一种稻田土壤生物固氮潜势的测定方法

本发明属于生物固氮领域，具体涉及一种稻田土壤生物固氮潜势的测定方法。

背景技术：

生物固氮是指微生物利用大气中惰性的氮气，在固氮酶的作用下将其转化为氨的过程，在工业合成氨技术发明之前，生物固氮一直是生态系统中氮素输入的重要过程。存在土壤中的生物固氮主要存在以下三种形式：共生生物固氮、联合生物固氮和自生生物固氮，其中共生固氮微生物需要与其他生物形成特异性结构以实现固氮效果，如根瘤；而参与后两者固氮过程的微生物生态类型多样，分布更加广泛，虽固氮量不及前者，但对生态系统氮素的固定和周转仍具有重要意义。目前，测定土壤生物固氮量的方法主要有总氮差值法、乙炔抑制法和同位素示踪法。总氮差值法通过计算生态系统中氮输入和输出的差值得出固氮量，但是忽略了氨挥发、径流、硝化-反硝化等过程导致的氮素损失，因此其结果的重复性和准确性较差。乙炔抑制法是利用固氮酶能将乙炔转化为乙烯的特性，通过测定一段时间内的乙烯转化量来间接推算固氮酶活性及固氮量的方法，其特点是成本低，操作相对简便，可在短时间内批量处理样品。但是该方法在准确定量上存在一定缺陷，固氮量需要通过乙烯和氮气的转化比例计算得来，而不同的固氮体系下，实际转化系数与理想条件下固氮量和乙烯1：3的比例存在极大变异，在实际操作中需要通过同位素方法校正转化系数方能得到较准确的固氮结果。¹⁵n2同位素示踪法是目前测定生物固氮最直接、准确的方法，其原理是构造含有高丰度¹⁵n2的密闭空间，通过测定样品中¹⁵n与自然丰度的差得到生物固氮量。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对总氮差值法准确度差和乙炔抑制法转化系数变异性大的局限，本发明提供一种稻田土壤生物固氮潜势测定方法，准确实现稻田土壤生物固氮潜势直接测定的方法。

技术方案：一种稻田土壤生物固氮潜势测定方法，步骤为：(1)泥浆配制：将过2mm筛的新鲜土壤样本和水按质量比1:7混合制成泥浆，冲氦气30分钟，在氦气环境下将曝过气的泥浆分装入12ml顶空瓶中并拧紧瓶盖，保证瓶中没有气泡，然后将泥浆置于旋转培养箱内室温避光预培养24h；(2)同位素标记：利用玻璃进样针刺穿瓶盖隔垫向泥浆样品中添加0.5ml丰度为99％¹⁵n-n2，同时利用针头排出等体积泥浆，添加完¹⁵n-n2的泥浆样品置于旋转培养箱室温避光培养；(3)生物固氮量测定：培养结束后将泥浆重新分装进12ml顶空瓶，然后向培养前和培养后的泥浆样品加入0.2ml次溴酸钠碘溶液并震荡均匀，再以1500r·min^-1速度离心5min，最后利用膜进样质谱仪测定上清液水溶解的n2同位素信号强度；(4)标准曲线绘制和生物固氮潜势计算：制备0、2、4、8、10、20μmol·l^-1丰度为99％的¹⁵nh4cl，溶液分装于12ml顶空瓶中，用微量进样针往每个顶空瓶中加入0.2ml氧化剂将¹⁵nh4⁺氧化为n2，所述n2为²⁹n2和³⁰n2，利用mims测定水中¹⁵n信号强度，¹⁵n信号强度等于两倍³⁰n2信号强度加²⁹n2信号强度，用2׳⁰n2+²⁹n2表达，得到¹⁵n信号强度与¹⁵nh4cl浓度之间的对应曲线，每个浓度设置三个重复，实际泥浆样品中生物固氮潜势计算公式如下：

其中，f是生物固氮潜势，nnmol·g^-1·h^-1；¹⁵nfinal、¹⁵ninitial分别是培养前后体系中¹⁵nh4⁺的浓度，μmol·l^-1；v是泥浆体积，ml；w是干土重，g；t是培养时间，h。

优选的，上述步骤(1)和步骤(2)中，旋转培养箱的转速为7-9r·min^-1，步骤(2)中培养时间在12h到48h之间。

优选的，上述步骤(3)中，氧化剂配制方法为：将液溴滴入12mol·l^-1的naoh溶液中，液溴与naoh溶液的体积比为1:5，反应容器置于5℃以下的冰水混合物中，混合后的溶液置于4℃冰箱静置一周后，取出用分液漏斗过滤，取上清液与0.2％的ki溶液等体积混合后保存于4℃冰箱，即得到氧化剂次溴酸钠碘溶液。

有益效果：本发明克服了现有技术准确度差、转换系数变异大的缺点，采用同位素示踪结合mims方法，实现稻田土壤生物固氮潜势的直接测定。本发明可针对不同稻田土壤类型，分别测定土壤样本的生物固氮潜势，操作流程简便，精度高(变异系数在3％以内)，可实现样本的批量处理。

附图说明

图1同位素标记示意图；1微量进样针、2针头、3带硅橡胶隔垫顶空瓶；

图2同位素浓度测定；4待测样品、5膜进样质谱仪；

图3标准曲线(由¹⁵n信号强度与¹⁵nh4⁺浓度回归获得)；

图4培养后不同实验处理下样本的变异系数；

图5本方法测定结果与乙炔还原法测定结果之间关系。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术法案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

采集桃源长期观测站表层0-20cm水稻土，共涉及六个处理，分别为不施肥的对照处理、仅施n肥处理、氮磷肥处理、氮钾肥处理、氮磷钾肥处理和氮磷钾肥与秸秆联合施用处理，土壤采集后用封口袋密封尽快送至实验室，统一过2mm筛并去除杂质，并按以下步骤进行水稻土生物固氮速率测定工作。

1)泥浆配制

将过2mm筛的新鲜土壤样本和水按质量比1:7混合制成泥浆后，冲氦气30分钟以降低背景n2，在氦气环境下将曝过气的泥浆分装入12ml顶空瓶中并拧紧瓶盖，保证瓶中没有气泡，然后将泥浆至于旋转培养箱内25℃避光预培养24h。

2)同位素标记

利用玻璃进样针刺穿瓶盖隔垫向泥浆样品中添加0.5ml¹⁵n丰度为99％¹⁵n-n2，同时利用针头排出等体积泥浆，添加完¹⁵n-n2的泥浆样品置于速度约8r·min^-1的旋转培养箱避光培养36h。

3)生物固氮产物测定

培养结束后将泥浆重新分装进12ml顶空瓶，然后向培养前和培养后的泥浆样品加入0.2ml次溴酸钠碘溶液并震荡均匀，利用次溴酸盐碘溶液的强氧化性将生物固氮产物氧化成n2。再以1500r·min^-1速度离心5min，最后利用mims测定上清液水溶解的¹⁵n同位素信号强度。

4)标准曲线绘制和生物固氮潜势计算

制备0、2、4、8、10、20μmol·l^-115n丰度为99％¹⁵nh4cl溶液分装于12ml顶空瓶中，用微量进样针往每个顶空瓶中加入0.2ml氧化剂将¹⁵nh4⁺氧化为n2(²⁹n2和³⁰n2)，利用mims测定水中¹⁵n信号强度(2׳⁰n2+²⁹n2)，得到¹⁵n信号强度与¹⁵nh4cl浓度之间的对应曲线，每个浓度设置三个重复。具体实验泥浆中生物固氮潜势计算公式如下：

其中，f是生物固氮潜势，nnmol·g^-1·h^-1；¹⁵nfinal、¹⁵ninitial分别是培养前后体系中¹⁵nh4⁺的浓度，μmol·l^-1；v是泥浆体积，ml；w是干土重，g；t是培养时间，h。

将mims测得各样品的¹⁵n信号通过标准曲线转化计算，测得桃源不同处理的稻土的生物固氮潜势在0.84±0.21～2.42±0.78nmol·g^-1·h^-1，对照处理下水稻土生物固氮速率为1.75±0.22nmolnh4⁺·g^-1·h^-1,氮肥处理为0.98±0.15nmolnh4⁺·g^-1·h^-1，氮磷处理为1.54±0.11nmolnh4⁺·g^-1·h^-1，氮钾处理为0.84±0.21nmolnh4⁺·g^-1·h^-1，氮磷钾处理为2.42±0.78nmolnh4⁺·g^-1·h^-1，氮磷钾+秸秆处理为1.93±0.04nmolnh4⁺·g^-1·h^-1。对比该方法测得土壤固氮潜势与乙炔还原法测定土壤固氮酶活性结果发现，两者呈显著正相关(p<0.05)且线性回归决定系数为0.68。