一种基于uplc
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esi
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ms检测杜鹃兰假鳞茎化学成分的方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于uplc
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esi
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ms检测杜兰假鳞茎化学成分的方法，属于药用植物分析检测领域。
背景技术：
2.杜鹃兰(cremastra appendiculata(d.don)makino)为兰科杜鹃兰属多年生珍稀药用植物，以其干燥假鳞茎入药，始载于《本草拾遗》。《中国药典记载：山慈菇为杜鹃兰、独蒜兰和云南独蒜兰的干燥假鳞茎，均具有清热解毒、润肺止咳、活血化瘀、消肿散结等功效，内服可用于胃癌、肝癌、乳腺癌、子宫癌等，外用可治皮肤烫伤、蛇虫咬伤等。三者中以杜鹃兰品质最佳，研究最多。
3.有关杜鹃兰化学成分的检测方法较少，菲类化合物和联苄类化合物在山慈菇药材中数量较多、含量较低且结构不稳定，在光照等条件下易改变，不适合作为指标成分，由于有效成分不够明确，导致很难全面评价杜鹃兰药材的内在质量。崔宝松等以rp
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hplc同时测定了山慈菇药材中dactylorhin a和militarine两种化学成分，在独蒜兰和云南独蒜兰中检测到，而在杜鹃兰中几乎没有检测到；杨占南通过高效液相色谱
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二极管阵列检测器(hplc
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dad)对不同产地山慈菇化学成分进行分析，但无法分辨山慈菇三种不同的来源，且不清楚色谱峰对应的化合物。
4.新出版的《中华人民共和国药典》(2020年版，一部)中山慈菇药材项下也未规定山慈菇药材的有效成分及检测方法。因此，对杜鹃兰的药效物质基础及化学成分开展进一步研究很有必要。
5.据报道，秋水仙碱具有抗肿瘤、治疗痛风等活性；周仲瑛等通过对抗肿瘤分子机制的研究发现在消癌解毒复方制剂(由白花蛇舌草、山慈菇等中药组成)中，发挥肿瘤治疗作用的主要成分是槲皮素，因此推测槲皮素具有一定的抗肿瘤作用。目前未见关于杜鹃兰假鳞茎中秋水仙碱和槲皮素等化学成分检测方法的报道。由于杜鹃兰药效物质基础尚不明确，药材的质量控制手段主要靠传统的生药学研究。因此，建立一种能快速、高效、准确的测定杜鹃兰药材中主要化学成分的方法，实现对该物质群的全面控制，为杜鹃兰的质量评价提供更充分的依据，具有重要意义。
6.本发明所解决的技术问题是提供了一种可以对杜鹃兰干燥假鳞茎中化学成分进行定性分析的方法。
技术实现要素：
7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于uplc
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esi
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ms检测杜鹃兰假鳞茎提取物中化学成分的方法，克服现有技术中杜鹃兰化学成分检测困难、有效成分不确定等问题。
8.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种基于uplc
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esi
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ms检测杜鹃兰假鳞茎化学成分的分析方法，包括如下步骤：杜鹃兰人工栽培条件，杜鹃兰假鳞茎化学成分提取，标准品制备，待测样品制备，液相检测条件，质谱检测条件，离子源设定及化学成分定性
分析。具体步骤如下：
9.(1)杜鹃兰人工栽培条件
10.杜鹃兰cremastra appendiculata(d.don)makino，采自贵州省贵阳市花溪区高坡乡，按株距7cm栽植于贵州大学试验农场遮阳大棚内，栽培基质为阔叶林收集的表层疏松腐殖土，大棚光照强度为180
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230μmol
·
m
‑2·
s
‑1，相对湿度为70％
‑
85％。
11.(2)杜鹃兰化学成分提取
12.以健壮的已栽培3年的杜鹃兰假鳞茎为实验材料，洗净，切小片，60℃干燥，粉碎后过40目筛。用1.0g假鳞茎粉末分别以70％和55％的乙醇超声提取三次，每次提取时间为20min，合并提取液，回收乙醇至无醇味。
13.(3)标准品制备
14.分别精密称取秋水仙碱、大黄素甲醚、大黄酸、大黄素、槲皮素、芦丁、齐墩果酸、肉豆蔻酸和腺苷9种标准品各0.01g，加甲醇定容至50ml容量瓶中，用0.22μm的微孔滤膜过滤。
15.(4)待测样品制备
16.将杜鹃兰假鳞茎提取物加入色谱级甲醇超声使其充分溶解，并定容至50ml，过0.22μm微孔滤膜进样。
17.(5)色谱检测条件
18.取步骤(3)中5μl 9种标准品混和液和步骤(4)50μl待测样品，分别采用液相色谱
‑
质谱联用系统(美国thermo fisher scientific)和hesi
‑ⅱ
离子源检测杜鹃兰假鳞茎提取物的化学成分。
19.液相系统为dionex ultimate 3000 rslc(hpg)(thermo fisher scientific)，色谱柱为thermofisher hypersil gold aq(100*2.1mm*9μm)。梯度洗脱溶剂为含0.1％的甲酸(有机相a)和含0.1％甲醇的水(水相b)的乙腈溶液，洗脱时间及有机相配比分别为：0
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2min(20％a+80％b)；3
‑
6min(40％a+60％b)；12
‑
20min(90％a+10％b)；20.1
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25min(20％a+80％b)，流速为0.2ml/min，柱温为40℃。
20.(6)质谱检测条件
21.质谱系统为thermo scientific q exactive focus(thermo fisher scientific)，全质谱扫描范围为100
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200m/z，分辨率为17500
‑
70000，最大50
‑
100ms，分离宽度为1.5m/z。将agc和阈值设置为1e6和2e5，动态减排为5s。
22.(7)离子源设定
23.hesi
‑
ii电离方式为电喷雾离子源(esi)，分别以正负离子模式检测，其参数设定为：雾化电压3.0kv(+)/2.5kv(
‑
)，毛细管温度为320℃，探针加热温度为350℃，保护气体为35arb，aux气体为10arb，尾气为0arb。
24.(8)化学成分的定性解析
25.根据杜鹃兰假鳞茎的化学成分与9种标准品的保留时间和分子量进行比对，结果显示见图3，三年生杜鹃兰假鳞茎含有以下9种成分：秋水仙碱(1)、槲皮素(2)、腺苷(3)、芦丁(4)、大黄素(5)、大黄酸(6)、大黄素甲醚(7)、肉豆蔻酸(8)和齐墩果酸(9)。其中，腺苷和秋水仙碱为阳离子模式下检测得到，其余7种成分为阴离子模式下检测得到。
26.本发明的有益效果：
27.(1)克服了杜鹃兰化学成分检测方法少、有效成分不明确、药材内在质量评价困难
等缺陷。
28.(2)本发明采用液相色谱
‑
质谱联用系统(美国thermo fisher scientific)和hesi
‑ⅱ
离子源，以含0.1％的甲酸(有机相a)和含0.1％甲醇的水(水相b)的乙腈溶液为梯度洗脱溶剂，洗脱时间及有机相配比分别为：0
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2min(20％a+80％b)；3
‑
6min(40％a+60％b)；12
‑
20min(90％a+10％b)；20.1
‑
25min(20％a+80％b)，流速为0.2ml/min，柱温为40℃。以上实验的具体参数是经过两个多月的条件摸索得到的，若流动相的配比等实验参数发生变化，则杜鹃兰假鳞茎中的化学成分无法检测出。
29.(3)本发明所述的杜鹃兰化学成分检测方法，可以快速、准确和灵敏地检测杜鹃兰假鳞茎提取物的秋水仙碱、槲皮素、腺苷、芦丁、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、肉豆蔻酸和齐墩果酸9种化学成分，为杜鹃兰药材内在质量评估提供指导。
附图说明
30.图1为9种标准品的esi离子流色谱图，esi+模式：腺苷(1)，秋水仙碱(2)；esi
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模式：芦丁(3)，槲皮素(4)，大黄素(5)，大黄酸(6)，大黄素甲醚(7)，肉豆蔻酸(8)，齐墩果酸(9)；
31.图2为杜鹃兰假鳞茎提取物中化学成分esi离子模式图；
32.图3为杜鹃兰假鳞茎提取物中化学成分的液相色谱图；
33.图4为杜鹃兰假鳞茎提取物中化学成分的质谱图。
具体实施方式
34.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并以此达成技术功效的实现过程，据实施例能充分理解并据以实施。
35.实施例1：
36.(1)杜鹃兰人工栽培条件
37.杜鹃兰cremastra appendiculata(d.don)makino，采自贵州省贵阳市花溪区高坡乡，按株距7cm栽植于贵州大学试验农场遮阳大棚内，栽培基质为阔叶林收集的表层疏松腐殖土，大棚光照强度为180
‑
230μmol
·
m
‑2·
s
‑1，相对湿度为70％
‑
85％。
38.(2)杜鹃兰化学成分提取
39.以健壮的已栽培3年的杜鹃兰假鳞茎为实验材料，洗净，切小片，60℃干燥，粉碎后过40目筛。用1.0g假鳞茎粉末分别以70％和55％的乙醇超声提取三次，每次提取时间为20min，合并提取液，回收乙醇至无醇味。
40.(3)标准品制备
41.分别精密称取秋水仙碱、大黄素甲醚、大黄酸、大黄素、槲皮素、芦丁、齐墩果酸、肉豆蔻酸和腺苷9种标准品各0.01g，加甲醇定容至50ml容量瓶中，用0.22μm的微孔滤膜过滤。
42.(4)待测样品制备
43.将杜鹃兰假鳞茎提取物加入色谱级甲醇超声使其充分溶解，并定容至50ml，过0.22μm微孔滤膜进样。
44.(5)色谱检测条件
45.取步骤(3)中5μl 9种标准品混和液和步骤(4)50μl待测样品，分别采用液相色谱
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质谱联用系统(美国thermo fisher scientific)和hesi
‑ⅱ
离子源检测杜鹃兰假鳞茎提取物的化学成分。
46.液相系统为dionex ultimate 3000 rslc(hpg)(thermo fisher scientific)，色谱柱为thermofisher hypersil gold aq(100*2.1mm*9μm)。梯度洗脱溶剂为含0.1％的甲酸(有机相a)和含0.1％甲醇的水(水相b)的乙腈溶液，洗脱时间及有机相配比分别为：0
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2min(20％a+80％b)；3
‑
6min(40％a+60％b)；12
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20min(90％a+10％b)；20.1
‑
25min(20％a+80％b)；流速为0.2ml/min，柱温为40℃。
47.(6)质谱检测条件
48.质谱系统为thermo scientific q exactive focus(thermo fisher scientific)，全质谱扫描范围为100
‑
200m/z，分辨率为17500
‑
70000，最大50
‑
100ms，分离宽度为1.5m/z。将agc和阈值设置为1e6和2e5，动态减排为5s。
49.(7)离子源设定
50.hesi
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ii电离方式为电喷雾离子源(esi)，分别以正负离子模式检测，其参数设定为：雾化电压3.0kv(+)/2.5kv(
‑
)，毛细管温度为320℃，探针加热温度为350℃，保护气体为35arb，aux气体为10arb，尾气为0arb。
51.(8)化学成分的定性解析
52.根据杜鹃兰假鳞茎的化学成分与9种标准品的保留时间和分子量进行比对，结果显示见图3，三年生杜鹃兰假鳞茎含有以下9种成分：秋水仙碱(1)、槲皮素(2)、腺苷(3)、芦丁(4)、大黄素(5)、大黄酸(6)、大黄素甲醚(7)、肉豆蔻酸(8)和齐墩果酸(9)。
53.表1杜鹃兰假鳞茎9种化学成分的解析
54.化合物保留时间(min)esi电离模式先驱离子(m/z)分子式化合物名称15.69+400c
22
h
25
no6秋水仙碱26.12
‑
301c
15
h
10
o7槲皮素31.05+268c
10
h
13
n5o4腺苷42.15
‑
609c
14
h
28
o2芦丁511.75
‑
269c
15
h
10
o5大黄素613.37
‑
253c
15
h8o6大黄酸714.01
‑
283c
16
h
12
o5大黄素甲醚815.37
‑
228c
14
h
28
o2肉豆蔻酸915.53
‑
456c
30
h
48
o3齐墩果酸
55.上述实施例仅例示性说明本发明专利的方法与原理，而非用于限制本发明。对本领域普通技术人员来说，在本发明方法及原理下，能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动，则都应在本发明所附权利要求的保护范围。