壮骨关节丸指纹图谱及其中18种成分的检测方法

1.本发明涉及化学分析中中成药主要成分检测技术领域，特别涉及壮骨关节丸18种成分含量研究。


背景技术：

2.壮骨关节丸是一种治疗由肝肾不足、血瘀气滞、脉络痹阻所致的骨性关节炎、腰肌劳损的中成药，由以下中药组成：狗脊、淫羊藿、独活、骨碎补、续断、补骨脂、桑寄生、鸡血藤、熟地黄、木香、乳香、没药。
3.壮骨关节丸是中国药典中的成方制剂，能够有效治疗骨关节病。而原儿茶酸(protocatechuicacid)、毛蕊花糖苷(acteoside)、柚皮苷(naringin)、朝藿定a(epimedin a)、朝藿b(epimedin b)、槲皮素(quercetin)、淫羊藿苷、补骨脂素(psoralen)、异补骨脂素(isopsoralen)、花椒毒素(8
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methoxypsoralen)、刺芒柄花素(formononetin)、补骨脂定(psoralidin)、宝藿苷ⅰ(baohuosideⅰ)、补骨脂甲素(bavachin)、蛇床子素(osthole)、木香烃内脂(costundide)、补骨脂酚(bakuchiol)、11
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羰基
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β
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乙酰乳香酸(acetyl
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keto
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β
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boswellic acid)等18种成分为治疗骨性关节炎的中成药的主要成分。基于高效液相色谱法(hplc)测定壮骨关节丸中单个或多个有效成分含量的研究较多，但还没有建立同时涵盖十二味组方中药材的hplc指纹图谱，而且在历版《药典》中也未收载该制剂的质量标准，因此本实验对壮骨关节丸进行指纹图谱研究，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)对16批市售制剂进行相似度评价，进而对指纹图谱中主要特征峰进行化学指认并初步确定组方中药来源，为制定全面、整体的壮骨关节丸质量控制方法提供一些工作基础。


技术实现要素：

4.为解决现有市场上16批次壮骨关节丸未同时涵盖的18种成分的的指纹图谱相似度问题，本申请公开了壮骨关节丸指纹图谱及其中18中成分的检测方法。
5.本发明是通过以下步骤得到的：
6.(1)取壮骨关节丸袋中丸粒高速粉碎，精密称定约1.25g，置于50ml锥形瓶中，加入体积分数为60％甲醇25ml，称重，超声处理45min，取出放冷至室温，补足减少重量，摇匀，提取液于12000r/min离心1min，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得。
7.(2)壮骨关节丸指纹图谱的研究：
8.a专属性实验取空白溶剂(体积分数为60％甲醇)和壮骨关节丸的供试品溶液各1份，分别进样10μl，记录色谱图(见图1)。经考察，空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰，专属性良好。
9.b精密度实验取同一份壮骨关节丸的供试品溶液，按“权利要求书6”色谱条件连续进样6次，记录色谱图，进行精密度考察，40个共有峰的相对保留时间的rsd不高于0.11％，相对峰面积的rsd不高于1.87％，各色谱图的相似度值不低于0.99。上述实验结果表明，仪器的精密度好。
10.c稳定性实验取同一份壮骨关节丸的供试品溶液，按“权利要求书6”色谱条件，分别在0、4、8、12、24h进样分析，记录色谱图。结果显示40个共有峰的相对保留时间的rsd值不高于0.21％，相对峰面积的rsd值不高于1.99％，各色谱图的相似度值不低于0.99。上述实验结果表明，供试品在24h内测定稳定性良好。
11.d重复性实验取同一批壮骨关节丸，分别按“权利要求书4”项下平行制备6份壮骨关节丸的供试品溶液，按“权利要求书6”色谱条件，依次进样6针，记录色谱图，进行重复性考察，结果显示40个共有峰色谱的相对保留时间的rsd值不高于0.18％，相对峰面积的rsd值不高于3.69％，各色谱图的相似度值不低于0.99。上述实验结果表明，方法的重复性好。
12.e稳定性实验取同一批壮骨关节丸，分别按“权利要求书4”项下平行制备壮骨关节丸的供试品溶液，分别于0、4、12、24h进样测定，以21号甘草酸色谱峰为参照峰(s)，计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的rsd均小于2.89％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
13.本发明的有益效果为：
14.高效液相色谱法(hplc)测定壮骨关节丸中单个或多个有效成分含量的研究较多，但还没有建立同时涵盖十二味组方中药材的hplc指纹图谱，而且在历版《药典》中也未收载该制剂的质量标准，因此本实验对壮骨关节丸进行指纹图谱研究，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)对16批市售制剂进行相似度评价，进而对指纹图谱中主要特征峰进行化学指认并初步确定组方中药来源，为制定全面、整体的壮骨关节丸质量控制方法提供一些工作基础。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
16.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
17.图1为空白溶剂与供试品色谱图对比；
18.图2混合标准品与供试品溶液色谱峰对照；
19.图3 16批壮骨关节丸样品峰匹配图。
具体实施方式
20.本发明采用高效液相色谱法建立壮骨关节丸的指纹图谱。
21.下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.首先，需要说明的是，本发明中所提及的术语“精密称定”：精密称定系指称定重量应准确至所取重量的千分之一。“精密吸取”：系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该计量器具的精确度要求。
23.一、指纹图谱建立
24.取16批次壮骨关节丸，按“权利要求书4”项下制备壮骨关节丸的供试品溶液，进样测定。分析16批壮骨关节丸的色谱峰，结果如下表所示检测出稳定的共有峰为40个，出峰时间为3min到75min之间。以异补骨脂素的色谱峰为参比峰，其余峰的保留时间和峰面积与之比值分别为相对保留时间和相对峰面积。
[0025][0026][0027]
二、共有峰归属分析
[0028]
通过混合对照品保留时间比对，对各共有峰进行归属分析。只认共有峰18个。依次为：原儿茶酸(protocatechuicacid)、毛蕊花糖苷(acteoside)、柚皮苷(naringin)、朝藿定
a(epimedin a)、朝藿定b(epimedin b)、槲皮素(quercetin)、淫羊藿苷(icariin)、补骨脂素(psoralen)、异补骨脂素isopsoralen)、花椒毒素(8
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methoxypsoralen)、刺芒柄花素(formononetin)、宝藿苷ⅰ(baohuosideⅰ)、补骨脂甲素(bavachin)、补骨脂定(psoralidin)、蛇床子素(osthole)、木香烃内脂(costundide)、补骨脂酚(bakuchiol)、11
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羰基
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乙酰乳香酸(acetyl
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keto
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boswellic acid)。指认峰面积约占40个共有峰面积的59.56％。结合药典对壮骨关节丸中十二味中药质量控制成分的限定，初步确定了18个成分的组方中药来源。有6种单体：补骨脂素、异补骨脂素、花椒毒素、补骨脂甲素、补骨脂定、补骨脂酚来自补骨脂，4种单体：朝藿定a、朝藿定b、淫羊藿苷、宝藿苷ⅰ源于淫羊藿，其余8种单体分别来自其它8个中药材：原儿茶酸源自中药材狗脊；毛蕊花糖苷源自中药材熟地黄；柚皮苷源自中药材骨碎补；槲皮素源自中药材桑寄生；刺芒柄花素源自中药材鸡血藤；蛇床子素源自中药材独活；木香烃内脂源自中药材木香；11
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羰基
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乙酰乳香酸源自中药材乳香。
[0029]
三、指纹图谱相似度评价
[0030]
所得个色谱图导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件，以中位数生成壮骨关节丸对照指纹图谱，见图2，将该对照指纹图谱的相似度值定为1，计算16批壮骨关节丸指纹图谱与对照指纹图谱的相似度值在0.984～0.999之间，一般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9～1.0之间即为符合要求。如下表所示16批壮骨关节丸各批次之间相似度良好、质量比较稳定。
[0031][0032]
四、指标成分含量测定
[0033]
1、线性关系考察
[0034]
精密吸取不同统计混合对照品溶液适量，置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，定容，摇匀。制备不同浓度梯度的混合对照品溶液。按“权利说明书6”项下色谱条件进行测定。以对照品浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归。如下表所示壮骨关节丸中主要18个成分在相应的浓度范围内与峰面积的线性关系良好。
[0035][0036][0037]
2、精密度试验
[0038]
取同一份壮骨关节丸的供试品溶液(1610005s)，按“权利要求书6”色谱条件连续进样6次，记录色谱图，进行精密度考察，计算得到18种壮骨关节丸中单体成分原儿茶酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、朝藿定a、朝藿定b、槲皮素、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、花椒毒素、刺芒柄花素、宝藿苷ⅰ、补骨脂甲素、补骨脂定、蛇床子素、木香烃内脂、补骨脂酚、11
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羰基
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β
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乙酰乳香酸峰面积的rsd分别为0.56％、2.11％、1.28％、0.89％、1.21％、0.49％、1.89％、0.98％、0.65％、0.87％、0.76％、1.33％、0.96％、1.13％、1.34％、0.77％、0.78％、0.34％。上述实验结果表明，仪器的精密度好。
[0039]
3、稳定性实验
[0040]
取同一份壮骨关节丸的供试品溶液(1610005s)，按“权利要求书6”色谱条件，分别在0、4、8、12、24h进样分析，记录色谱图。计算得到18种壮骨关节丸中单体成分原儿茶酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、朝藿定a、朝藿定b、槲皮素、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、花椒毒素、刺芒柄花素、宝藿苷ⅰ、补骨脂甲素、补骨脂定、蛇床子素、木香烃内脂、补骨脂酚、11
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羰基
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乙酰乳香酸峰面积的rsd分别为1.61％、2.01％、2.76％、1.79％、2.08％、1.54％、0.88％、0.68％、1.45％、1.17％、2.06％、2.43％、0.48％、1.54％、1.06％、0.97％、0.56％、2.14％。上述实验结果表明，供试品在24h内测定稳定性良好。
[0041]
4、重复性实验
[0042]
取同一批壮骨关节丸供试品溶液，分别按“权利要求书4”项下平行制备6份壮骨关节丸的供试品溶液，按“权利要求书6”色谱条件，依次进样6针，记录色谱图，计算得到18种壮骨关节丸中单体成分原儿茶酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、朝藿定a、朝藿定b、槲皮素、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、花椒毒素、刺芒柄花素、宝藿苷ⅰ、补骨脂甲素、补骨脂定、蛇床子素、木香烃内脂、补骨脂酚、11
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羰基
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乙酰乳香酸峰面积的rsd分别为0.99％、1.91％、1.68％、1.08％、1.54％、0.88％、0.68％、1.21％、1.75％、0.48％、1.54％、0.55％、1.02％、1.33％、1.07％、0.96％、0.86％、1.55％。上述实验结果表明，方法的重复性好。
[0043]
5、加样回收率试验
[0044]
取同一批壮骨关节丸供试品(1610005s)。精密称取6份。分别加入个对照品适量。按“权利要求书4”项下平行制备6份壮骨关节丸的供试品溶液，按“权利要求书6”色谱条件，进样记录色谱图，计算得到18种壮骨关节丸中单体成分原儿茶酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、朝藿定a、朝藿定b、槲皮素、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、花椒毒素、刺芒柄花素、宝藿苷ⅰ、补骨脂甲素、补骨脂定、蛇床子素、木香烃内脂、补骨脂酚、11
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乙酰乳香酸峰面积的的平均加样回收率分别为96.71％、98.23％、101.23％、100.89％、98.34％、97.99％、102.54％、99.12％、99.67％、100.65％、101.71％、98.18％、97.89％、102.01％、100.89％、99.54％、99.01％、103.36％。结果表明，该方法准确度良好。
[0045]
6、不同批次样品中18个主要成分在壮骨关节丸中的含量测定
[0046]
取16批不同批次的壮骨关节丸样品，按“权利要求书4”项下方法制备壮骨关节丸供试品溶液，并取对照品适量，以体积分数60％甲醇溶解，制备成混合对照品溶液。按“权利要求书6”项下方法分别进行检测，测定18种成分含量。计算得16批壮骨关节丸中18个单体成分所占的百分含量。从下表可以看出来自补骨脂的6种单体中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚平均百分含量较高。
[0047][0048][0049]
从上述结果可以看出，本发明采用高效液相色谱法，建立壮骨关节丸的指纹图谱，特别涉及壮骨关节丸18种成分含量研究。该方法操作简单，专属性强，易于分析评价。此方法可以更加证实壮骨关节丸的成分及含量，确保中成药临床用药的安全性、有效性和稳定性。
[0050]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0051]
本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。