核苷酸，其长度通常但不一定小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。以上对多核苷酸的描述同样和完全可适用于寡核苷酸。在一些实施方式中，在本文中公开的多
核苷酸(例如，rnai)可以包括一个或多个核苷酸，所述核苷酸不是天然存在的，以例如，改善多核苷酸的稳定性。一些非天然核苷酸修饰可以包括：硫代磷酸酯键、硼磷酸酯键、锁核酸2'-修饰的rna、4'-硫代修饰的rna、核糖二氟甲苯核苷酸、不带电荷的核酸模拟物、sirna缀合物，包括但不限于肽添加物或聚乙二醇。在一些实施方式中，多核苷酸不包括非天然核苷酸。
[0127]
如在本文中所使用的，术语“互补”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反平行多核苷酸链或区域中核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸链或区域可以以watson-crick方式(例如，a至t、a至u、c至g)或以允许形成稳定双链体的任何其它方式进行碱基配对。
[0128]
如在本文中所使用的，“完全互补”或“100％互补”是指一个多核苷酸链或区域的每个核苷酸单元可以与第二个多核苷酸链或区域的每个核苷酸单元氢键键合的情况。不完全互补是指其中两条链或两个区域的一些但不是全部核苷酸单元可以彼此氢键键合的情况。例如，对于两个19聚体，如果每条链或每个区域上的17个碱基对可以彼此氢键键合，则多核苷酸链表现出89.5％的互补性。
[0129]
在核酸杂交的上下文中，“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的实验参数下是不同的。严格杂交条件可包括，例如，在包括50％甲酰胺、5xssc和1％sds的缓冲液中在42℃杂交，或在包括5xssc和1％sds的缓冲液中在65℃杂交，二者均用0.2xssc和0.1％sds在65℃洗涤。其它严格杂交条件还可包括在40％甲酰胺、1m nacl和1％sds的缓冲液中在37℃杂交，以及在1
×
ssc中在45℃洗涤。可选地，可以采用在0.5m nahpc-4、7％十二烷基硫酸钠(sds)、1mm edta中在65℃杂交过滤结合的dna，并在0.1
×
ssc/0.1％sds中在68℃洗涤。其它严格杂交条件包括在60℃或更高的温度和3xssc(450mm氯化钠/45mm柠檬酸钠)下杂交或在42℃在含有30％甲酰胺、1m nacl、0.5％肌氨酸钠、50mm mes、ph6.5的溶液中温育。普通技术人员将容易地认识到，可以使用替代的但相当的杂交和洗涤条件来提供相似严格性的条件。洗涤条件可以包括，例如在ph7和至少约50℃或约55℃至约60℃的温度约0.02摩尔的盐浓度；或者，在72℃约0.15m nacl的盐浓度持续约15分钟；或者，在至少约50℃或约55℃至约60℃的温度约0.2xssc的盐浓度持续约15至约20分钟；或者，在室温用含有0.1％sds的约2
×
ssc的盐浓度的溶液洗涤杂交复合物两次15分钟，然后在68℃下用含有0.1％sds的0.1
×
ssc洗涤两次15分钟；或者，等效条件。用于洗涤的严格条件还可以是，例如在42℃下的0.2
×
ssc/0.1％sds。在核酸分子是脱氧寡核苷酸(“寡核苷酸”)的情况下，严格条件可以包括在37℃(对于14个碱基寡核苷酸)、48℃(对于17个碱基寡核苷酸)、55℃(对于20个碱基寡核苷酸)和60℃(对于23个碱基寡核苷酸)下在6
×
ssc/0.05％焦磷酸钠中洗涤。
[0130]
如在本文中所使用的，“表达载体”是指重组或合成产生的核酸构建体，其带有一系列能够在宿主细胞中转录特定基因的特定核酸元件。在一些实施方式中，基因表达被置于某些调节元件的控制下，诸如组成型或诱导型启动子的控制下。
[0131]
核酸或核酸分子可以包括一个或多个编码不同肽、多肽或蛋白质的序列。这些一个或多个序列可以在相同的核酸或核酸分子中相邻地连接，或者与在它们之间额外的核酸连接，例如连接子、重复或限制酶位点，或任何其它序列，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、
200或300个碱基长，或由上述长度中的任意两个限定的范围内的任何长度。在本文中所使用的核酸上的术语“下游”是指在先前序列的3'-末端之后的序列，如果核酸是双链的，则在含有编码序列的链(有义链)上。在本文中所使用的核酸上的术语“上游”是指在后续序列的5'-末端之前的序列，如果核酸是双链的，则在含有编码序列的链(有义链)上。在本文中所使用的核酸上的术语“分组”是指两个或更多个序列直接或在其间具有额外的核酸邻近出现，例如连接子、重复或限制酶位点，或任何其它序列，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长，或由上述长度中的任意两个限定的范围内的任何长度。但通常不具有其间的编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白结构域的序列。
[0132]
如在本文中所使用的，关于核酸的术语“密码子优化”是指取代核酸的密码子以增强或最大化特定物种的宿主中的翻译，而不改变基于物种特异性密码子使用偏差和靶细胞细胞质中每个氨酰基-trna的相对可用性的多肽序列。密码子优化和进行这种优化的技术是本领域已知的。含有密码子优化算法的程序是本领域技术人员已知的。本领域技术人员将理解基因表达水平取决于许多因素，诸如启动子序列和调节元件。小的密码子子集被导致翻译选择的trna物种识别，这可能是蛋白质表达的重要限制。在这方面，可以设计许多合成基因以提高它们的蛋白质表达水平。
[0133]
如在本文中所使用的，术语“拆分指示剂”是指可以包括蛋白质或其模拟物的化合物，其被分成两个或更多个部分，由此在这些部分的二次空间连接或分离时，拆分指示剂呈现导致可测量信号的三维结构。可测量信号可以是发光、荧光、磷光和/或由于化合物的空间重新定向引起的淬灭而导致的这些发射中的任一种的下降。可测量信号可能是由于共振能量转移(fret)导致的，其可用于确定两个发色团(例如荧光团)是否在彼此的一定距离内。如在本文中别处公开的，这些部分的二次空间连接和/或分离可以由分析物分子的结合引起。拆分指示剂可以包括在指示剂区域处拆分或在结合区域处拆分的融合蛋白。
[0134]
如在本文中所使用的，术语“拆分发光蛋白”是指一种类型的拆分指示剂。拆分发光蛋白包括发光蛋白，其氨基酸序列被分成两个或更多个部分，由此在这些部分的二次空间连接时，拆分发光蛋白呈现三维结构，其允许其在被合适波长的光激发时发射发光(例如，荧光、磷光)。
[0135]
如在本文中所使用的，术语“蛋白质”、“多肽”、“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。蛋白质可以具有连续的氨基酸残基。连续残基的数量可以大于或等于至少：20、30、40、50、60、100、200、300，或跨越和/或包括上述值的范围。蛋白质可以是天然存在的、重组的、合成的、非天然的，或这些的任意组合。蛋白质也可以仅仅是天然存在的蛋白质的片段。术语蛋白质也可应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。其中一个或多个氨基酸残基是“非天然”氨基酸而不对应于任何天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物也包括在本文中使用术语“蛋白质”中。
[0136]
如在本文中所使用的，术语“融合蛋白”、“融合多肽”、“融合肽”是指包括来自至少两种不同蛋白质的蛋白结构域的多肽。
[0137]
肽、多肽和蛋白质通常、但不总是通过使用核酸模板的核糖体复合物生物地产生，尽管化学合成也是可用的。通过操作核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，诸如多于
一种肽、多肽或蛋白质的取代、缺失、截短、添加、复制或融合。这些多于一种肽、多肽或蛋白质的融合可以在相同的分子中相邻地连接，或者在其间具有额外的氨基酸连接，例如连接子、重复、表位或标签，或任何其它序列，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长，或由上述长度中的任意两个限定的范围内的任何长度。
[0138]
在一些实施方式中，在本文中呈现的和在示例中使用的核酸或肽序列在各种生物系统中是有功能的，所述生物系统包括但不限于人、小鼠、兔、细菌、大肠杆菌、真菌、酵母、昆虫、动物和哺乳动物细胞。在其它实施方式中，核酸或肽序列与在本文中呈现的和在示例中使用的核酸或肽序列具有0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相似性，或在由上述百分比中的任意两个限定的范围内的任何百分比的相似性，也可以在不影响生物系统中序列功能的情况下使用。如在本文中所使用的，术语“相似性”是指分别具有与模板核酸或肽序列相同的核苷酸或氨基酸总体顺序的核酸或肽序列，所述模板核酸或肽序列在序列内具有特定的变化，诸如取代、缺失、重复或插入。在一些实施方式中，具有低至0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的两个核酸序列可通过包括在翻译期间编码相同氨基酸的不同密码子来编码相同多肽。
[0139]
如在本文中所使用的，术语“载体”是指能够运输与其连接的核酸的分子(例如，核酸分子)。一种类型的载体是“质粒”，它是指环状双链dna环，可以将另外的dna片段连接到其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的dna片段连接到病毒基因组中。另一种类型的载体是非病毒载体，其可以包括配置为将核酸递送至细胞的合成聚合物。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞之后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。通常，在重组dna技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在一些情况下，当使用术语“质粒”时，不同的“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。应当注意，其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)或非病毒载体，可以具有等同的功能。可选地，载体可以是脂质体，在本文中公开的核酸分子或表达盒可以被重构到其中以递送至靶细胞。同样，术语“载体”是指含有此类核酸分子或表达盒的复合物，其还包含已知促进基因转移到细胞中的化合物，诸如聚阳离子、阳离子肽等。
[0140]
如在本文中所使用的，术语“重组表达的”是指在优化或适应的生物系统中产生蛋白质。这些系统在天然宿主中提供了优于蛋白质表达的优点，包括但不限于高表达(过表达)、易于纯化、易于转化、可诱导性、低成本或蛋白质的稳定性。在一些实施方式中，蛋白质在哺乳动物、细菌、酵母、昆虫或无细胞重组表达系统中表达。每个系统具有其自身的优点或缺点。例如，细菌表达系统对于过表达是高度优化的，但可能引起产生的蛋白质的错误折叠或聚集，当翻译后修饰是必需的时，酵母系统是有用的，并且昆虫和哺乳动物系统对于在高阶生物中发生的适当rna剪接是有用的。在一些实施方式中，从动物、哺乳动物、人、原代、永生化、癌症、干细胞、成纤维细胞、人胚肾(hek)293、中国仓鼠卵巢(cho)、细菌、大肠杆菌、
真菌、酵母、酿酒酵母、毕赤酵母、昆虫、草地夜蛾sf 9，或s.frugiperda sf 21细胞，或在无细胞系统中产生和纯化重组多肽。在一些实施方式中，表达基因、载体或构建体以质粒、噬菌体、病毒、腺伴随病毒(aav)、杆状病毒、粘粒、磷粒、噬菌粒、bac、yac或hac的形式递送至重组表达系统。
[0141]
如在本文中所使用的，术语“发光化合物”(例如，发光蛋白)是指在一个波长下吸收能量并且在另一个波长下发射能量以发光的化合物(例如，蛋白质)。绿色荧光蛋白是指例如在其发射光谱中在约510nm处可能具有峰的多肽。
[0142]
如在本文中所使用的，术语“结合部分”、“结合区域”、“结合结构域”或“结合位点”是指介导与靶分子(例如糖或其它分子，或其它试剂、nadph、重金属、ca
2+
)特异性结合的多肽或其模拟物的一个或多个区域。示例性结合结构域包括配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构域或酶结构域。结合区域可以指任何天然受体(例如细胞表面受体)或其任何区域或变体，其至少保留定性配体结合能力，并且在一些实施方式中，保留相应天然受体的生物活性。结合区域可以指任何天然配体或蛋白质(例如，周质膜蛋白的受体)或其任何区域或变体，其至少保留定性受体结合能力，并且在一些实施方式中，保留相应天然配体的生物活性。在一些实施方式中，多肽或其模拟物(例如，模拟物)具有至少一个对靶向用于量化、减少或消除的分子特异性的结合域。
[0143]
如在本文中所使用的，术语“信号传导部分”、“信号传导区域”或“信号传导结构域”是指多肽或其模拟物的一个或多个区域，其响应于分析物与结合部分的结合而提供可测量信号。信号传导区域可以指任何天然蛋白质或其任何区域或变体，其至少保留定性信号传导能力，并且在一些实施方式中，保留相应天然信号传导分子的生物活性。
[0144]
如在本文中所使用的，术语“连接子”是指融合蛋白内存在的单元，其包括例如分析物结合蛋白的结合部分和信号传导蛋白之间的间隔区。在一些实施方式中，连接子可以包括g和/或s氨基酸的一定长度的重复残基(重复残基的数量等于或大于约3、5、10、15、20，或包括和/或跨越上述值的范围)。连接子可以将融合蛋白的信号传导单元结合到融合蛋白的结合区域。
[0145]
如在本文中所使用的，术语“小分子”是指非核苷酸和非蛋白质的不同的有机化合物，其具有与生物分子的分子量相比更低的分子量。小分子可以具有小于或等于约900道尔顿、1500道尔顿、2000道尔顿、5000道尔顿或包括和/或跨越上述值的范围的分子量。小分子的平均尺寸可以是小于或等于约1nm、2nm、3nm或包括和/或跨越上述值的范围。
[0146]
如在本文中所使用的，术语“变体”可以与术语“突变体”互换使用。“变体”可以指多肽或核酸。变体包括一个或多个序列“修饰”，其在本文中使用时包括相对于参考序列的在一个或多个位置处的取代、插入、缺失、截短、转换和/或反转。每个修饰可包括导致序列中的一个或多个氨基酸残基或核苷酸相对于参考序列发生变化的变化。变体核酸包括与能够与在本文中呈现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。例如，在本文中的变体核酸序列可以与能够在严格条件下与在本文中呈现的核苷酸序列杂交的序列至少部分地互补。变体可具有与公开的蛋白质或核苷酸和/或公开的蛋白质的活性区域的序列等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％相同的序列(或包括和/或跨越上述值的范围)。变体可具有与公开的蛋白质或核苷酸和/或公开的蛋白质的活性区域的序列等于或至少约
60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％同源性或相似性的序列(或包括和/或跨越上述值的范围)。
[0147]
如在本文中所使用的，“体内”被赋予其通常含义，是指在活的生物，通常是动物、哺乳动物，包括人和植物内部进行的方法，而不是组织提取物或死的生物。
[0148]
如在本文中所使用的，“离体”被赋予其通常含义，是指在几乎不改变天然条件的情况下在活的生物外部进行的方法。
[0149]
如在本文中所使用的，“体外”被赋予其通常含义，是指在生物条件之外进行的方法，例如在培养皿或试管中。
[0150]
如在本文中所使用的，任何标题或子标题是出于组织的目的，并且不应用于限制在本文中公开的实施方式的范围。
[0151]
术语“截短的”是指与相应的野生型蛋白质相比，在一个或两个信号传导部分和/或结合部分的n-和/或c-末端或内部氨基酸残基上缺失一个或几个氨基酸残基。特别地，截短区域包括等于或至少约1、2、5、10、20(或跨越和/或包括任何上述值的范围)个氨基酸残基。截短的程度可以被限制在蛋白质部分仍然显示出融合蛋白质测量分析物浓度所必需的功能的最大值。
[0152]
术语“野生型”是指已用作构建本发明融合蛋白的起源的蛋白质。
[0153]
术语“对ph值的不敏感性增加”是指在其它基本相同的条件下，融合蛋白的最大能量发射(例如在约ph6.0-6.5)和在生理ph范围内观察到的最低能量发射(例如在ph5.5和ph8.5之间)之间的差异降低等于或至少约20％、50％、80％、90％，或跨越和/或包括任何上述值的范围。
[0154]
术语“对温度值的不敏感性增加”是指在其它基本相同的条件下，在15℃和30℃之间的范围内观察到的融合蛋白的最大能量发射和最低能量发射之间的差异降低等于或至少约20％、50％、80％、90％，或跨越和/或包括任何上述值的范围。
[0155]
术语“增强的稳定性”是指蛋白质相对于比较蛋白质(包括作为天然蛋白质的比较蛋白质，该天然蛋白质衍生出具有增强的稳定性的变体)具有增强的稳定性。在若干实施方式中，稳定性(例如，在环境给定条件下的活性)增加等于或至少约20％、50％、80％、90％、100％，或跨越和/或包括任何上述值的范围。可能显示增加的稳定性的环境条件包括诸如缓冲溶液(诸如磷酸盐缓冲盐水、hepes缓冲液、tris缓冲液等)、血液和/或血浆(包括胎牛血清)和体内条件(诸如真皮的皮下环境)的条件。增强的稳定性可以在升高的温度30℃(例如，在上述溶液中)和在升高的或降低的ph值(在水溶液、等渗溶液等中)下证明。降低的ph条件可以包括等于或小于4、5、6的ph值，或跨越和/或包括上述值的范围。升高的ph条件可以包括等于或至少约8、9、10的ph值，或跨越和/或包括上述值的范围。
[0156]
引言部分
[0157]
葡萄糖对于细胞生长、增殖和体内平衡是至关重要的，是用于身体的最常见的能量燃料之一。葡萄糖经由血液在体内循环，并且血糖水平由激素诸如胰岛素和胰高血糖素等控制。参见mita,m.等人基于绿色荧光蛋白的葡萄糖指示剂报告活细胞中的葡萄糖动态，anal,chem.2019,91,4821-4830。细胞响应于胰岛素从血液中摄取葡萄糖并将其代谢以提供能量。葡萄糖通过糖酵解和电子转移代谢成三磷酸腺苷(atp)或转化为糖原用于能量储
存。胰腺β-细胞(β细胞)感测在食物摄取和经由葡萄糖转运蛋白(诸如哺乳动物的glut)摄取葡萄糖后的血液中的葡萄糖水平增加。β细胞的主要功能是产生和释放胰岛素和胰淀素。二者都是通过不同机制降低血糖水平的激素。β细胞可以通过分泌其储存的胰岛素和胰淀素中的一些同时产生更多的胰岛素和胰淀素来快速响应血糖浓度的峰值。
[0158]
葡萄糖代谢途径中的失败可引起影响大部分人群的慢性疾病，诸如糖尿病或肥胖。1型糖尿病，也称为胰岛素依赖性糖尿病，被认为是由体内产生胰岛素的β细胞的自身免疫介导的破坏引起的。这些细胞的破坏降低了身体对体内葡萄糖水平的响应能力，因此几乎不可能适当调节血流中的葡萄糖和胰高血糖素水平。2型糖尿病，也称为非胰岛素依赖型糖尿病和慢性高血糖症，主要由遗传和代谢综合征的发展引起。β细胞仍然可以分泌胰岛素，但身体已经产生了抵抗力并且其对胰岛素的响应已经下降。为了分泌足够的胰岛素来克服不断增加的胰岛素抵抗，β细胞增加了它们的功能、大小和数量。胰岛素分泌增加会导致高胰岛素血症，但由于胰岛素信号传导的功效降低，血糖水平仍保持在正常范围内。然而，β细胞可能会因过度刺激而过度劳累和筋疲力尽，导致功能减少50％，同时β细胞体积减少40％。此时，无法产生和分泌足够的胰岛素以将血糖水平保持在正常范围内，从而导致明显的2型糖尿病。这可能导致患者出现高血糖症，从而导致其它不利的短期和长期病症。这使得了解葡萄糖代谢的机制和/或以高时空分辨率监测活细胞和/或患者体内的葡萄糖水平变得重要。
[0159]
仍然需要实时、高度精确的葡萄糖监测，允许单一或双重化合物发射以可视化一个分子，并且具有改善的寿命(例如，随着时间的稳定性和精确度)。此外，侵入性形式的自我测试是痛苦的，充满了大量的心理社会障碍，并且被大多数糖尿病患者所抵制。另外，在用穿戴在身体上的单元进行连续监测的情况下，针和部件具有有限的寿命，需要更换或产生不准确的结果。还可以使用如在本文中别处公开的用于其它生物分析物的监测系统。在本文中公开的一些实施方式提供了对这些问题或其它问题的解决方案。一些实施方式提供了用于监测受试者(例如患者)体内的分析物(包括但不限于葡萄糖)的指示剂化合物和/或包括指示剂化合物的装置。
[0160]
指示剂化合物
[0161]
在本文中公开的一些实施方式涉及用于检测分析物和/或一种或多种分析物的指示剂化合物。在一些实施方式中，如在图1a和图1b中所示，单独的指示剂化合物100可以包括结合区域101和信号传导区域102。如在图1a中所示，信号传导区域102可以是拆分的和/或可以包括多个信号传导单元102’、102”(例如，2、3、4、5或更多)。如图所示，在一些实施方式中，当分析物103与指示剂化合物的结合区域101结合时，化合物100的信号传导区域102发生构象转变，导致可检测信号200。在若干实施方式中，使信号传导单元102’、102”接近以提供产生可检测信号200的有效信号传导区域。在一些实施方式中，当用激发波长201询问(例如，激发)指示剂化合物时，产生可检测信号200。在一些实施方式中，信号传导区域和/或包括信号传导区域的信号传导单元(例如，信号传导区域的提供信号传导区域的部分)包括发光蛋白和/或发光蛋白的部分、由发光蛋白和/或发光蛋白的部分组成或基本上由发光蛋白和/或发光蛋白的部分组成。在其它实施方式中，信号传导单元包括小分子发色团(或其片段)。
[0162]
如在图1b中所示，结合区域101可以是拆分的和/或可以包括多个结合单元101’、
101”(例如，2、3、4、5或更多)。如图所示，在一些实施方式中，当分析物103与指示剂化合物的结合区域101结合时，化合物100的信号传导区域102发生构象转变，导致可检测信号200。在一些实施方式中，当用激发波长201询问(例如，激发)指示剂化合物时，产生可检测信号200。在一些实施方式中，结合区域和/或包括结合区域的结合单元(例如，结合区域的提供结合区域的部分)包括分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的部分、由分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的部分组成或基本上由分析物结合蛋白和/或分析物结合蛋白的部分组成。在其它实施方式中，结合区域或结合单元包括分析物的非蛋白基受体。
[0163]
在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，可以将指示剂化合物引入到传感器装置中。在一些实施方式中，可以通过使用单个传感器通过将多于一种类型的指示剂化合物引入传感器来测量多种分析物(例如，2、3、4、5或更多)。可选地或另外地，在一些实施方式中，可以通过使用分别具有多种分析物的多个分析物结合区域的单个指示剂化合物来测量多种分析物(例如，2、3、4、5或更多)。在一些实施方式中，在要通过单个传感器装置监测多种分析物的情况下，可以选择指示剂化合物以具有可测量发射光谱，所述发射光谱根据指示剂类型是可区分的。例如，一种指示剂化合物可以用于监测葡萄糖。单独的指示剂化合物可以用于监测胆固醇。当指示剂化合物给出可区分的发射信号(和/或彼此不干扰的信号)时，这些指示剂化合物可以被设计为在装置中一起使用。
[0164]
如在本文中别处公开的，图1a提供了一种类型的指示剂化合物的示例。在若干实施方式中，指示剂化合物，诸如图1a(或图1b)所描绘的，可以是融合蛋白，其包括结合蛋白(例如，分析物结合蛋白)的结构域和信号传导蛋白(例如，发光蛋白)的结构域。如在图1a或图1b中所示，在一些实施方式中，当分析物103(例如，葡萄糖)与指示剂化合物100结合时，产生可测量和/或可量化的信号200(例如，在激发时)。在一些实施方式中，例如，当结合分析物(例如，葡萄糖)时，指示剂化合物吸收在第一波长处具有最大值的光并且发射在不同的第二波长处具有最大值的光。可选地，在一些实施方式中，葡萄糖(或一些其它分析物)与指示剂化合物的结合导致来自指示剂化合物的发射信号的降低(例如，淬灭)或信号中的一些其它变化(例如，发射信号的变化、吸收信号的变化等)，这允许量化与指示剂化合物100的结合量。在一些实施方式中，葡萄糖(或一些其它分析物)与指示剂化合物的结合导致来自指示剂化合物的发射信号的增加或信号中的一些其它变化(例如，发射信号的增加或减少、吸收信号的增加或减少等)。如在本文中别处公开的，可测量信号(例如，在结合分析物时提供的)可以是发光、荧光、磷光和/或由于化合物的空间重新定向引起的淬灭而导致的这些发射中的任一种的下降。
[0165]
在一些实施方式中，如在图1a和图1b中所示，指示剂化合物可以是拆分指示剂。在一些实施方式中，使用图1a作为示例，当结合或不结合分析物时，拆分指示器的两个臂102’、102”可以用导致不同信号(例如，通过淬灭、发射信号的变化、吸收信号的变化等)的信号传导蛋白和/或不同发色团、发光体、荧光团或其组合的部分终止。在一些实施方式中，拆分指示剂可以是融合蛋白。在一些实施方式中，当指示剂化合物是融合蛋白时，两个臂102’、102”可以包括当分析物103结合指示剂化合物100的受体部分101(例如，结合部分)时经历构象变化的发光蛋白(例如，荧光蛋白)的部分。在一些实施方式中，如图所示，分析物与指示剂化合物的受体部分101(例如，结合部分)的结合导致可测量信号200。在若干实施方式中，如在本文中别处公开的，可测量信号可以是一种或多种发光(例如荧光)。在其它实
施方式中，这两个臂可以包括小分子合成或天然存在的发色团，如在本文中别处公开的。
[0166]
如在图1a中所示，指示剂化合物可以包括插入到信号传导蛋白(指示剂化合物的信号部分)的结构域中的结合蛋白的结构域(指示剂化合物的结合部分)，从而拆分信号传导蛋白。在一些实施方式中，或者如在图1b中所示，拆分指示剂可以具有这样的构型，其中融合蛋白的信号传导结构域(指示剂化合物的信号传导部分)拆分结合蛋白的结构域(指示剂化合物的结合部分)。如本领域技术人员将理解的以及如在本文中别处公开的，虽然此处使用融合蛋白作为示例，但可以使用其它构型，包括缺乏蛋白结构域的构型和/或包括非蛋白质(例如，小分子发色团)和蛋白结构域的混合物的构型。例如，拆分指示剂可以包括荧光小分子或其部分(fret或其它信号传导分子、荧光团等)，它们被结合蛋白的结合结构域分隔开。可选地，结合结构域可以仅为分析物的受体，并且可以不包括蛋白结构域。在这样的实施方式中，信号传导部分可以包括或不包括信号传导蛋白结构域。因此，在某些实施方式中，指示剂化合物可能完全缺乏蛋白结构域。
[0167]
如在图1a中所示以及如在本文中别处公开的，指示剂化合物可以包括结合部分，其响应于活化(例如，通过使之接近)指示剂化合物的指示剂部分102’、102”的分析物的结合而经历构象变化(例如，三维结构中的变化)，从而产生可测量信号。相反，如在图1b中所示，在一些实施方式中，单独的指示剂化合物100可以包括结合部分，其被拆分成多个结合单元101’、101”(例如，2、3、4、5或更多)。在一些实施方式中，指示剂包括信号传导区域102。如图所示，在一些实施方式中，当分析物103结合指示剂化合物的结合区域时，可能发生构象转变(例如，在结合区域或信号传导区域中)，导致可检测信号200。
[0168]
在一些实施方式中，指示剂化合物不是拆分指示剂，例如，如在图1c中所示。如在图1c中所示，指示剂化合物300可以包括结合区域301和信号传导区域302。结合区域302可以包括多个信号传导单元302’、302”(例如，2、3、4、5或更多)。如图所示，在一些实施方式中，当分析物303与指示剂化合物300的结合区域301结合时，化合物的信号传导区域302(和/或结合区域)可能发生构象转变，导致可检测信号200。
[0169]
如在本文中别处公开的，在一些实施方式中，指示剂化合物是融合蛋白。在一些实施方式中，融合蛋白可以包括与发光蛋白的全长或活性部分(例如发光部分)可操作地连接的分析物结合蛋白的全长或结合部分。例如，在一些实施方式中，指示剂化合物包括与荧光蛋白或蛋白质的荧光部分可操作地连接(例如，通过连接子)的葡萄糖结合区域。在一些实施方式中，结合区域包括d-半乳糖/甲基-半乳糖苷abc转运蛋白周质结合蛋白(mg1b)或其葡萄糖结合部分。在一些实施方式中，指示剂化合物可以包括全长荧光蛋白(fp)或其荧光片段或部分。在一些实施方式中，在葡萄糖结合区域内或附近的葡萄糖结合时，当暴露于光时，发光蛋白(例如，fp或其荧光部分)被活化并且在不同波长的光下发光(例如荧光)。在一些实施方式中，其发光蛋白(例如，fp或荧光部分)的荧光允许检测和/或量化在样品中存在的分析物(例如，葡萄糖)的量。在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，融合蛋白可以包括与发光蛋白的活性片段(例如，发光部分)可操作地连接的分析物结合蛋白的活性片段。在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，融合蛋白可以包括与发光蛋白(或其片段)的活性(例如，发光部分)变体可操作地连接的分析物结合蛋白(或其片段)的变体。
[0170]
如在本文中别处公开的，在一些实施方式中，指示剂化合物包括拆分发光蛋白。在一些实施方式中，指示剂化合物的葡萄糖结合区域位于拆分发光蛋白的两个部分之间。例
如，荧光蛋白可以是拆分荧光蛋白，由此在分析物结合时，这些荧光蛋白部分发生二次空间连接，这允许指示剂化合物在被合适波长的光激发时发射荧光。如在本文中别处公开的，在一些实施方式中，指示剂化合物包括拆分结合蛋白。在一些实施方式中，指示剂化合物的结合区域被发光蛋白拆分。例如，结合蛋白可以是拆分结合蛋白，由此在分析物结合时，这些结合部分发生二次空间连接，这允许指示剂化合物在被合适波长的光激发时发射荧光。在一些实施方式中，指示剂化合物包括未拆分的发光蛋白。在一些实施方式中，指示剂化合物包括未拆分的结合蛋白。
[0171]
在一些实施方式中，化合物是单-(fp)型指示剂。在一些实施方式中，这些指示剂可以有利地成像一种、两种或更多种分子(例如，在体外、在体内、在真皮中、在单细胞中等)。在一些实施方式中，单fp-型葡萄糖指示剂可用于在体外或在体内用一个信号测量葡萄糖浓度。例如，当一个或多个细胞包括指示剂化合物时，来自指示剂化合物的信号强度(或信号强度的下降)可以指示存在的分析物的量。在一些实施方式中，如在本文中公开的单fp-型葡萄糖指示剂适用于哺乳动物细胞的活细胞成像或与其它分子结合的葡萄糖动力学的多色成像。
[0172]
在一些实施方式中，如在本文中公开的指示剂化合物可以是基于共振能量转移(fret)的指示剂。在其它实施方式中，指示剂化合物不是基于fret的指示剂。共振能量转移(fret)型葡萄糖指示剂可以揭示每种葡萄糖转运蛋白对葡萄糖的亲和力，从而调节活细胞中不同的基础细胞内葡萄糖水平，且每一细胞器维持其自身所需的葡萄糖水平。fret指示剂(或如在本文中公开的其它指示剂化合物)不仅可应用于哺乳动物细胞和/或生物，还可应用于在体内的植物和果蝇脑，以更好地理解不同环境中的葡萄糖动力学(如在本文中公开的其它指示剂化合物也一样)。指示剂化合物(包括fret指示剂)可以采用或可以结合使用以提供两种发射来可视化一个分子。例如，具有多个荧光团和/或多个结合区域的单个指示剂化合物可以提供指示分析物的两个信号。或者，可以采用结合相同分析物的两种不同类型的指示剂化合物来提供该单一分析物存在的两种测量。
[0173]
如在本文中别处公开的，指示剂化合物可以包括发光蛋白(例如，拆分发光蛋白或未拆分发光蛋白)。例如，指示剂化合物包括生物发光蛋白。在一些实施方式中，发光蛋白是磷光蛋白或荧光蛋白。可选地或另外地，指示剂化合物可以包括发光蛋白的发光结构域、片段或部分(例如，发光蛋白的有效部分)。为简洁起见，在本文中经常使用术语蛋白质来描述发光区域或结合区域。关于蛋白质所使用的任何示例也应理解为适用于该蛋白质的结构域、片段或部分(例如，发光蛋白的有效部分)，或具有蛋白质的功能的非蛋白质模拟物或小分子(例如，小分子荧光团)。
[0174]
在一些实施方式中，指示剂化合物的信号发射部分(例如，发光蛋白结构域)包括以下一种或多种:黄色荧光蛋白(yfp)、增强型yfp(eyfp)、topaz、venus、柠檬碱、ypet、syfp、mametrine、tagyfp、turboyfp、zsyellow、phiyfp、绿色荧光蛋白(gfp)、增强型gfp(egfp)、emerald、t-sapphire、superfolder gfp(sfgfp)、azami green、mwasabi、zsgreen、taggfp、taggfp2、turbogfp、copgfp、acegfp、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强型bfp(ebfp)、azurite、强烈增强型bfp(sbfp2)、ebfp2、sirius、mtagbfp、青色荧光蛋白(cfp)、增强型cfp(ecfp)、cerulean、cypet、scfp、tagcfp、amcyan、midoriishi cyan、mtfp1、橙色荧光蛋白、kusabira orange、kusabira orange2、morrange、morange2、dtomato、dtomato-tandem、
express2、dsred-express、dsred、ifp2.0、ifp1.4、drcbd、gamillus.gamillus0.5、gamillus0.4、gamillus0.3、gamillus0.2、gamillus0.1、dfgfp、dendra2-t69a、dendra2-m159a、nijifp、moxdendra2、dendra2、dendra、dendfp.moxmaple3、mmaple3、mmaple2、mmaple、mclavgr2、mclavgr1.8、dclavgr1.6、mclavgr1.1、mclavgr1、mwasabi、g3、g2、g1、mtfp1、mtfp0.9、mtfp0.8、mtfp0.7、mtfp0.6、mtfp0.5、mtfp0.4、mtfp0.3、dtfp0.2、dtfp0.1、cfp484、mavicfp1、avicfp1、phluorin ecliptic、phluorin2、phluorin ratiometric、10b、mpa-gfp、pa-gfp、topaz、mclover1.5、dclover2 a206k、mclover3、dclover2、clover1.5、clover、mt-sapphire、t-sapphire、sapphire、meyfp、yfp3、eyfp-f46l、shardonnay、achilles、moxvenus、oxvenus、mvenus-q69m、syfp2、sgfp2(t65g)、sgfp2(e222q)、sgfp2(206a)、cfsgfp2、sgfp2、sgfp1、mturquoise-146s、mturquoise-146g、superfolder mturquoise2ox、superfolder mturquoise2、mturquoise2-g、mturquoise2、mturquoise-ra、mturquoise-gv、mturquoise-gl、mturquoise-dr、mturquoise、scfp3b、scfp3a、scfp2、scfp1、sbfp2、sbfp1、mvenus、ypet、venus、seyfp、eyfp-q69k、citrine2、mcitrine、spoon、dreiklang、citrine、eyfp、11、gfpmut3、gfpmut2、rsgfp7、rsgfp6、rsgfp4、rsgfp3、rsgfp2、rsgfp1、w1c、ecfp h148d、mecfp、d10、cypet、nowgfp、wascfp、mcerulean.b24、mcerulean.b2、mcerulean.b、mcerulean2.d3、moxcerulean3、mcerulean3、mcerulean2.n(t65s)、mcerulean2.n、mcerulean2、mcerulean、cerulean、cfp4、aquamarine、ecfp、w7、w2、cfp、rsfolder2、rsfolder、vsfgfp-0、mugfp、usgfp、vsgfp、moxgfp、oxgfp、vsfgfp-9、superfolder gfp、folding reporter gfp、αgfp、bruslee、siriusgfp、memerald、emerald、mkalama1、rsegfp2、rsegfp、megfp、mametrine、egfp、p9、p11、h9、sg50、sg42、sg25、sg12、sg11、q80r、moxbfp、oxbfp、ebfp2、ebfp1.5、ebfp1.2、ebfp、bfp.a5、azurite、bfp、bfp5、p4、avgfp、mkillerorange、killerorange、a44-kr、supernova green、supernova red、killerred、anm2cp、amfp515、amfp506、amfp495、amfp486、ps-cfp2、ps-cfp、acegfp、rskame、padron(star)、kohinoor、padron0.9、padron、bsdronpa、rsfastlime、pcdronpa2、pcdronpa、ffdronpa、pdm1-4、dronpa-c62s、dronpa-3、dronpa-2、dronpa、22g、任何前述的发光或荧光片段、任何前述的部分或任何前述的变体。
[0176]
在一些实施方式中，在本文中公开的任何发光蛋白、磷光蛋白或荧光蛋白可以被循环置换。例如，cpyfp(seq id no:14)是eyfp的循环置换形式，其通过在可允许的区域处(例如在eyfp的n144和y145之间)拆分肽序列，并任选地用连接子，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的连接子交换n-末端和c-末端结构域。在一些实施方式中，发光蛋白或其发光结构域、片段或部分在n-末端和/或c-末端被许多氨基酸(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)截短或延伸(例如，用连接子)。
[0177]
如在本文中别处公开的，在一些实施方式中，融合蛋白在两个检测部分(例如，信号传导结构域)之间包括结合蛋白部分(例如，结合结构域)。在其它实施方式中，结合蛋白部分(例如，结合结构域)可以被检测部分(例如，信号传导结构域)拆分。在一些实施方式中，在结合分析物(例如，葡萄糖)时，指示剂化合物经历构象变化。在一些实施方式中，这种构象变化负责由指示剂化合物(例如，融合蛋白)产生的信号。
[0178]
在一些实施方式中，其中在本文中别处描述了同一性、同源性或相似性，此类同一性、同源性或相似性水平可以应用于拆分融合蛋白的单个蛋白质(例如，拆分指示剂或拆分
发光化合物)。为了说明，拆分融合蛋白可以包括两种蛋白质，并且这些蛋白质中的一种可以嵌入到另一种蛋白质中。如在本文中所使用的，当seq id no:1的柠檬碱蛋白被seq id no:2的mg1b蛋白拆分时，拆分柠檬碱指示剂部分(例如，指示剂化合物的拆分信号传导结构域)仍然可以表达为与未拆分柠檬碱蛋白具有百分比同一性。例如，拆分柠檬碱指示剂可以表达为与seq id no:1具有100％同一性，其中拆分信号传导结构域的每个氨基酸与seq id no:1的每个氨基酸一致，但被seq id no:2拆分。作为另一个示例，当seq id no:1的柠檬碱蛋白拆分seq id no:2的mg1b蛋白时，拆分结合蛋白(例如，指示剂化合物的结合结构域)可以表达为与seq id no:2具有100％同一性，其中拆分结合蛋白的每个氨基酸与seq id no:2的每个氨基酸一致，但被seq id no:1拆分。
[0179]
在一些实施方式中，融合蛋白分别包括如在图2a(例如，seq id no:1)和图3a(例如，seq id no:14)中所示的柠檬碱序列和/或循环置换的黄色荧光蛋白(cpyfp)序列中的一个或多个。在其它实施方式中，使用其它荧光和/或发光蛋白(包括那些蛋白质的循环置换形式)，诸如在图6a(1)至图6a(54)和图7a(1)至图7a(88)(例如，seq id no:34-122)中公开的那些(以及前述任一种的变体)。
[0180]
在一些实施方式中，指示剂化合物的信号传导结构域具有与seq id no:1、14、34-121(如在图中所示)和/或222-823中的任一个相同的序列。在一些实施方式中，信号传导结构域具有为seq id no:1、14、34-121和/或222-823中的任一个的变体序列。在一些实施方式中，信号传导结构域具有独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:1、14、34-121和/或222-823中的任一个的序列相同的序列。在一些实施方式中，信号传导结构域具有序列，其独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:1、14、34-121和/或222-823中的任一个的序列的同源性或相似性。在一些实施方式中，信号传导蛋白或其信号传导结构域、片段或部分可以在n-末端和/或c-末端被许多氨基酸(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)截短或延伸(例如，用连接子)。
[0181]
在一些实施方式中，指示剂化合物的信号传导结构域的连续部分独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:1、14、34-121和/或222-823中的一个或多个的连续部分的同一性、同源性和/或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的信号传导结构域的连续部分独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:3-13和/或16-20中的一个或多个的连续部分的同一性、同源性和/或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分可以包括整个信号传导结构域、信号传导结构域的一个或多个片段(例如，发光片段)和/或信号传导结构域的信号传导单元。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分和/或seq id no:1、2、14、15、34-121和/或222-823中的一个或多个的连续部分等于或至少约为200、100、80、60、50、40、30、20或10个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)。
[0182]
在若干实施方式中，指示剂化合物可以包括多个(2个、3个、4个等)连续部分，其与seq id no:1、2、14、15、34-121和/或222-823的连续部分具有上述同一性值、同源性值或相似性值。为了说明，指示剂化合物可以包括长度为100个氨基酸的第一连续部分，其与seq id no:1的长度为100个氨基酸的连续部分具有80％至100％的同源性。另外，该指示剂化合物可以包括长度为80个氨基酸的不同的第二连续部分，其与长度为80个氨基酸的seq id no:1的不同的第二连续部分100％相同。
[0183]
在一些实施方式中，seq id no:1、2、14、15、34-121和/或222-823中的一个或多个的连续部分任选地具有相对于指示剂化合物的连续部分的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个氨基酸差异。在一些实施方式中，氨基酸差异包括插入、缺失和/或取代。在一些实施方式中，取代可包括任何一个或多个氨基酸取代其它氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸取代是保守的或非保守的(激进的)。保守置换(也称为保守突变或保守取代)是蛋白质(例如发光蛋白的)中的氨基酸置换，其将给定氨基酸改变为具有类似生化特性(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。在全文中使用的天然α-氨基酸的三个和单个字母缩写如下:
[0184]
[0185][0186]
有20个天然存在的氨基酸。其中一些具有类似的特性(是保守的)。例如，亮氨酸和异亮氨酸都是脂肪族、支化的疏水物。类似地，天冬氨酸和谷氨酸都是小的、带负电荷的残基。尽管有许多方法对氨基酸进行分类，但它们通常根据它们的结构和它们的侧链(r基团)的一般化学特性而被分类为六个主要类别。
[0187]
表1.
[0188][0189]
[0190]
在一些实施方式中，保守改变是在这六个类别中的一个类别或多个类别内的那些(例如，在表1的相同细胞中用一个氨基酸替代不同的氨基酸)。
[0191]
在一些实施方式中，当氨基酸被取代时，可用于替代天然氨基酸的一系列非天然氨基酸包括但不限于：3-氨基2-羟基吡啶；(2-呋喃基)丙氨酸；1-氨基-1-环己烷羧酸；(2-噻吩基)丙氨酸；2-氨基苯甲酸(2-abz)；2-吡啶基丙氨酸；1-氨基-1-环戊烷羧酸；2-氨基丁酸(2-abu)；3-氨基-3-苯基丙酸；氨基环戊烷羧酸(acpc)；4-氨基甲基苯甲酸(amb)；氨基异丁酸(aib)；对苯甲酰基-1-苯丙氨酸(bpa)；烯丙基甘氨酸；4-氨甲基环己烷羧酸(amc)；环己基-丙氨酸(cha)；δ-缬氨酸；δ-亮氨酸；氰基丁基丙氨酸(cba)；茚满基甘氨酸(igi)；3-(1-萘基)-丙氨酸；3-(2-萘基)丙氨酸(1-nai)；联苯丙氨酸(bip)；羟脯氨酸(hyp)；异哌啶甲酸(inp)；正缬氨酸(nva)；4-碘苯丙氨酸(phe(pi))；4-硝基苯丙氨酸；4-甲基苯丙氨酸；高苯丙氨酸(hphe)；4-氨基苯丙氨酸(phe4nh(boc)；苯基甘氨酸；丙氨酸(2
’‑
喹啉基)；丙氨酸(2’吡啶)；色氨酸；色氨酸n-甲基；2-氮杂环丁烷羧酸；哌啶甲酸(pip)；炔丙基甘氨酸；硫代脯氨酸(thz)；丁基甘氨酸(tle)；3-硝基酪氨酸；3-氨基苯甲酸(3-abz)；3-氨基-3-苯基丙酸；(1-茚满基甘氨酸)；(2-茚满基甘氨酸)；烯丙基甘氨酸；3-硝基酪氨酸；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸；β氨基酸；γ氨基酸；asp(叔丁基)-oh，3,3-二苯基-丙氨酸；3,3,3-二甲基苯基-丙氨酸；asp(β乙基)；glu(β-乙基)，asp(β-甲基)，asp(β-叔丁基)，glu(β-叔丁基)，leu(o-磷酸)，丝氨酸(o-磷酸)，丝氨酸(磷酸)，亮氨酸磷酸衍生物。
[0192]
在一些实施方式中，取代(例如，从发光蛋白到指示剂化合物的信号传导结构域的一部分)可以包括将氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任何一个或多个取代为氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任何一个或多个。在一些实施方式中，亲水性或非疏水性氨基酸被疏水性氨基酸(包括含有芳族基团的氨基酸，诸如苯基)替代。在若干实施方式中，提供另外的疏水性氨基酸已经显示出改善了蛋白质对温度的不敏感性。
[0193]
在若干实施方式中，这些修饰增加了结合蛋白的选择性。术语“增加的选择性”是指结合部分的构象变化，例如通过融合蛋白的两个信号传导部分之间的荧光和/或fret的降低可检测到的，对于至少一种除所需分析物(例如，葡萄糖)的化合物显著降低。以葡萄糖为例，此类其它化合物例如可以是糖，即单糖、二糖或寡糖、糖醇、其它碳水化合物，例如淀粉或碳水化合物与糖苷配基部分之间的缀合物。在若干实施方式中，构象变化的这种降低(例如，通过比较在所讨论的化合物0.1mm和10mm的浓度下由两个检测部分发射的能量变化来测量)等于或至少约20％、50％、80％、90％、99％、100％，或跨越和/或包括上述值的范围。在若干实施方式中，融合蛋白的结合部分对于至少一种化合物不显示任何显著的构象变化，对于所述化合物相应的野生型结合蛋白显示显著的构象变化。
[0194]
在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，指示剂化合物(例如，融合蛋白、拆分融合蛋白等)包括一种或多种结合蛋白或前述任一种的结合结构域、片段、活性部分或变体。在一些实施方式中，融合蛋白包括一种或多种d-半乳糖苷/甲基-半乳糖苷abc转运蛋白周质结合蛋白(mg1b)，或其结合结构域、片段、活性部分，和/或前述任一项的变体。在一些实施方式中，融合蛋白包括一种或多种葡萄糖/半乳糖结合蛋白(ggbp)序列或其结合结构域、片段、活性部分和/或前述任一项的变体。在一些实施方式中，融合蛋白包括一种或多种伴刀豆球蛋白、其结合结构域、片段、活性部分和/或前述任一项的变体。
[0195]
ggbp属于已进化为特异性识别葡萄糖/半乳糖分子的蛋白质的一大族。这些蛋白质的进化驱动力是帮助生物向葡萄糖迁移；一种通过活化趋化作用使生物存活的能量源。鉴于趋化作用在生物存活中的核心作用，这种蛋白质已在许多不同的物种得到保存。这些是在属于细菌、古细菌和真核生物分类组的许多生物中发现的葡萄糖结合蛋白族。在若干实施方式中，ggbp蛋白、其结合结构域、片段、活性部分，和/或前述任一项的变体用作指示剂化合物的分析物结合区域。
[0196]
伴刀豆球蛋白是另一类主要在许多种细菌和植物中发现的蛋白质。伴刀豆球蛋白a在本文中公开的指示剂化合物的应用中特别令人感兴趣，因为其结合葡萄糖并改变其蛋白质结构。蛋白质结构的这种变化可用于设计葡萄糖结合依赖性荧光变化，其具有基因工程的基于蛋白质的荧光标签或共价附接于蛋白质的荧光染料，该荧光染料在伴刀豆球蛋白a由于葡萄糖结合而改变其构象时感测环境的变化。这一葡萄糖结合蛋白族在跨越若干分类界的4251个不同物种中被发现，即植物、细菌、古细菌、真菌和病毒。这类蛋白质可以潜在地被替换为葡萄糖/半乳糖结合蛋白以用作葡萄糖检测器。在若干实施方式中，伴刀豆球蛋白、结合结构域、其片段、其活性部分和/或前述任一项的变体用作指示剂化合物的结合结构域。
[0197]
特别感兴趣的是来自已经在极端条件下进化成存活的生物的蛋白质(例如，信号传导蛋白和/或结合蛋白)。具有增强的鲁棒性的这些生物中的一些在高温/极端温度下存活，并且通常被称为嗜热菌/超嗜热菌，诸如嗜热栖热菌、硫化叶菌、富马氏菌、水生栖热菌等。在这些嗜热菌/超嗜热菌中发现的葡萄糖结合蛋白具有耐受极端温度的能力，这增加了蛋白质结构的稳定性。这种增加的蛋白质稳定性允许开发一种坚固耐用的传感器，具有可植入式传感器所必需的寿命和信号稳定性。在若干实施方式中，分析物结合蛋白、其结合结构域、片段、活性部分，和/或前述任一项的变体来自嗜热菌或超嗜热菌。在若干实施方式中，具有大量的葡萄糖结合蛋白允许通过从同样大量的葡萄糖结合蛋白中选择信号传导分子(荧光报告分子)来选择良好的葡萄糖结合片段以基因工程化嵌合荧光葡萄糖传感器的灵活性。在若干实施方式中，在本文中公开的指示剂化合物对ph值和/或温度具有增加的不敏感性。在若干实施方式中，衍生指示剂化合物的蛋白质对ph值和/或温度具有增加的不敏感性。在若干实施方式中，在本文中公开的指示剂化合物具有稳定性。在若干实施方式中，衍生指示剂化合物的蛋白质具有增加的稳定性。
[0198]
在一些实施方式中，分析物结合序列(例如，ggbp、伴刀豆球蛋白等)可以提供指示剂化合物的结合区域。在一些实施方式中，用于这些结合区域的分析物是葡萄糖(例如，与结合区域结合的分子)。在一些实施方式中，修饰结合蛋白或其结合结构域以排除翻译后修饰或其它区域，诸如n-末端信号肽。
[0199]
在一些实施方式中，融合蛋白分别包括如在图2b(例如，seq id no:2)和图3b(例如，seq id no:15)中所示的mg1b序列和/或葡萄糖结合蛋白氨基酸序列中的一个或多个。在其它实施方式中，使用其它分析物和/或结合蛋白(包括那些蛋白的循环置换形式)，包括在图8a(1)-图8a(100)(例如seq id no:122-221；伴刀豆球蛋白)和图9a(1)-图9a(43)(例如，seq id no:1704-1746；来自古细菌seq id no:1704-1734的ggbp蛋白，来自真菌seq id no:1735-1743的ggbp蛋白；来自植物seq id no:1744-1746的ggbp蛋白)(以及前述任一项的变体)中公开的那些。
[0200]
在一些实施方式中，指示剂化合物的结合区域(例如，葡萄糖结合区域)具有与seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746中的任一个的序列相同的序列(如在附图和/或所附序列表中所示)。在一些实施方式中，结合结构域具有是seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746中的任一个的变体的序列。在一些实施方式中，结合结构域具有独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746中的任一个的序列相同的序列。在一些实施方式中，结合区域具有序列，其独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746中的任一个的序列的同源性或相似性。在一些实施方式中，结合蛋白或其结合结构域、片段或部分在n-末端和/或c-末端被许多氨基酸(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)截短或延伸(例如，用连接子)。
[0201]
在一些实施方式方式，结合结构域(例如，糖结合结构域)、结合结构域的一个或多个片段和/或指示剂化合物的结合单元独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:2或seq id no:15中的一个或多个的连续部分的同一性、同源性和/或相似性。
[0202]
在一些实施方式中，指示剂化合物的结合结构域的连续部分独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746中的一个或多个的连续部分的同一性、同源性和/或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的结合结构域的连续部分独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:3-13和/或16-20中的一个或多个的连续部分的同一性、同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分可以包括整个结合结构域、结合结构域的一个或多个片段(例如，结合片段)和/或信号传导结构域的结合单元。在一些实施方式中，seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746中的一个或多个的连续部分等于或至少约为200、100、80、60、50、40、30、20或10个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)。
[0203]
在若干实施方式中，指示剂化合物可以包括多个(2个、3个、4个等)连续部分，其与seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746的连续部分具有上述同一性值、同源性值或相似性值。为了说明，指示剂化合物可以包括长度为80个氨基酸的第一连续部分，其与seq id no:15的长度为80个氨基酸的连续部分具有90％至100％的同源性。另外，该指示剂化合物可以包括长度为40个氨基酸的不同的第二连续部分，其与长度为40个氨基酸的seq id no:15的不同的第二连续部分100％相同。
[0204]
如将理解的，指示剂化合物可以包括信号传导和结合蛋白的单个或多个连续部分。作为说明，拆分指示剂化合物可以包括在y143和n144之间拆分的具有seq id no:2的seq id no:1。该结构将包括与seq id no:1的前143个氨基酸具有100％同一性的143个氨
基酸连续片段，与seq id no:2的332个氨基酸具有100％同一性的332个氨基酸连续片段，和与seq id no:1的后93个氨基酸具有100％同一性的95个氨基酸长度连续片段。
[0205]
在一些实施方式中，seq id no:2、15、122-221和/或1704-1746中的一个或多个的连续部分任选地相对于指示剂化合物的连续部分具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些实施方式中，氨基酸差异包括插入、缺失和/或取代。在一些实施方式中，取代可包括任何一个或多个氨基酸取代其它氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸取代是保守的或非保守的。在一些实施方式中，保守改变包括在表1中所示的这六个类别中的一个或多个内的那些。在一些实施方式中，当氨基酸被取代时，可以使用一系列非天然氨基酸(如在本文中别处公开的)替代天然氨基酸。在一些实施方式中，取代可包括将氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个取代为氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个。在一些实施方式中，亲水性或非疏水性氨基酸被疏水性氨基酸(包括含有芳族基团的氨基酸，诸如苯基)替代。在若干实施方式中，提供另外的疏水性氨基酸已经显示出改善了蛋白质对温度的不敏感性。
[0206]
在一些实施方式中，融合蛋白包括在本文中公开的一个或多个序列(或其变体)。在一些实施方式中，指示剂化合物(例如，融合蛋白)具有与seq id no:3-13和16-20中的任何一个或多个的序列相同的序列(如在图2c(1)-图2c(11)和图3c(1)-图3c(5)中所示)。在一些实施方式中，指示剂化合物具有独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与seq id no:3-13和16-20中的任一个的序列相同的序列(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，指示剂化合物具有序列，其独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与seq id no:3-13和16-20中的任一个的序列的同源性或相似性(或包括和/或跨越上述值的范围)。
[0207]
在一些实施方式中，指示剂化合物(例如，融合蛋白)的连续部分独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个的连续部分相同(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与seq id no:3-13和16-20中的一个或多个的连续部分的同源性或相似性(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分是等于或至少约为200、150、100、80、60、50或40个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的化合物的一部分。在一些实施方式中，seq id no:3-13和16-20的连续部分是等于或至少约为200、150、100、80、60、50或40个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的那些蛋白质的一部分。在一些实施方式中，seq id no:3-13或seq id no:16-20中的一个或多个的连续部分任选地具有相对于指示剂化合物的连续部分的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些实施方式中，氨基酸差异包括插入、缺失和/或取代。在一些实施方式中，取代可包括任何一个或多个氨基酸取代其它氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸取代是保守的或非保守的。在一些实施方式中，保守改变包括在表1中所示的这六个类别中的一个或多个内的那些。在一些实施方
式中，当氨基酸被取代时，可以使用一系列非天然氨基酸(如在本文中别处公开的)替代天然氨基酸。在一些实施方式中，取代可包括将氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个取代为氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个。
[0208]
在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，结合区域可用于除糖以外的分析物。在一些实施方式中，指示剂化合物的结合区域(例如，葡萄糖结合区域)具有与seq id no:824-1703中的任一个的序列相同的序列(如所附序列表所示)。在一些实施方式中，结合结构域具有是seq id no:824-1703中的任一个的变体的序列。在一些实施方式中，结合结构域具有独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:824-1703中的任一个的序列相同的序列。在一些实施方式中，结合区域具有序列，其独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:824-1703中的任一个的序列的同源性或相似性。在一些实施方式中，结合蛋白或其结合结构域、片段或部分在n-末端和/或c-末端被许多氨基酸(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)截短或延伸(例如，用连接子)。
[0209]
在一些实施方式中，指示剂化合物的结合结构域的连续部分独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:824-1703中的一个或多个的连续部分的同一性、同源性和/或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分可以包括整个结合结构域、结合结构域的一个或多个片段(例如，结合片段)和/或信号传导结构域的结合单元。在一些实施方式中，seq id no:824-1703中的一个或多个的连续部分等于或至少约为200、100、80、60、50、40、30、20或10个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)。
[0210]
在一些实施方式中，指示剂化合物中的连续氨基酸链(例如，具有200、150、100、50、40、30、25、20或10个连续残基，或包括和/或跨越上述值的范围)独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:1-1746中的任一个的一致的连续部分的同一性或同源性。
[0211]
在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，结合蛋白(例如，葡萄糖结合蛋白)和/或结合蛋白的结合部分拆分(通过插入)信号传导部分和/或发光蛋白的一个或多个发光片段。在其它实施方式中，如在本文中别处公开的，信号传导部分和/或发光蛋白的一个或多个发光片段拆分(通过插入)结合蛋白(例如，糖结合蛋白)和/或结合蛋白的结合部分。当沿着信号传导部分(和/或发光蛋白链的一个或多个发光片段)或沿着结合蛋白(和/或结合蛋白的结合部分)发生插入时，插入的位置可以因融合蛋白而不同，并且可以在任何位置发生，只要发生允许检测分析物的构象变化。
[0212]
在一些实施方式中，插入可以发生在被拆分的蛋白质的前10％内、被拆分的蛋白质的第二个10％内、被拆分的蛋白质的第三个10％内、被拆分的蛋白质的第四个10％内、被拆分的蛋白质的第五个10％内、被拆分的蛋白质的第六个10％内、被拆分的蛋白质的第七
个10％内、被拆分的蛋白质的第八个10％内、被拆分的蛋白质的第九个10％内、或被拆分的蛋白质的第十个10％内。例如，当插入在被拆分的100个氨基酸长度的蛋白质的第二个10％中，插入可以发生在氨基酸11至20中的任一个之间。插入可以在环、螺旋(例如，α-螺旋或π-螺旋)中，或在蛋白质或蛋白质片段的β-片的β-链中。插入部分可以在第一个四分之一(例如，1/4或在0％和25％之间)的拆分结构域的氨基酸内、第二个四分之一(例如，在1/4和2/4之间或在25％和50％之间)的拆分结构域的氨基酸内、第三个四分之一(例如，在2/4和3/4之间或在前50％和75％之间)的拆分结构域的氨基酸内，或在第四个四分之一(例如，在3/4和4/4之间或在前75％和100％之间)的拆分结构域的氨基酸内插入到拆分结构域中的一个位置处。
[0213]
在一些实施方式中，荧光分子是柠檬碱或其荧光片段或部分。在一些实施方式中，柠檬碱在以下氨基酸序列：nrielkgidfkedgnilghkleynynshnv内的位置处拆分。在一些实施方式中，柠檬碱在y144(或seq id no:1的y143，其缺乏第一甲硫氨酸)之后拆分。在一些实施方式中，分析物结合蛋白是葡萄糖/半乳糖结合蛋白(ggbp)，或其分析物结合片段或部分。在一些实施方式中，当ggbp是seq id no:2的ggbp时，ggbp在以下氨基酸序列：dgtnwkidnkvvrvpyvgvdkdnlaefskk内的位置处拆分。在一些实施方式中，ggbp在seq id no:2的p317(或seq id no:15的p295，其缺乏n-末端信号肽序列)之后拆分。在使用柠檬碱或ggbp的变体的情况下，被拆分的区域可以具有序列，其独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与nrielkgidfkedgnilghkleynynshnv或dgtnwkidnkvvrvpyvgvdkdn-laefskk的序列相同(或包括和/或跨越上述值的范围)。在使用柠檬碱或ggbp的变体的情况下，被拆分的区域可以具有序列，其独立地具有至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与nrielkgidfkedgnilghkleynynshnv或dgtnwkidnkvvrvpyvgvdkdn-laefskk的序列的同源性或相似性(或包括和/或跨越上述值的范围)。
[0214]
在一些实施方式中，指示剂化合物包括一种或多种以下蛋白质(通过其uniprot编号来识别)、其指示部分或其结合部分：p02916、p68183、p0aex7、p0a9k7、p33650、p0aff4、p0a9s7、p0a830、p31547、p14176、p0abv2、p46133、p0abu7、p23847、p0aft2、p15993、p0aff2、p64604、p0ad99、p43671、p21345、p22729、p10384、p0abb8、p64602、p64606、p0ae95、p30859、p06611、p0a6e6、p17315、p27254、p0aea2、p75712、p0aaf3、p0aae5、p31224、p52697、p0aaf6、p0a940、p0adp5、p0ab93、p76345、p32705、p37019、p32720、p32721、p45955、p0ae16、p0abc9、p0ab98、p30860、p0ae30、p0abe5、p76175、p39180、p0ae98、p0ae06、p0ae56、p31553、p39265、p36548、p0aba6、p0abd3、p46481、p77610、p0abb4、p75733、p24177、p69856、p63020、p07014、p0ag96、p0aab2、q47706、q46909、p45769、p21829、p0aaa7、p77328、q46819、q46892、p0agm9、p0afq2、p76344、p75683、p0abd1、p77716、p39832、p39830、p0aa49、p0afr7、p67444、q46905、p0aa73、p39325、p0a9t8、p0ag90、p77223、p25396、p77529、p77504、p27837、p0ag80、p09835、p77726、q46908、p0aga6、p77315、p0afp9、p76655、p43531、p45394、p37662、p37660、p43667、p0a850、p0agg4、p39263、p37197、p75693、p46136、p45767、p10907、p75750、p0ce44、p75783、p52102、p0ad03、p39414、p76269、p0adz7、p37674、p0aa63、p77269、q46833、p36879、p45537、
p60869、p33011、p63340、p31437、p77519、p63389、p32135、p0aeb5、p69820、p45766、p37642、p39172、p0aa70、p76335、p32137、p76115、p56256、p77536、p42915、p31435、p52005、p76272、p76042、p45768、p31436、p39301、p77400、p0agm0、p37388、p07604、q46863、p76630、p37387、p0aa57、p23173、p0afv2、p0a927、p37643、p0a9u3、p37621、p0agc0、p75757、p37676、p0afn6、p37675、p75763、p0agh1、q46834、p10906、p0abt8、p39328、p39321、p31135、p31549、p0afy6、p31679、p0aah4、p77714、p33941、p46121、p36881、p20966、p69816、p33913、p76628、p0aey8、p24241、p02930、p0a766、p77795、p45562、p39901、p0a9x1、p58035、c1p5z7、p10905、p52052、p0aa25、p39365、p33361、p33362、p0a710、p39277、p02929、p65367、p60778、p76356、p37188、p75835、p0aal9、p0a853、p43672、q46871、p0afz7、p0ag93、p0aga2、p0agi4、p52636、p37774、p0a930、p31448、p76350、p0agh3、p0a855、p31122、p76224、p30143、p00550、p02925、p0agf4、p75870、p25714、p0afs7、p33915、p0dp21、p33359、p45420、p0aad4、p37619、p76186、p33360、p0af43、p77481、p0aa60、p37327、p0aah8、p69822、q46821、p77156、p75788、p75810、p25747、p0afr9、p76173、p76909、p0aat4、p69210、p45762、p04983、p00448、p76201、p39352、p39357、p77179、p77611、p0agh5、p77378、p0ac98、p21503、p52647、p32154、p77272、p33024、p0abw3、p77409、p0afu2、p0afu0、p07001、p69826、p77285、p77228、p39282、p37772、p38055、p33916、q47539、p77499、p24207、p64559、p0aai1、p31675、p10408、p76352、p0ag78、p0aad8、q47622、p42910、p77439、p76182、p76037、p37177、p0agi8、p08722、p77338、p33594、p0ac41、p0aad6、p0afs5、p76027、p0a8t1、p76470、p77468、q47689、p76399、p09348、p23482、p0adc6、p31134、p76045、p0ac96、p0ag38、p76197、p0agm7、p39386、p77682、p31826、p77389、p33341、p76230、p0add5、p76108、p0a754、p19934、p0ag99、p75851、p77549、p75853、p37440、p0age4、p76417、p77196、p76198、p0ad30、p38101、p0a910、p37597、p0add2、p11350、p69434、p43676、p32136、p32703、p39836、p0ag86、p33026、p31126、p0aaj1、p67729、p0a8h3、p0aak7、p37746、p76425、p69824、p13445、p56579、p69811、p31548、p76278、p64423、p42911、p69831、p0abu9、p0af06、p69428、p33021、p36672、p0ade4、p0agh8、p09836、p0a9u1、p42590、q46907、q6bex0、p0aef8、p77031、p0afj7、p0aa67、p0abv6、p37617、p60872、p77509、q46832、p06996、p42909、p77579、p76773、p27125、p27844、p09323、p69783、p0afl1、p0afl9、p0afj5、q46877、p0c0l7、p31133、p0adl1、p32670、p08839、p13738、p19642、p0abl5、p0afa9、p33602、p32676、q47538、p0aae2、p0afa2、p29745、p19319、p21420、p32672、p69789、p23849、p41442、p08400、p0aa04、p42905、p36929、p33226、p75892、p69425、p0ag82、p09378、p56580、p69786、p69423、p39363、p0aff0、p31550、p75831、p02932、p0a7n1、q47537、p0a843、p0afk9、p38683、p0aam1、p17583、p37340、p0a9v1、p25737、p0ack2、p31069、p0afc3、p54745、p36646、p16685、p16256、p16677、p39285、p16678、p77589、p69212、p33231、p75742、p39835、p0a6x7、p41443、p45763、p16682、p0dp70、p60061、p46846、p31474、p39398、p0adv1、a5a616、p37028、p33129、p0aag5、p0acj0、p22731、p0afh6、p15030、p16869、p68688、p64638、p0ad96、p25527、p77672、p37595、p23200、p75824、p0abn5、p77308、p75857、p0afs1、p06972、p0ael6、p25744、p45756、p63386、p45757、p36937、p0ae63、p0aee5、p13669、p75958、p39276、p15029、p0ael3、p37349、p37902、p0abl8、p0aba4、p0abm1、p0ac59、p0aer5、p0ac62、p0a712、p0adv7、p07654、p69797、p69805、p0ag34、p05706、p0a915、p69791、p17334、p0afe8、p0afa7、p0ac65、p69828、p33607、p69801、p0aaz4、p69795、p0aag0、p32714、p16432、p75826、p0agi1、p32155、p04982、p31452、p0a742、p02931、p69808、
p0c0s1、p11349、p37758、p60752、p0a9f1、p0a996、p42628、p37329、p0a759、p33590、p0afk4、p0afh2、p0afk6、p77423、p63183、p16429、p42904、p19318、p0ab10、p07117、p77348、p0afe4、p37624、p0aak1、p03817、p23930、p0a9i5、p16684、p0abk9、p77737、p09833、p0aba0、p52599、p24169、p76242、p0a9g8、p23843、p0aeg1、p77257、p14175、p69874、p75901、p39344、p03960、p75830、p08189、p0a9a9、p52094、p36645、p0afm2、p41036、p33591、p76264、p08190、p31462、p76398、p31554、q47142、p75797、p0a6m2、p0ack5、p75798、p52074、p45758、p45522、p38038、p16701、p0af52、p0aai3、p77279、p0aex3、p68699、p03959、p76249、p0ae74、p75681、p77307、p32715、p75957、p69367、p29018、p38135、p0ac94、p03961、p37180、p0a9r7、p76552、p69451、p0adc3、p0af98、p16700、p06149、p0aeq6、p52612、p76014、p0aep1、p76343、p09152、p0a769、p0a6t1、p10903、p0af16、p33593、p0aal3、p33937、p0af01、p0abl3、p0aad2、p0aah0、p77747、p45761、p75796、p68187、p02921、p76081、p76078、p39396、p23895、p07109、q46916、p60664、p0dp69、p31060、p33599、p36837、p23485、p23878、p76555、p0ab24、p23481、p41441、p31442、p63235、p37339、p0afi9、p0afk2、p0aeu0、p24232、p37637、p45759、p0aex9、p0abb0、p0abj1、p61949、p0abl1、p33934、p0ac26、p0afc7、p37002、p36678、p04816、p76007、p0adc1、p08200、p00634、p0af32、p40191、p0aa47、p0aeu3、p76397、p0aaf1、p52600、p0abj9、p02920、p64550、p0abk2、p0abn9、p23876、p26266、p76128、p0a8v6、p0ac47、p76299、p0aae0、p45539、p77211、p0abt5、p0ac23、p45428、p60566、p77622、p76298、p0a6j3、p77463、p77268、p0ae26、p69681、p27303、p0a998、p0abp3、p09394、p0a9r4、p69490、p26459、p0ac02、p0abm5、p33931、p56100、p0aae8、q46839、p24180、p0a901、p75925、p0aaw9、p09551、p0aa82、q47377、p36655、p39196、p0a756、p45760、p02943、p03819、p77304、p69054、p0abw0、p37195、p0aaj3、p26648、p07822、p0abj3、p0aeq3、p06971、p00393、p0aa76、p68646、p22255、p0aeb0、p36554、p34749、p03841、p31125、p08194、p0abg4、p37636、p0afr2、p54746、p28635、p0aag8、p61320、p0adv9、p75799、p76506、p76474、p06609、p31466、p31574、p31068、p15028、p69380、p77265、p16676、p30750、p25960、p0aak4、p06989、p39163、p24181、p38054、p32716、p61316、p08555、p0abi8、p68644、p0af61、p23484、p0aa78、p0a9a2、p29131、p0ael0、p37313、p0aej0、p23877、p77733、p0ac05、p0aaj5、p52613、p0c8j8、p0aek7、p0aer0、p69937、p18777、p16703、p23910、p0a8s1、p76460、p36930、p31440、p06129、p26218、p76015、p0a9e0、p31545、p10346、p77239、p75780、p07821、p00363、p0abc0、p0aen1、p0aby4、p11551、p27296、p11667、p15078、p10378、p0ae12、q46817、p15031、p0c8j6、p05825、p63883、p06610、q59385、p31801、p30130、p0aag3、p28246、p0abj6、p46482、p60844、p0aem9、p0ae34、p0a932、p0abi4、p37009、p24077、p52067、p26458、p77802、p0aa80、p23886、p13039、p0aer8、p0ae78、p0ae24、p13036、p02924、p69922、p18776、p0aer3、p0ac44、任何前述的发光或荧光片段、任何前述的部分或任何前述的变体。在一些实施方式中，指示剂化合物(例如，融合蛋白)包括一种或多种蛋白质，其具有独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与在本文中通过其uniprot编号识别的(或包括和/或跨越上述值的范围)蛋白质中的任一种的序列相同的序列。在一些实施方式中，指示剂化合物(例如，融合蛋白)包括一种或多种蛋白质，其独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与在本文中通过其uniprot编号识别的(或包括和/或
跨越上述值的范围)蛋白质中的任一种的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物(例如，融合蛋白)的连续部分独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与在本文中通过其uniprot编号识别的(或包括和/或跨越上述值的范围)蛋白质中的任一种的连续部分相同。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与在本文中通过其uniprot编号识别的(或包括和/或跨越上述值的范围)蛋白质中的任一种的连续部分的同源性或相似性。在一些实施方式中，指示剂化合物的连续部分是等于或至少约为200、150、100、80、60、50或40个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的化合物的一部分。在一些实施方式中，在本文中通过其uniprot编号识别的(或包括和/或跨越上述值的范围)蛋白质的连续部分是等于或至少约为200、150、100、80、60、50或40个氨基酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的那些蛋白质的一部分。在一些实施方式中，在本文中通过其uniprot编号识别的蛋白质的连续部分任选地具有相对于指示剂化合物的连续部分的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些实施方式中，氨基酸差异包括插入、缺失和/或取代。在一些实施方式中，取代可包括任何一个或多个氨基酸取代其它氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸取代是保守的或非保守的。在一些实施方式中，保守改变包括在表1中所示的这六个类别中的一个或多个内的那些。在一些实施方式中，当氨基酸被取代时，可以使用一系列非天然氨基酸(如在本文中别处公开的)替代天然氨基酸。在一些实施方式中，取代可包括将氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个取代为氨基酸a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y中的任一个或多个。在一些实施方式中，指示剂化合物中的连续氨基酸链(例如，具有200、150、100、50、40、30、25、20或10个连续残基，或包括和/或跨越上述值的范围)独立地具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与在本文中通过其uniprot编号识别的蛋白质的一致连续部分的同一性或同源性。
[0215]
作为完全基因工程化的葡萄糖结合荧光蛋白的替代方案，荧光染料可共价附接到指示剂化合物的结合结构域(例如，蛋白质，诸如ggbp或伴刀豆球蛋白a)。这些染料可以在从它们各自的蛋白质表达系统中纯化结合蛋白之后作为后续步骤结合。在一些实施方式中，这将涉及工程化共价结合位点，诸如葡萄糖结合结构域上的特定位点上的半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸残基，使得由于分析物(例如，葡萄糖)结合引起的蛋白质中的构象变化被拾取作为共价附接的染料上的荧光变化。在一些实施方式中，特异性地拾取染料以感测随蛋白质中的构象变化的这种环境变化。通常，这些染料根据其环境的极性改变其荧光倾向。
[0216]
示例性染料包括但不限于吲哚、cascade yellow、prodan、dansyl、dapoxyl、(2-(4-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-7-基))(nbd)、1-(3-羧基苄基)-4-(5-(4-甲氧苯基)oxazol-2-基)溴化吡啶(pympo)、芘和二乙氨基香豆素是表现出这种特性的化学基团。基于这些化学部分，已经在商业上开发了大量的荧光染料，以位点特异性地附接到前面所述的蛋白质上的结合位点，即对半胱氨酸具有硫醇反应性，对赖氨酸和精氨酸残基具有胺反应性，对天
冬氨酸和谷氨酸残基具有羧酸反应性。这些反应可以包括与例如碳二亚胺如edc的偶联反应。
[0217]
除了简单地检测荧光的变化之外，称为fret(共振能量转移)的另一种现象可以交替地用于检测结合蛋白(例如，葡萄糖结合蛋白，诸如ggbp或伴刀豆球蛋白a)中的构象变化。fret是一种特性，其中被称为供体的一种荧光染料的激发电子的能量传递到附近的受体荧光染料上，该受体荧光染料具有与供体染料的发射光谱重叠的激发光谱，导致供体的荧光减少，而受体的荧光增加。这可用于通过仔细设计分析物(例如葡萄糖)结合蛋白上的荧光位点来检测蛋白质构象的变化。fret足够通用足以适应荧光染料或荧光蛋白(gfp)的使用。在商业上，两种荧光染料都有大量的fret对，包括但不限于cy3-cy5、荧光素-四甲基罗丹明、iaedans-荧光素、edans-dabcyl等和荧光蛋白(cfp-yfp、gfp-rfp)。这里需要注意的是，每一对在受体和供体荧光之间都具有一个独特的最佳距离。受体和供体的附接位点的模块化设计允许开发这种基于fret的葡萄糖传感器。
[0218]
基于稳定蛋白质的分析物(例如葡萄糖)传感器的一般特征包括以下中的一个或多个(或其它特性)：存在额外的氢键相互作用，富含基于静电的盐桥，富含蛋白质核心内的额外的二硫桥，更高水平的稳定蛋白质核心的疏水性氨基酸。分析物(例如葡萄糖)结合蛋白的稳定性将转化为构建的分析物(例如葡萄糖)传感器的更大的稳定性。蛋白质的上述一般特征降低了任何可溶性蛋白质的解折叠速率。通过扫描其它生物中ggbp蛋白的变体，特别是被分类为在极端温度、ph条件、高盐浓度、高压、电离辐射等条件下进化的极端微生物的物种，将有助于选择开发传感器的最佳葡萄糖传感器。
[0219]
如在本文中公开的，葡萄糖结合蛋白用于构建葡萄糖传感器的这种应用可以扩展到其它分析物。存在结合各种分析物的大组蛋白质(包括在本文中别处的uniprot列表中提供的那些)。可以将这些葡萄糖结合蛋白替换为其它分析物结合蛋白，以将此应用扩展到检测其它分析物。在一些实施方式中，指示剂化合物可用于体内、离体和/或体外分析物测量。在一些实施方式中，分析物可以包括任何感兴趣的分子(例如，糖、代谢物诸如nadph、重金属、ca
2+
、钠、钾、氯化物、铁、铜、锌、镁、磷、尿素、肌酐、磷酸盐、o2、co2、碳酸氢盐、胆固醇、hdl、ldl、甘油三酯、c反应蛋白、tsh、pth、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白、胆红素、afp、hcg、癌胚抗原、psa、pap、降钙素、睾酮、双氢睾酮、黄体酮、fsh、lh、雌二醇、皮质醇、生长激素、醛固酮、维生素a、维生素b、维生素c、维生素d、维生素e、铅、乙醇、ldh或淀粉酶，或其任何组合)，其可以用于确定指示剂化合物所处的环境的特征。例如，在一些实施方式中，分析物是质子(例如，h
+
)，并且所测量的环境特征是ph。在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，分析物是葡萄糖。因此，该指示剂可用于测量例如糖尿病患者、糖尿病前期患者或非糖尿病患者的血糖。在若干实施方式中，分析物是结合大肠杆菌转运蛋白的配体，诸如seq id no:824-1703的那些。
[0220]
此外，基于周质结合蛋白的一般蛋白结构，可以合理地设计或人工指导进化，使得这些蛋白质可以开发与其它分析物的结合能力。本实施方式的肽或蛋白质可以通过各种方法生产和获得。例如，肽可以通过基因工程、基于编码本实施方式的肽的核苷酸序列产生，或者通过肽固相合成等化学合成，或者以它们的组合产生和获得。固相肽合成领域的技术人员可以容易地在(d)以及(l)或(r)以及(s)立体化学构型中掺入天然或非天然氨基酸。本实施方式的肽可以是线性的或环状的，并且可以包括(d)以及(l)氨基酸。本实施方式的肽
还可以包含一种或多种稀有氨基酸(诸如4羟基脯氨酸或羟基赖氨酸)、有机酸或酰胺和/或常见氨基酸的衍生物，诸如具有c末端羧酸酯化的氨基酸(例如，苄基、甲基或乙酯)或酰胺化的氨基酸和/或具有n末端氨基的修饰的氨基酸(例如乙酰化或烷氧基羰基氨基)，具有或不具有多种侧链修饰和/或取代(例如，甲基化、苄基化、叔丁基化、甲苯磺酰化、烷氧基羰基氨基等)中的任一种。可能存在的除常见氨基酸以外的残基包括但不限于青霉胺、四亚甲基半胱氨酸、五亚甲基半胱氨酸、巯基丙酸、五亚甲基-巯基丙酸、2-巯基苯、2-巯基苯胺、2-巯基脯氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、氨基己二酸、m氨基甲基苯甲酸和二氨基丙酸。本实施方式的肽可以通过本领域技术人员已知的各种方法生产和获得。例如，肽可以通过基因工程、基于编码本实施方式的肽的核苷酸序列产生，或者通过肽固相合成等化学合成，或者以它们的组合产生和获得。
[0221]
一些实施方式涉及翻译成具有seq id no:1-20或33-1746的序列的一种或多种蛋白质的核酸序列，或涉及包括seq id no:1-20或33-1746的多个蛋白质的融合蛋白(例如，拆分指示剂化合物)。可以设想，可以将多个核酸序列翻译成在本文中公开的蛋白质。在一些实施方式中，核酸序列的不同之处在于编码相同氨基酸的密码子。在一些实施方式中，核酸序列是针对某种生物(诸如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、山羊、猪、鸡、真菌、酵母、细菌或原生动物)进行密码子优化的。
[0222]
如在本文中别处公开的，某些实施方式涉及具有增强的稳定性的指示剂化合物。若干种ggbp蛋白对ph变化敏感。鉴于这些发现，产生了ggbp蛋白并筛选了新的特性，即对葡萄糖的较高选择性和/或对ph变化的增加的不敏感性。在一些实施方式中，其中组氨酸被修饰使得它们的侧链不能质子化的ggbp融合蛋白对ph更不敏感。截断还可以改善对ph的稳定性。
[0223]
在一些实施方式中，融合蛋白还包括一个或多个连接第一和/或第二信号传导部分与结合部分(或第一和/或第二结合部分与信号传导部分，视情况而定)的连接子肽。此类连接子肽原则上可以具有任何长度和氨基酸序列，其确保它们不会负面干扰融合蛋白的分析物检测功能。在若干实施方式中，连接子包括等于或大于约1个氨基酸、3个氨基酸、5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、25个氨基酸、35个氨基酸、50个氨基酸，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，可以使用任何氨基酸。在若干实施方式中，连接子主要或仅由亲水性氨基酸残基组成，诸如甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和/或丝氨酸残基。
[0224]
一些实施方式还涉及编码融合蛋白和/或指示剂化合物的核苷酸序列以及将那些序列递送至生物以使那些指示化合物被表达的方法。此外，一些实施方式涉及使用所述融合蛋白检测样品中或细胞中的分析物的方法，并且任选地，允许校准由所述融合蛋白进行的分析物检测的对照传感器。在一些实施方式中，公开了对照传感器和对其编码的核酸分子，以及诊断组合物、试剂盒以及融合蛋白和对照传感器用于体外或体内分析物检测和用于制备诊断组合物的用途。
[0225]
在一些实施方式中，编码指示剂化合物的核苷酸具有与seq id no:21-33中的任一个的序列相同的序列(如在图4a(1)-图5a(5)中所示)。在一些实施方式中，指示剂化合物具有独立地等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％与seq id no:21-33中的任一个的序列相同的序列(或包括和/或跨越上述值的范围)。一些实施方式涉及可以在中
等或高度严格条件下杂交这些序列的一部分的任何核酸。
[0226]
在一些实施方式中，编码指示剂化合物的dna的连续部分至少等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分相同。在一些实施方式中，编码指示剂化合物的dna的连续部分具有等于或至少约60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)与seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分的同源性或相似性。在一些实施方式中，编码指示剂化合物的dna的连续部分等于或至少约为200、150、100、80、60、50或40个核苷酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)。在一些实施方式中，seq id no:21-33中的一个或多个的连续部分是等于或至少约为200、150、100、80、60、50或40个核苷酸长度(或包括和/或跨越上述值的范围)的那些dna的一部分。
[0227]
一些实施方式涉及包括在本文中别处公开的核酸分子(例如，seq id no:21-33等)和/或转录在本文中公开的蛋白质的核酸(例如，seq id no:1-20和34-1746)的表达盒。在一些实施方式中，核酸分子与允许在原核或真核细胞中表达的控制序列可操作地连接。合适的表达控制序列包括可应用于靶宿主生物的启动子。此类启动子对于来自原核和真核生物的多种宿主是本领域技术人员熟知的，并且在文献中有描述。例如，此类启动子可以从天然存在的基因中分离出来，或者可以是合成的或嵌合的启动子。同样地，启动子可以已经存在于靶基因组中，并且将通过本领域已知的合适技术，例如同源重组与核酸分子连接。
[0228]
在一些实施方式中，载体适用于转化真菌细胞、植物细胞、微生物细胞(即细菌、原生生物、酵母、藻类等)或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，此类载体适用于人细胞的转化。除了核酸分子或表达盒之外，载体还可以包含其它基因，诸如标记基因，其允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下选择所述载体。通常，载体还包含一个或多个复制起点。有利地，包含在载体中的核酸分子可以可操作地连接至表达控制序列，从而允许在原核或真核细胞中表达，即确保可翻译的rna的转录和合成。
[0229]
一方面，核酸分子在原核或真核细胞中的表达是令人感兴趣的，因为它允许更精确地表征由这些分子编码的融合蛋白的功能。此外，可以通过分子生物学中常用的方法将不同的其它突变插入核酸分子中(参见例如sambrook和russell(2001),molecular cloning:a laboratory manual,csh press)，导致可能具有修饰特性的蛋白质的合成，例如如结合亲和力或能量发射(例如ret)效率。在这方面，可以通过插入或缺失编码序列来突变载体中存在的核酸分子，或者通过替换相应的密码子三联体来引入氨基酸取代。
[0230]
对于基因工程，例如在原核细胞中，可以将核酸分子或这些分子的部分引入允许通过dna序列的重组进行诱变或序列修饰的质粒中。标准方法(参见sambrook和russell(2001),molecular cloning:a laboratory manual,csh press)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。dna片段可以通过对片段应用接头和连接子而相互连接。此外，可以使用提供合适的限制性位点或去除过量的dna或限制性位点的工程措施。在其中插入、缺失或取代是可能的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。通常，进行序列分析、限制性分析等生物化学和分子生物学的方法作为分析方法。
[0231]
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间
的关系，如通过序列对齐和比较所确定的。“同一性百分比”是指在比较的分子中氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分比，并且是基于所比较的最小分子的大小计算的。对于这些计算，优选地通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决对齐中的空位(如果有的话)。可用于计算对齐的核酸或多肽的同一性的方法包括在computational molecular biology,(lesk,a.m.编,1988,new york:oxford university press；biocomputing informatics and genome projects,(smith,d.w.编),1993,new york:academic press；computer analysis of sequence data,part i,(griffin,a.m.,和griffin,h.g.编),1994,new jersey:humana press；von heinje,g.,1987,sequence analysis in molecular biology,new york:academic press；sequence analysis primer,(gribskov,m.和devereux,j.编),1991,new york:m.stockton press；以及carillo et al.,1988,siam j.applied math.48:1073。
[0232]
在计算同一性百分比时，被比较的序列通常以给出序列之间最大匹配的方式进行对齐。可用于确定同一性百分比的计算机程序的一个示例是gcg程序包，其中包括gap(devereux等人，1984，nucl.acid res.12:387；genetics computer group,university of wisconsin,madison，wis.)。计算机算法gap用于对齐要确定百分比序列同一性的两个多肽或多核苷酸。序列被对齐以实现它们各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，由算法确定)。空位开放罚分(计算为平均对角线的3倍，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是分配给每个完美氨基的分数或数量通过特定的比较矩阵进行酸匹配)和空位扩展罚分(通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵(诸如pam 250或blosum 62)与算法结合使用。在某些实施方式中，标准比较矩阵(参见，用于pam 250比较矩阵的dayhoff et al.,1978,atlas of protein sequence and structure 5:345-352；用于blosum 62比较矩阵的henikoff et al.,1992,proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:10915-10919)也被该算法使用。
[0233]
可用于使用gap程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的参数的示例如下：算法：needleman等人，1970，j.mol.biol.48:443-453比较矩阵:blosum 62，来自henikoff等人,1992,上述空位罚分：12(但没有末端空位的罚分)空位长度罚分：4相似阈值：0。
[0234]
用于对齐两个氨基酸序列的某些对齐方案可能导致仅匹配两个序列的短区域，并且即使两个全长序列之间没有显著关系，该小对齐区域也可能具有非常高的序列同一性。因此；如果需要，可以调节选择的对齐方法(gap程序)，以产生跨越靶多肽的至少50个或其它数量的连续氨基酸的对齐。
[0235]
如在本文中所使用和如在本文中别处所述，20种常规(例如，天然存在的)氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见immunology
‑‑
a synthesis(第二版，e.s.golub和d.r.gren编,sinauer associates,sunderland,mass.(1991))，其出于任何目的通过引用并入本文。20种常规氨基酸、非天然氨基酸，诸如α.-、α-二取代氨基酸、n-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸的立体异构体(例如d-氨基酸)也可以是本发明的多肽的合适组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-n,n,n-三甲基赖氨酸、ε-n-乙酰基赖氨酸、o-磷酸丝氨酸、n-乙酰基丝氨酸、n-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-n-甲基精氨酸，以及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文中所用的多肽符号中，按照标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
[0236]
类似地，除非另有说明，否则单链多核苷酸序列的左手端是5’末端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生rna转录物的5’至3’的添加方向称为转录方向；dna链上具有与rna相同的序列并且是rna转录物的5’至5’末端的序列区域被称为“上游序列”；dna链上具有与rna相同的序列并且是rna转录物的3’到3’末端的序列区域被称为“下游序列”。
[0237]
保守性氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过在生物系统中的合成掺入。这些包括肽模拟物和其它反转或反向形式的氨基酸部分。
[0238]
如在本文中别处公开的，天然存在的残基可以基于共同的侧链特性被分为以下数类:
[0239]
1)疏水性:正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0240]
2)中性亲水性:cys、ser、thr、asn、gln；
[0241]
3)酸性:asp、glu；
[0242]
4)碱性:his、lys、arg；
[0243]
5)影响链取向的残基:gly、pro；以及
[0244]
6)芳族:trp、tyr、phe。
[0245]
例如，非保守取代可涉及将这些类别之一的成员替换为来自另一类别的成员。此类取代的残基可以被引入，例如，人抗体与非人抗体同源的区域，或分子的非同源区。
[0246]
根据某些实施方式，在对本文中指定的蛋白质结构域进行改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。根据其疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被赋予了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
[0247]
本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性。kyte等人,j.mol.biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可以取代具有类似的亲水指数或分数的其它氨基酸，并且仍然保持类似的生物活性。在某些实施方式中，在基于亲水指数进行改变时，包括亲水指数在
±
2内的氨基酸的取代。在某些实施方式中，包括在
±
1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方式中，包括在
±
0.5内的氨基酸的取代。
[0248]
本领域还应理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代，特别是在由此产生的生物功能性蛋白或肽旨在用于免疫学实施方式的情况下，如在本发明的情况下。在某些实施方式中，由蛋白质的相邻氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物特性相关。
[0249]
已将以下亲水性值赋予这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0
±
1)；谷氨酸(+3.0
±
1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(
±
0.2)；谷氨酰胺(
±
0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5
±
1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于类似的亲水性值进行改变时，在某些实施方式中，包括亲水性值在
±
2内的氨基酸的取代，在某些实施方式中，包括在
±
1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方式中，包括在
±
0.5内的氨基酸的取代。还可以根据亲水性从一级氨基酸序列中识别
表位。这些区域也被称为“表位核心区域”。
[0250]
装置
[0251]
一些实施方式涉及可以包括一种或多种如在本文中公开的指示剂化合物的装置。在一些实施方式中，该装置是传感器，如在图10a中所示。在一些实施方式中，传感器500被植入需要监测和/或治疗的受试者(例如，糖尿病患者、糖尿病前期患者或需要监测的另一名患者)的体内。在一些实施方式中，如在图10a中所示，传感器是植入物。在一些实施方式中，传感器500插入表皮600下并进入真皮601。在一些实施方式中，传感器的指示剂化合物503允许检测分析物600(例如，葡萄糖)和/或允许量化分析物的量。在一些实施方式中，可以用电磁辐射(例如，诸如光辐射的光信号)来询问传感器。在一些实施方式中，光信号504”(例如，荧光)用于照射传感器500。在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，被照射的传感器500提供荧光以提供返回光信号504”。在一些实施方式中，由传感器500产生的光信号504”可以经皮肤检测(例如，通过皮肤和/或经由皮肤的上层)。在一些实施方式中，例如，询问装置502用于通过皮肤照射传感器。在一些实施方式中，询问装置502还(或可选地)用于通过皮肤从传感器收集信号504”。在一些实施方式中，这种配置允许传感器500与外部环境之间的直接通信。例如，患者可以使询问装置接近传感器，此时询问装置询问传感器以提供关于存在的分析物的量的数据。在一些实施方式中，这对于糖尿病患者的长期护理相关是特别有利的。在一些实施方式中，一旦传感器500在皮肤内和/或皮肤下就位，则根据需要(例如，由包括患者、医务人员等的用户)经常读取分析物的读数。在一些实施方式中，传感器允许频繁读取分析物(例如，葡萄糖)测量结果和更精确地控制体内的分析物水平(例如，血糖水平)。例如，通过提供更连续的葡萄糖水平测量，可以更好地避免高葡萄糖水平。避免较高的血糖水平可以允许患者延迟或避免相关病症的发作，诸如视网膜病变、关节炎和循环恶化。在一些实施方式中，可以降低出现与分析物控制不佳相关的症状的风险。
[0252]
在一些实施方式中，如在图10a中所示，传感器500本身不包含任何光学部件。在一些实施方式中，这些部件单独提供(例如，也是体外的)。在一些实施方式中，传感器500配置为由产生光信号504’(例如，来自发光二极管、激光器等)的发光装置502询问。在一些实施方式中，发光装置502是移动式的(例如，手持装置)。在若干实施方式中，装置的光源504配置用于执行传感器装置的远程询问。在一些实施方式中，发光装置包括激发过滤器，诸如一个或多个发光二极管504(二向色或染料过滤器)。
[0253]
在若干实施方式中，发光装置502还配置为接收来自传感器的信号。在若干实施方式中，如在图10a中所示，发光装置502可以包括一个或多个荧光检测器505、506(例如，作为荧光计的一部分)。在一些实施方式中，发光装置包括荧光计。在一些实施方式中，荧光计配置为测量来自指示剂化合物的荧光信号的皮摩尔浓度至飞摩尔浓度。在一些实施方式中，如图所示，测量分析物的量是通过将荧光计保持在靠近皮肤或抵靠皮肤来进行的。
[0254]
当经皮测量传感器内部产生的荧光信号时，可能需要考虑皮肤对信号的吸收。在若干实施方式中，对人体皮肤的吸收进行校正(例如，从所接收的信号分离)，以允许对信号进行量化。
[0255]
在一些实施方式中，如图所示，传感器还产生由参考过滤器506测量的参考信号。该参考信号可以从读取过滤器检测器505中扣除以提供校准信号。参考信号可以通过测量来自未被分析物结合的指示剂化合物的基线信号来产生。在若干实施方式中，信号504’、
504”由编码器507接收，编码器507向传输器508提供关于分析物水平的数据。在若干实施方式中，传输器与可以在询问装置外部或询问装置内部的接收机的信号通信。在若干实施方式中，内部单元(例如，传感器500)不需要电源，因为它使用来自外部单元的光来询问电源。在一些实施方式中，发光装置502也是由传感器产生的信号的接收器。在一些实施方式中，接收器508与显示器通信以产生指示分析物存在水平的读数。在若干实施方式中，显示器可以由患者或医疗从业者读取。在若干实施方式中，接收器将信号(例如，通过例如蓝牙等无线地)传输到手持装置(例如，智能电话、平板电脑等)。在若干实施方式中，可选地，询问装置是手持装置。
[0256]
在一些实施方式中，如在本文中别处公开的以及如在图10a中所示，传感器可以包括指示剂化合物驻留在其中的基体材料501。可选地，在未示出的一些实施方式中，指示剂化合物可以结合到传感器的外表面上。在若干实施方式中，指示剂化合物可以通过配价键、范德华力等共价结合到基体材料501内和/或基体材料501上。在若干实施方式中，基体材料是生物相容性材料。在若干实施方式中，基体材料是水凝胶。在若干实施方式中，水凝胶配置为允许分析物传输进和传输出基体材料。在一些实施方式中，分析物通过基质的快速扩散(例如扩散控制)传输允许实时监测体内的分析物浓度。在若干实施方式中，水凝胶可以使用常规方法制备，包括但不限于聚合一种或多种单体与多官能交联剂。可以作为水凝胶提供的一些聚合物包括交联的：蛋白质、肽和生物分子(包括聚合物诸如人白蛋白、纤维蛋白凝胶等)、多糖(包括但不限于由阿拉伯木聚糖、淀粉、琼脂糖、纤维素、甲壳质、藻酸盐、透明质酸盐等产生的那些)及其衍生物，聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乙二醇)(peg)、聚(l-乳酸)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚羟基丁酸酯(phb)、聚羟基戊酸酯(phv)、phb和phv的共聚物、聚己内酯、聚酐、聚羟基丁酸酯、聚(乙烯醇)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚(柠檬酸八亚甲基酯)(poc)、聚(马来酸八亚甲基酯柠檬酸酯)(pomc)、聚羧酸(例如含聚甲基丙烯酸、谷氨酸和天冬氨酸的蛋白质和肽聚合物等)、多胺(例如含有赖氨酸的蛋白质和肽聚合物等)、任何前述物质的混合物或共聚物，或其它物质。
[0257]
在图10b中示出了另一实施方式。用于图10a和图10b的单独实施方式的类似特征可以包括一个或多个在数值上偏移50倍但在其它方面另外具有相同的数值的重合特征。例如，一个传感器500及其基体材料501的特征可以与第二传感器550及其基体材料551的特征类似或相同。
[0258]
在一些实施方式中，如在图10b中所示，可以在传感器550中(和/或在植入物中)提供包括光电特征的光学部件。在一些实施方式中，光学部件可以配置为提供从传输器558传输并且由患者外部的接收器接收的信号559。在一些实施方式中，传感器可以包括光学部件，其通过询问具有嵌入在基体材料551中的指示剂化合物553的传感器550的部分来产生荧光信号554”。例如，传感器可以包括激发传感器的指示剂化合物(或不同的指示剂化合物)的光源(例如，发光二极管)。在一些实施方式中，植入的传感器550包括荧光计。在这样的实施方式中，传感器可以产生信号，该信号被传输到身体外部并由接收器接收。
[0259]
在一些实施方式中，植入物550的光电子电路获得定量测量信息并根据所获得的信息修饰负载。在一些实施方式中，如在美国专利申请号6,400,974中公开的，负载可以改变通过例如线圈的电流量。可选地，内部装置可以包括另一个电源(例如，电池等)。对于图10b的系统，线圈558可以是内部的并且可以联接到外部单元的线圈。幅度调制(am)解调器
检测在线圈中感应的电流变化，并将检测到的信号施加到处理电路，诸如脉冲计数器和计算机接口，用于将信号处理成计算机可读格式，以便输入到例如计算机。在一些实施方式中，可变rf振荡器向线圈提供射频(rf)信号，当线圈彼此足够接近以允许线圈之间的足够电感联接时，线圈又提供电磁能量以缠绕外部线圈。来自rf信号的能量为内部单元提供操作功率以获得定量测量，该定量测量用于改变负载，并进而向线圈提供负载变化，该负载变化由外部单元检测并解码为信息。在一些实施方式中，传感器被提供为能够被注射到受试者的身体(例如，患者的身体)中的形状。在一些实施方式中，通过外科手术将传感器插入患者体内。在一些实施方式中，如在本文中别处公开的，指示剂化合物被掺入到皮肤流体可渗透的基体材料中，使得诸如葡萄糖的分析物通过减少的扩散渗透到传感器中，并且还形成测定的部件。它使得与部件交互成为可能。基体材料可以是在患者皮肤中的注射点处形成凝胶的可注射制剂。在一些实施方式中，可选地，传感器由注入皮肤中的固体聚合物基体材料形成。
[0260]
在一些实施方式中，传感器可以是生物可降解的或体内可水解的。在一些实施方式中，传感器是不可降解的。原因是皮肤内部的自然生长和替换过程导致其中嵌入传感器的表皮脱落，从而该传感器最终也随着表皮排泄和脱落。在若干实施方式中，传感器的降解速率可以与指示剂化合物的寿命相匹配。一旦该传感器不再有效地起监测分析物的作用(例如，由于光漂白等)，就可以植入新的传感器，并且不需要通过外科手术去除旧的传感器。在一些实施方式中，也可使用非生物可降解材料。
[0261]
极大地阻碍生物医学光学技术的一个障碍是生物组织的混浊度。由于显著的散射和吸收损失，光通常不能被递送到组织内的目标区域或从组织内的目标区域收集。在组织或器官中植入光纤光波导用于光递送或收集可能是缓解这一问题的有效方法。图10c提供了解决这些问题或其它问题的传感器的另一实施方式。在一些实施方式中，传感器800包括嵌入需要监测和/或治疗的受试者(例如，糖尿病患者、糖尿病前期患者或需要监测的另一名患者)的皮肤下的波导光纤807(例如，光纤部分)。在一些实施方式中，如在图10c中所示，波导807在表皮600下方突出并进入真皮601。在一些实施方式中，传感器经由粘合剂层805粘附到皮肤。如图所示，波导可以包括凸缘806，该凸缘将波导粘附到粘合剂层805以保持在适当的位置。在一些实施方式中，传感器的指示剂化合物803允许检测分析物700(例如，葡萄糖)或测量分析物的量。在一些实施方式中，测量的读数作为光信号904b(例如，荧光)提供。在一些实施方式中，由传感器800产生的光信号904b在传感器800的透射基板804的表面处被检测。在一些实施方式中，如图所示，传感器800的透射基板804为圆顶形状，以允许在透射基板804周围同时测量多个信号。在一些实施方式中，这种配置允许传感器800与外部环境之间的直接通信。在一些实施方式中，一旦传感器800在皮肤内就位，则根据需要(例如，由包括患者、医务人员等的用户)经常读取分析物的读数。
[0262]
在一些实施方式中，如在图10c中所示，传感器800本身不包含任何光学部件。在一些实施方式中，这些部件单独提供(例如，在发光装置900中)。在一些实施方式中，传感器配置为由产生光信号904a(例如，来自发光二极管、激光器等)的发光装置900询问。在一些实施方式中，发光装置900是移动式的(例如，手持装置)。在若干实施方式中，装置的光源904配置用于执行传感器装置的远程询问。在一些实施方式中，发光装置包括激发过滤器，诸如一个或多个发光二极管904(二向色或染料过滤器)。在若干实施方式中，发光装置900还包
括一个或多个荧光检测器905、906。尽管在图10c中仅示出了一个，但是可以在发光装置中提供多个检测器和光源(例如，检测组件907)，包括具有不同波长的光的光源，这些光源配置为询问不同的指示剂化合物。这些光源和检测器模块可以定位成在透射基板周围的各个位置处与透射基板相互作用。在若干实施方式中，如在本文中公开的，传感器800的透射基板804是透射聚合物。在一些实施方式中，透射基板是医用级聚合物，诸如医用级硅。
[0263]
在一些实施方式中，发光装置包括荧光计(和/或是荧光计)。在一些实施方式中，荧光计配置为测量来自指示剂化合物的荧光信号的皮摩尔浓度到飞摩尔浓度。在一些实施方式中，如图所示，测量分析物的量是通过将荧光计保持在靠近和/或抵靠皮肤透射基板804来进行的。在一些实施方式中，传感器还产生由参考过滤器906测量的参考信号。该参考信号可以从读取过滤器检测器905中扣除以提供校准信号。在一些实施方式中，传感器不产生参考信号和/或缺少配置为测量参考信号的检测器。在若干实施方式中，信号被传输到与接收机(未示出)通信的编码器。在一些实施方式中，发光装置也是由传感器产生的信号的接收器。在一些实施方式中，接收器产生指示患者或医疗从业者可以读取的分析物存在水平的读数。在若干实施方式中，接收器将信号(例如，通过例如蓝牙等无线地)传输到手持装置(例如，智能电话、平板电脑等)。在若干实施方式中，可选地，发光装置是手持装置(例如，智能电话、平板电脑等)。
[0264]
在一些实施方式中，如在本文中别处公开的以及如在图10c和图10d中所示(其是光纤807的一部分的横截面图)，传感器可以包括指示剂化合物驻留在其中的基体材料802。可选地，在未示出的一些实施方式中，指示剂化合物可以结合到传感器的外表面(例如，基体材料802的外表面)。在若干实施方式中，指示剂化合物可以通过配价键、范德华力等共价结合到基体材料802内和/或基体材料802上。在若干实施方式中，基体材料是生物相容性材料。在若干实施方式中，基体材料是水凝胶。在若干实施方式中，水凝胶允许分析物传输进和传输出基体材料。在一些实施方式中，分析物通过基质的快速扩散(例如扩散控制)传输允许实时监测体内的分析物浓度。在一些实施方式中，光纤还包括通过光纤传输信号的芯801。
[0265]
在一些实施方式中，波导由单一聚合物材料制成。在一些实施方式中，波导由材料的组合(例如，具有如在图10c中所示的芯结构)制成。可以使用诸如聚(乙二醇)(peg)、丝、琼脂糖凝胶和聚(l-乳酸)(pla)等的材料，以及如在本文中公开的水凝胶。然而，由于缺少本征包层，单一材料波导往往具有高损耗，这是由于被引导的光波与周围介质(诸如体内组织)的显著相互作用造成的。在一些实施方式中，为了解决这个问题，示出了如在图10c中所示的生物相容的阶跃折射率光纤光波导。
[0266]
在一些实施方式中，光纤包括聚合物芯801和包层802、由聚合物芯801和包层802组成，或基本上由聚合物芯801和包层802组成(如在图10c和图10d中所示)。在图10c中示出了聚合物芯801和包层的放大视图。在一些实施方式中，光纤是生物相容和生物可降解的阶跃折射率光纤(具有一种折射率的芯和具有不同折射率的包层)。
[0267]
在一些实施方式中，光纤可以包括peg(聚乙二醇)、藻酸盐水凝胶、聚丙烯酰胺水凝胶、藻酸盐-聚丙烯酰胺水凝胶、丝、基于柠檬酸盐的聚合物弹性体(包括聚(八亚甲基柠檬酸盐)(poc)、聚(八亚甲基马来酸盐柠檬酸盐)(pomc)中的一种或多种)、任何前述物质的混合物，和/或任何前述物质的组合。这些材料可以在包层或芯层中。在一些实施方式中，波
导包括基于柠檬酸盐的聚合物弹性体、由基于柠檬酸盐的聚合物弹性体组成，或基本上由基于柠檬酸盐的聚合物弹性体组成。可交联的弹性体聚合物可以通过使多官能柠檬酸与不同的二醇和/或氨基酸经由容易的缩聚反应反应来合成。与天然材料(例如，丝)或传统的合成聚合物(例如，聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga))不同，其通常对关键的光学、机械和/或降解特性具有有限的可调性，基于柠檬酸盐的生物可降解弹性体族具有可调节的机械强度(从数十帕斯卡到数兆帕斯卡)、可编程的降解速率(从数日到一年以上)、基于柠檬酸盐的聚合物之间的反应性性质、多功能性(例如，粘合剂、荧光)和折射率的超微调节(～10-3
)之间的反应性性质。基于柠檬酸盐的弹性体可用作植入材料并用作开发用于体内应用的完全生物降解和无缝集成的阶跃折射率光纤的平台。在若干实施方式中，poc用作包层外层802并且pomc用作芯材料801。
[0268]
在一些实施方式中，其它配置是可能的。在一些实施方式中，如在图10e中所示，波导可以是具有由包层外部区域保护的内部区域的梯度共聚物。
[0269]
在一些实施方式中，如在图10f中所示，波导可以包括多个光纤(等于或大于至少约2、3、4、5、6、10、20个光纤(或包括和/或跨越上述值中的任一个的范围))作为光纤束。在一些实施方式中，光纤束可以包括接收来自光源904的辐射(例如，光)的一个或多个激发光纤801”和将辐射(例如，荧光)传输到检测器905、906的一个或多个收集光纤801’。在若干实施方式中，如在图10f中所示，激发光纤可以由多个收集光纤包围。在若干实施方式中，如在图10g中所示，其它光纤配置是可能的，包括随机分布或围绕收集光纤的激发光纤的分布。在若干实施方式中，指示剂化合物可以位于激发光纤、收集光纤中，在激发光纤和/或收集光纤的表面处，和/或在上述位置的任何组合处。
[0270]
在若干实施方式中，如在图10h中所提供的，并且可以在波导上方提供另外涂层808(例如，聚合物涂层)。在若干实施方式中，涂层将指示剂化合物与波导周围的环境屏蔽开(保护它)。在若干实施方式中，指示剂化合物可以分布在芯和基体材料之间(例如，在界面处)、在基体材料802中，或在基体材料和保护涂层808的界面处。
[0271]
在若干实施方式中，可以使用插入器将传感器800放置在患者的皮肤内。在若干实施方式中，如在图10i中所示(示出了具有如在图10h中所示的涂覆波导的实施方式)，在将波导807插入到皮肤下面之后，可以将透射基板804放置在波导上方。在若干实施方式中，透射基板804粘附到粘合剂层805以将透射基板804联接到粘合剂层。如图所示，透射基板可以具有配置为接收凸缘806的一部分的凹口815以及从粘合剂层805突出的波导807。
[0272]
图10j示出了由具有多个检测组件904a、904b、904c的发光装置询问的传感器的实施方式。如图所示，每个组件904a、904b、904c包括光源904、904’、904”和一个或多个荧光检测器905、906、905’、906’、905”、906”。光组件可以配置为询问相同的指示剂化合物(例如，每个可以具有相同的激发波长和检测波长)、不同的指示剂化合物(例如，每个可以具有相同的激发波长和检测波长)。在波导中(或在本文中别处公开的基体材料中)使用多种不同的指示剂化合物的情况下，指示剂化合物可以用于相同的分析物(例如，为单个分析物诸如葡萄糖提供多个不同的数据点)或为不同的分析物提供多个不同的数据点。在一些实施方式中，每个组件可以同时激活。在其它实施方式中，每个组件可以在不同的时间(包括连续地)被激活。通过在不同的时间点询问传感器，可以发生较少的传感器加热。在一些实施方式中，传感器可以包括散热装置(例如，散热器、珀尔帖装置等)。
[0273]
在一些实施方式中，波导可以具有均匀分布在整个基体材料802中的指示剂化合物。在一些实施方式中，指示剂化合物可以沿长度不均匀地分布或者在波导内轴向分布。例如，在一些实施方式中，指示剂化合物可以具有朝向波导中心的更高浓度。在一些实施方式中，波导可以在波导的远端末端(光透射基板804的远端)具有更高的浓度。在其它实施方式中，波导可以在波导的近端部分(接近光透射基板804)具有更高的浓度。
[0274]
在若干实施方式中，波导具有适合延伸通过表皮并进入真皮的长度。在若干实施方式中，波导的长度等于或至少约为1mm、2mm、3mm、4mm，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，波导具有厚度(例如，直径)等于或至少约为25μm、50μm、75μm、100μm、150μm，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，波导的芯具有厚度等于或至少约为25μm、50μm、75μm、100μm，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，围绕波导的芯的基体材料具有厚度等于或至少约为5μm、10μm、15μm、25μm，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，当存在时，用于波导的保护涂层具有厚度等于或至少约为2.5μm、5μm、10μm、15μm、25μm，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，波导具有适合延伸通过表皮并进入真皮的长度。在若干实施方式中，当从顶部观察时，透射基板是圆形或半圆形的。在若干实施方式中，透射基板的直径等于或至少约为10mm、15mm、20mm、30mm，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，在波导包括多个光纤(例如束)的情况下，每个单独的光纤可以具有厚度(例如，直径)等于或至少约为10μm、15μm、25μm、50μm，或包括和/或跨越上述值的范围。
[0275]
在若干实施方式中，基体材料的折射率等于或小于约：1.20、1.30、1.40、1.49、1.50、1.60，或包括和/或跨越上述值的范围。在若干实施方式中，芯的折射率等于或小于约：1.20、1.30、1.40、1.49、1.50、1.60，或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方式中，基体材料和芯的折射率相差小于等于或小于约：0.01、0.05、0.10、0.20，或包括和/或跨越上述值的范围。
[0276]
在若干实施方式中，如图所示，波导传感器的透光材料可以是圆顶形状。在其它实施方式中，透光材料不需要是圆顶形状。在若干实施方式中，其中图10c至图10j的装置的透光材料是圆顶形的，透光材料的曲率半径可以是足以将发射的光信号聚焦在波导的近端的长度。如在图10j中所示，透光材料的曲率半径可以是匹配(或基本上匹配)从波导的近端到透光材料的外围表面的距离的长度。
[0277]
可以用作根据本发明的分析读数的合适的光信号包括，例如，荧光共振能量转移、荧光偏振、荧光淬灭、磷光、发光增强、发光淬灭、衍射或等离子体共振等。包括可以通过本领域本身已知的近似测定产生的所有光学信号。
[0278]
一些实施方式涉及系统。在一些实施方式中，系统包括内部或部分内部单元500、550、800和外部单元502、900。在一些实施方式中，内部单元可以皮下植入或以其它方式植入受试者体内。在一些实施方式中，内部单元包含光电子电路，光电子电路的部件可以包括如参考图10a-图10c所述的荧光感测装置。
[0279]
在美国专利号6,400,974；6,794,195；7,800,078；7,713,745；7,375,347；9,717,413；7,060,503；7,157,723；7,190,445；7,227,156；7,939,332；7,405,387；7,851,225；7,822,450；8,502,167；8,143,068；9,693,714；9,681,824；9,498,156；9,717,413；10,111,588 9,931,068；9,414,775；9,814,389；9,867,540；9,778,190；9,743,869；10,119,911；
biology 75(1997),427-440)。酵母表达系统的概述例如由hensing等人给出(antoine von leuwenhoek 67(1995),261-279),bussineau(developments in biological standardization 83(1994),13-19),gellissen等人(antoine van leuwenhoek 62(1992),79-93,fleer(current opinion in biotechnology 3(1992),486-496),vedvick(current opinion in biotechnology 2(1991),742-745)和buckholz(bio/technology 9(1991),1067-1072)。在文献中已经描述了表达载体。在一些实施方式中，它们不仅包含选择标记基因和确保在所选择宿主中复制的复制起点，还包含细菌或病毒启动子，并且在大多数情况下包含转录的终止信号。在一些实施方式中，在启动子和终止信号之间，通常至少有一个能够插入编码核苷酸序列的限制性位点或多连接子。可以使用确保基因的组成型表达的启动子和允许有意控制基因表达的诱导型启动子。在文献中详细描述了具有这些特性的细菌和病毒启动子序列。在文献中充分描述了在微生物(例如大肠杆菌(e.coli)、酿酒酵母(s.cerevisiae))中表达的调节序列。允许下游序列特别高表达的启动子例如是t7启动子(studier等人,methods in enzymology 185(1990),60-89)、lacuv5、trp、trp-lacuv5(deboer等人,in rodriguez和chamberlin(编)，启动子、结构和功能；praeger,new york(1982),462-481；deboer等人,proc.natl.acad.sci.usa(1983),21-25),ip1,rac(boros等人,gene 42(1986),97-100)。在一些实施方式中，诱导型启动子用于蛋白质的合成。这些启动子通常导致比组成型启动子更高的蛋白质产率。在一些实施方式中，为了获得高产率的蛋白质，经常使用两阶段方法。首先，在最佳条件下培养宿主细胞至相对较高细胞密度。在第二步中，根据所使用的启动子的类型诱导转录。在这点上，tac启动子是特别合适的，其可以由乳糖或iptg(异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷)诱导(deboer等人,proc.natl.acad.sci.usa(1983),21-25)。用于在哺乳动物细胞中应用的转录终止信号诸如sv40-poly-a位点或tk-poly-a位点也在文献中描述。合适的表达载体是本领域已知的，诸如okayama-berg cdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(in-vitrogene)、psport1(gibco brl)或pci(promega)。
[0287]
用核酸分子或载体转化宿主细胞可以通过标准方法进行，例如描述于sambrook和russell(2001),molecular cloning:a laboratory manual,csh press；methods in yeast genetics,a laboratory course manual,cold spring harbor laboratory press(1990)。在一些实施方式中，例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而例如磷酸钙或deae-葡聚糖介导的转染或电穿孔可以用于其它细胞宿主。在一些实施方式中，宿主细胞在满足所使用的特定宿主细胞要求的营养培养基中培养，特别是在ph值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面。在一些实施方式中，可以通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析的方法从重组细胞培养物中回收和纯化融合蛋白。在一些实施方式中，可以应用亲和层析与融合蛋白的结合部分结合的底物纯化融合蛋白。必要时，可以使用蛋白质重折叠步骤来完成蛋白质的构型。最后，高效液相色谱(hplc)可用于最后的纯化步骤。
[0288]
在一些实施方式中，提供了如在本文中公开的用于产生融合蛋白的方法，所述方法包括在允许所述融合蛋白的表达的条件下培养上述宿主细胞，并从培养物中回收所述融合蛋白。根据表达的蛋白质是位于宿主细胞中还是从细胞中分泌，可以从培养的细胞和/或从培养基的上清液中回收蛋白质。
[0289]
在一些实施方式中，融合蛋白或非蛋白构建体可以是化学合成过程的产物或通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过在培养物中的细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞)产生。根据在重组生产过程中采用的宿主，表达的融合蛋白可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。在一些实施方式中，融合蛋白还可以包括初始甲硫氨酸氨基酸残基。在一些实施方式中，蛋白质可以被进一步修饰以包含通常不是蛋白质的一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以例如改善蛋白质的稳定性、溶解性、生物半衰期或吸收。这些部分还可以减少或消除蛋白质等的任何非期望副作用。这些部分的概述可以在例如remington's pharmaceutical sciences(第18版，mack publishing co.,easton,pa(1990))中找到。
[0290]
一些实施方式涉及非人转基因生物，即包括编码如在本文中公开的融合蛋白的核酸分子的多细胞生物，或如上所述的表达盒或载体，例如，稳定地整合到其基因组中，至少在该生物的细胞的亚组中，或其部分诸如组织或器官中。在使用非人生物的情况下，动物可以用作研究生物中葡萄糖水平或其它分析物水平的模型。在一些实施方式中，可以收集来自人的组织，并且可以用编码如在本文中公开的融合蛋白的核酸分子(或如上所述的表达盒或载体)处理其中的细胞，以将核酸稳定地整合到基因组中。在一些实施方式中，为了诊断或治疗的目的，可以将该组织植入回人体内。
[0291]
一些实施方式还涉及用于产生转基因植物和动物、植物或动物组织或植物或动物细胞的方法，包括将如在本文中公开的核酸分子、表达盒或载体引入细胞中，并且任选地从其再生转基因植物或动物或植物或动物组织。特别地，表达如在本文中所述的融合蛋白的转基因植物或动物可用于研究例如，具有先前无法实现的及时和空间分辨率的有机化合物的代谢或转运过程。在一些实施方式中，根据本发明制备转基因生物的可收集部分和繁殖材料，其包含如上所述的转基因细胞。可收集部分原则上可以是生物的任何有用部分，例如皮肤、器官等。在一些实施方式中，包括经修饰以产生公开的指示剂的细胞的皮肤移植物可用于检测患者体内的分析物水平(例如，葡萄糖水平)并诊断和/或治疗疾病(例如，糖尿病)。
[0292]
本发明还涉及包括至少一种核酸分子、表达盒或载体的转基因非人动物，如在本文中公开的，如上所述。一些实施方式涉及生产转基因非人动物的方法，包括将本发明的核酸分子、表达盒或载体引入生殖细胞、胚胎细胞、干细胞或衍生自其的卵子或细胞。表达本发明的融合蛋白或其从合子开始的任何发育阶段的此类转基因动物可以用作模型生物，其中可以实时确定某种化合物的分布而不破坏组织完整性。这些模型生物可能对于测试特别有用。可以进行转基因胚胎的产生和它们的筛选，例如，如a.l.joyner ed,gene targeting,a practical approach(1993),oxford university press所述。胚胎的dna可以使用例如使用适当的探针或基于pcr技术的southern印迹来分析。
[0293]
根据本发明的转基因非人动物可以例如是转基因小鼠、大鼠、仓鼠、狗、猴、兔、猪、青蛙、线虫诸如秀丽隐杆线虫、果蝇诸如黑腹果蝇或鱼诸如鱼雷鱼或斑马鱼，包括如在本文中公开的核酸分子、表达盒或载体，例如稳定地整合到其基因组中，或通过上述方法获得。这种转基因非人动物可以包括相同或不同的核酸分子的一个或多个拷贝，如在本文中公开的。在一些实施方式中，如在本文中公开的核酸分子、表达盒或载体在这种转基因非人动物中的存在导致如在本文中公开的融合蛋白的表达。转基因非人动物具有多种用途，包括作为研究模型。因此，在一些实施方式中，哺乳动物是实验室动物，诸如小鼠或大鼠。
[0294]
对于细胞内分析物测量，如在本文中公开的融合蛋白可以通过直接显微注射或通过显微注射编码融合蛋白并能够在细胞中表达它的rn而转移到细胞中。除了将融合蛋白引入细胞的方式外，本实施方式对应于上述检测在细胞中分析物的方法，其中用编码并能够在细胞中表达融合蛋白的核酸分子、表达构建体或载体对细胞进行基因工程改造。通过显微注射将蛋白质或表达蛋白质的rna引入细胞的合适技术是本领域技术人员已知的，并且在文献中有描述。例如，这种引入可以通过应用如在以下所描述的技术下进行：celis j.e.,graessmann a.,loyter a.(1986),microinjection and organelle transplantation techniques,academic press,london；celis j.e.(1994),cell biology:a laboratory handbook,vol.3,academic press,new york；以及cid-arregui a.和garcia-carranca a.(编)(1997),microinjection and transgenesis:strategies and protocols,springer-verlag,berlin-heidelberg-new york。
[0295]
如在本文中公开的，使用显微注射来引入融合蛋白，无论是直接还是间接以可表达mrna的形式，与转化方法相比，都带来了获得结果所需的时间减少的优点。特别地，通常只需要数天，引入的mrna就会表达编码的融合蛋白并随后可测量荧光。如果是显微注射的融合蛋白时，则可以更快地获得结果，并且可以在数分钟内测量荧光。另一个优点是引入的mrna的表达水平和引入的蛋白质的丰度可分别通过显微注射材料的量容易地调节。由于已知荧光是一种灵敏的方法，通常可能需要相对少量的材料以实现细胞内分析物浓度的显著测量。另一方面，如果打算在比例如数天更长的时间内观察给定细胞中的分析物浓度，则显微注射的应用可能不如转化方法有利。此外，如果打算测量细胞质或细胞核以外的在细胞区室中的分析物浓度，则显微注射可能是不可行的，因为直接显微注射到这种其它区室中至少目前是不可能的。
[0296]
将基因、核酸、dna、rna、蛋白质或载体递送到活细胞中的其它方法包括但不限于电穿孔、病毒(转导)、脂质转染、基因枪(生物信息学)、囊泡融合或化学转化。一种类型的病毒载体基于腺伴随病毒(aav)。这种有缺陷的细小病毒可感染许多细胞类型(包括非分裂细胞)，并且对人无致病性。使用杆状病毒表达载体系统(bevs)，可以在哺乳动物细胞(包括hek 293t细胞、cos细胞、hela细胞、kb细胞和其它哺乳动物细胞系)和昆虫细胞(包括sf9、sf21和其它昆虫细胞)中产生aav。
[0297]
通过提供在本文中公开的指示剂化合物和融合蛋白，可以直接观察某种分析物(例如代谢物)在单个活细胞中的分布和浓度。这允许观察如在本文中公开的将表达合适融合蛋白的单个细胞与候选化合物接触是否导致细胞中分析物的浓度和/或分布的变化，这种变化从表达融合蛋白的细胞所发射的能量发射模式的变化中是显而易见的。此外，在本文中提供的技术不仅允许检测分析物浓度和/或分布是否发生变化，而且还允许量化这种变化。
[0298]
在一些实施方式中，原则上任何种类的细胞都可以用于本方法，该方法适于光学检测并且可以被转化以表达异源蛋白。因此，细胞可以是单细胞，诸如细菌、酵母、原生动物或培养的细胞，例如脊椎动物、哺乳动物、人来源或植物细胞。对于某些应用，取受病原影响的细胞诸如肿瘤细胞或被感染物感染的细胞(例如病毒)可能是有用的，其中可以与相应的健康细胞进行比较来进行测量。同样，细胞可以是组织、器官或生物的一部分。在一些实施方式中，细胞是固定的，这有助于它们的观察(例如，作为皮肤贴片)。
[0299]
此外，一些实施方式涉及使用如在本文中公开的融合蛋白或如上所述的如在本文中公开的核酸分子、表达盒、载体、宿主细胞或对照传感器，用于制备诊断组合物，所述诊断组合物用于诊断与细胞、组织或身体部分中的分析物浓度相关的病症。在一些实施方式中，病症是与分析物的异常浓度(例如，糖尿病和葡萄糖)相关的病理学病症。
[0300]
在一些实施方式中，使用在本文中公开的技术和化合物检测分析物提供以下优点中的一个或多个(或其它优点)：对葡萄糖的高特异性，其不会化学改变葡萄糖；对发光蛋白和葡萄糖结合蛋白具有高定制性的突变；制造成本低；指示剂化合物可以作为整体合成；仅大肠杆菌就具有大约～1200个特异性进化的转运蛋白以转运各种分子，包括金属、蛋白质、离子、小化学物质等。
[0301]
应理解，在本文中公开的蛋白质序列应被解释为在n-末端至c-末端的方向上。类似地，应理解在本文中公开的核酸序列应被解释为在5’至3’方向上。
[0302]
使用方法
[0303]
一些实施方式涉及用于检测糖尿病患者体内的葡萄糖的方法。在实施方式中，如在本文中公开的传感器被注射、手术植入和/或部分地插入(用插入器)到患者体内。在若干实施方式中，将传感器插入到一定深度，使得指示剂化合物(例如，在装置中)在皮肤表面下的深度等于或至少约为1mm、2mm、3mm、4mm，或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方式中，用发光装置询问传感器。在一些实施方式中，使发光装置接近传感器。在一些实施方式中，发光装置设置在传感器内。
[0304]
在一些实施方式中，向患者施用指示剂化合物。在一些实施方式中，指示剂化合物是融合蛋白。在一些实施方式中，融合蛋白包括发光蛋白和/或发光蛋白的一个或多个发光片段。在一些实施方式中，融合蛋白还包括糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分。在一些实施方式中，糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分配置为结合葡萄糖。在一些实施方式中，当葡萄糖结合至指示剂化合物时，指示剂化合物经历从第一构象至第二构象的构象变化。在一些实施方式中，当葡萄糖与糖结合蛋白和/或糖结合蛋白的糖结合部分结合时，指示剂化合物暴露于具有足以诱导指示剂化合物发光的能量的光。
[0305]
在一些实施方式中，方法包括用光照射指示剂化合物并检测产生的最大波长的光的发射。在一些实施方式中，由指示剂化合物吸收的光的λ
max
等于或至少约：300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm，或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方式中，由指示剂化合物发射的光的λ
max
等于或至少约：300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm，或包括和/或跨越上述值的范围。
[0306]
在一些实施方式中，如在本文中别处所公开的，多种指示剂化合物可同时用于检测不同的分析物。在若干实施方式中，当使用多种指示剂化合物时，由指示剂化合物吸收的光的λ
max
独立地等于或至少约：300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm，或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方式中，由指示剂化合物发射的光的λ
max
独立地等于或至少约：300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm，或包括和/或跨越上述值的范围。在一些实施方式中，多种指示剂化合物可以同时用于相同的分析物(从而提供内部标准以确保准确测量)。在一些实施方式中，在使用多于一种指示剂化合物的情况下，选择指示剂化合物以具有吸收的光的λ
max
值，所述λ
max
值相差等于或至少约：10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、100nm、200nm、300nm，或包括
和/或跨越上述值的范围。在一些实施方式中，在使用多于一种指示剂化合物的情况下，选择指示剂化合物以具有发射的光的λ
max
值，所述λ
max
值相差等于或至少约：10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、100nm、200nm、300nm，或包括和/或跨越上述值的范围。具有不同的发射和吸收波长有助于避免测量中的重叠信号和误差。
[0307]
在本文中公开的一些实施方式涉及选择需要的受试者或患者。在一些实施方式中，选择患有疾病的患者。在一些实施方式中，选择患有糖尿病，诸如1型糖尿病或2型糖尿病的患者。在一些实施方式中，选择具有糖尿病风险的患者。在一些实施方式中，选择需要治疗糖尿病的患者。在一些实施方式中，选择需要诊断糖尿病的患者。在一些实施方式中，选择需要管理糖尿病的患者，包括但不限于测量血糖水平。在一些实施方式中，选择可以具有上述选择标准的任何组合的患者。
[0308]
在一些实施方式中，提供了一种用于检测分析物的方法。在一些实施方式中，用于检测分析物的方法包括使样品与指示剂化合物接触。在一些实施方式中，指示剂化合物是融合蛋白。在一些实施方式中，该方法包括向融合蛋白提供适合于通过指示剂化合物的信号传导结构域激发能量发射的能量。在一些实施方式中，该方法包括测量能量发射。在一些实施方式中，分析物在患者身体内。在一些实施方式中，将包括指示剂化合物的装置引入患者的身体。
[0309]
一些实施方式提供了一种用于检测或量化哺乳动物皮肤流体中的分析物的方法。在一些实施方式中，该方法包括注入或嵌入用于检测或量化表皮或内部皮肤中的分析物的传感器。在一些实施方式中，该方法包括使测量装置靠近传感器。在一些实施方式中，使用光学设备获得测量装置的读数。在一些实施方式中，所获得的测量值与分析物的浓度相关。
[0310]
在一些实施方式中，将融合蛋白固定到固体支持物上。在一些实施方式中，融合蛋白的结合部分的结合亲和力在允许可逆分析物结合的范围内。在一些实施方式中，此类固定的融合蛋白构建测量装置，其中包含融合蛋白的所述支持物与用于激发和检测能量发射的设备组装在一起。此类装置可以用作检测在流体样品中化合物的传感器，例如用于测量血糖。
[0311]
在一些实施方式中，在一个阵列上组装对不同分析物特异性和/或具有不同测量范围的多种不同融合蛋白。在一些实施方式中，在将样品与这样的阵列接触时，可以例如用组合的激发/检测设备扫描该阵列。这种系统在样品的自动化或半自动高通量筛选中特别有用。
[0312]
在一些实施方式中，方法包括接触与对照传感器对应的样品，由此所述对照传感器对应于用于分析的融合蛋白，除了结合部分被修饰并且因此不能结合分析物。在一些实施方式中，该方法包括向对照传感器提供与分析物结合指示剂化合物相同的能量。在一些实施方式中，该方法包括测量对照传感器的能量发射。在一些实施方式中，该方法包括利用有源传感器校准对照传感器的能量发射测量。在一些实施方式中，该方法包括校准使用对照传感器的测量。在一些实施方式中，术语“对照传感器”是指对应于活性结合融合蛋白的蛋白质，除了结合部分的修饰使其不能结合相应的分析物。因此，除此之外，对照传感器具有与关于激发和发射光谱的相应融合蛋白相同的功能特性。在一些实施方式中，其它特征也是相同的，诸如溶解度、等电点、分子量、ph敏感性、对其它因素诸如离子环境的敏感性等。
[0313]
预期使用对照传感器的平行测量可以极大地改进用本发明的融合蛋白进行的测量，因为它除了可能影响融合蛋白的能量发射的分析物浓度之外，还排除了影响。此外，融合蛋白的总蛋白质结构可能受除分析物浓度以外的其它因素如离子条件的影响。
[0314]
在一些实施方式中，方法包括检测细胞中的分析物。在一些实施方式中，方法包括提供用本发明的核酸分子、表达盒或载体基因工程改造过并表达指示剂化合物的融合蛋白的细胞。在一些实施方式中，方法包括(b)测量能量发射。在一些实施方式中，方法在人或动物细胞上进行，该方法仅在体外，即在人或动物体外应用。对于细胞内分析物的测量，本发明的融合蛋白可以通过直接显微注射或显微注射编码融合蛋白并能够在细胞中表达的rna而转移到细胞中。除了将融合蛋白引入细胞的方式外，该实施方式对应于在上述细胞中检测分析物的方法，其中用编码并能够在细胞中表达融合蛋白的核酸分子、表达构建体或载体对细胞进行基因工程改造。
[0315]
通过引用将以下参考文献全文并入本文：mita,m.等人(2019)。基于绿色荧光蛋白的葡萄糖指示剂报告活细胞中的葡萄糖动态变化。anal.chem.(91)4821-4830；用葡萄糖/半乳糖结合蛋白检测葡萄糖或半乳糖的方法。ca2336985c；用于检测分析物的融合蛋白。us20070136825a1；用于检测生物分析物的系统和方法以及用于生产生物分析物传感器的方法。us20050118726a1；蛋白质、传感器和使用其表征分析物的方法。us7718353b2；用于分析物检测的组合物和方法。us6485703b1；底物和运输蛋白质的筛选方法。us20090221442a1；体内生物传感器设备及其使用方法。ca2352571c；hu,h.；wei,y.；wang,d.；su,n.；chen,x.；zhao,y.；liu,g.；yang,y.rsc adv.2018,8(5),2485-2489；6,400,974；6,794,195；7,800,078；7,713,745；7,375,347；9,717,413；7,060,503；7,157,723；7,190,445；7,227,156；7,939,332；7,405,387；7,851,225；7,822,450；8,502,167；8,143,068；9,693,714；9,681,824；9,498,156；9,717,413；10,111,5889,931,068；9,414,775；9,814,389；9,867,540；9,778,190；9,743,869；10,119,911；10,662,333；以及美国申请公开号2014/0088383。
[0316]
实施例
[0317]
以上讨论的实施方式的一些方面在以下示例中更详细地公开，这些示例不以任何方式意图限制本公开的范围。本领域技术人员将理解，许多其他实施方式也落入本发明的范围内，如在本文中上文和权利要求中所述。
[0318]
实施例1：用作葡萄糖传感器的基因修饰的皮肤移植物
[0319]
患者被选择为患有糖尿病(糖尿病)，或处于患有糖尿病的风险中，先前患有糖尿病，或不患有糖尿病。患者需要监测他或她的血糖水平。从患者体内取出皮肤样品(例如，分裂厚度的皮肤移植物)并保持在生长培养基中。对皮肤样品进行基因修饰，诸如通过显微注射或aav，以表达一种或多种在本文中所述的包括葡萄糖结合蛋白或其结合部分的指示剂化合物。构成皮肤样品的角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞、免疫细胞、巨噬细胞、上皮细胞或红细胞被基因修饰。在成功修饰之后，皮肤样品在原始位置或新位置(诸如身体上容易观察到的区域)处被移植回患者身上。根据与血糖水平相关的微环境间质液中的葡萄糖，修饰的皮肤区域现在发光或发荧光。患者能够使用该信号来确定当前的血糖水平，而不需要侵入式血液采样方法。信号的检测可以用为患者专门校准的装置来完成。
[0320]
实施例2：光纤传感器的制造
[0321]
制备如在图10c中所公开的光纤传感器。光纤荧光计的光学部分在微工作台上使用标准部件制造。该组装设备包括红色led、二向色分束器、过滤器和作为光源的检测器二极管。简言之，荧光计包括发光二极管，该发光二极管发射通过包含激发过滤器和分束器的聚光器的激发光束。激发光束进入光纤(例如，波导)。当使用荧光计时，当查询皮肤传感器的轴对齐地经皮放置在皮肤端的传感器，使得激发光束进入传感器时，传感器在激发后发射光。所获得的一些光信号进入该光纤，并由此被传输到荧光计中。该荧光计还包含参考检测二极管，从该参考检测二极管获得从led发射的激发光的参考测量。这两个积分信号对应于背景校正的荧光信号和背景校正的激发光水平(led强度)。该荧光计是电池操作的(在9v下通常功耗是150ma)，并且可以方便地构造成笔的形状和尺寸。
[0322]
实施例3：光纤葡萄糖传感器
[0323]
如在图10c中所公开的葡萄糖传感器被植入糖尿病患者身上。传感器包括具有如在图2c中所公开的嵌入在基体材料内的指示剂化合物的波导。患者在一天中的不同时间询问传感器以确定他的血糖水平。患者能够通过使用传感器和询问传感器的发光装置取得周期性读数来监测和控制他的血糖水平。患者能够比他先前能够使用手指刺血葡萄糖测量而更好地控制他的血糖。
[0324]
应当理解，在本文中描述的本发明的实施方式仅仅是对本发明原理的应用的说明。在本文中对所说明的实施方式的细节的参考并非旨在限制权利要求的范围，权利要求本身引用了被认为是本发明所必需的那些特征。附图仅仅是为了说明本发明的实施方式，而不是为了限制本发明。
[0325]
本发明在本文中通常使用肯定的语言来描述许多实施方式。本发明还包括完全或部分排除主题的实施方式，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。
[0326]
在至少一些先前描述的实施方式中，除非这样的替代在技术上不可行，否则在一个实施方式中使用的一个或多个元件可以互换地用于另一个实施方式中。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其它的省略、添加和修改。所有这些修改和变化都落入由所附权利要求限定的主题的范围内。
[0327]
关于在本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，可以在本文中明确阐述各种单数/复数排列。
[0328]
本领域技术人员将理解，通常，在本文中使用的术语，特别是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中，通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，等等)。本领域的技术人员还将理解，如果打算引用特定数量的权利要求，则在权利要求中明确地表述这种意图，并且在没有这种表述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含使用引言短语“至少一个”和“一个或多个”来引入权利要求表述。然而，这种短语的使用不应被解释为暗示通过不定冠词“一”或“一个”的权利要求表述的引入将包含这种引入的权利要求表述的任何特定权利要求限制为仅包含一个这种表述的实施方式，即使当同一权利要求包括引入性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词如“一”或“一个”时(例如，“一”和/或“一个”应被解释为意指“至少一个”或“一个或多个”)；对于用于引入权利要求表述的定冠词的使用也是如此。此外，即使明确地表述了所
引入的权利要求表述的具体数量，本领域技术人员将认识到，这种表述应被解释为意指至少所表述的数量(例如，没有其它修饰的“两个表述”的裸露表述意指至少两个表述，或两个或更多个表述)。此外，在其中约定类似于“a、b和c中的至少一个，等等”的那些情况下，通常使用这种构造意在本领域技术人员将理解该约定(例如，“具有a、b和c中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起的系统，等)。在其中约定类似于“a、b或c中的至少一个，等等”的那些情况下，通常使用这种构造意在本领域技术人员将理解该约定(例如，“具有a、b或c中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起的系统，等)。本领域的技术人员将进一步理解，无论在说明书、权利要求书或附图中，实际上呈现两个或更多个替换术语的任何分离的单词和/或短语都应该被理解为考虑包括术语中的一个、术语中的任一个，或这两个术语的可能性。例如，短语“a或b”将被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
[0329]
此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此也根据马库什组的任何个体成员或成员亚组来描述。
[0330]
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，诸如就提供书面描述而言，在本文中公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为充分地描述并且使得相同的范围能够被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，在本文中讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所表述的数字，并且是指随后可被分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个制品的组是指具有1、2或3个制品的组。类似地，具有1-5个制品的组是指具有1、2、3、4或5个制品的组，等等。
[0331]
虽然在本文中已经公开了各种方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对于本领域技术人员来说是显而易见的。在本文中公开的各个方面和实施方式是为了说明的目的，而不是为了限制，真正的范围和精神由所附权利要求来指示。
[0332]
在本文中引用的所有参考文献，包括但不限于公开的和未公开的申请、专利和参考文献，均通过引用整体并入本文，并由此构成本说明书的一部分。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开相矛盾的范围内，说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。