本发明属于水质检测技术领域，尤其涉及一种高效检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法。
背景技术：
贾第鞭毛虫（giardia）是一种致病性原生寄生虫，主要有两个种，即g.intestinalis（g.lamblia）和g.muris，其寄主分别为人类和老鼠。人类感染贾第鞭毛虫孢囊（cyst）可导致贾第鞭毛虫病(giardiosis)，一般在感染5-6天后表现出急性贾第鞭毛虫病症状，持续1-3周，症状包括：腹泻、腹痛、肿胀、恶心和呕吐等；慢性贾第鞭毛虫病症状包括反复发作、营养吸收障碍，可能导致衰弱无力。
隐孢子虫（cryptosporidium）是水体中发现的一种原生寄生虫，其主要包括6种：c.parvum、c.baileyi、c.meleagridis、c.muris、c.serpenti、c.nasorums，其中c.parvum（微小隐孢子虫）是目前已知的唯一感染人类的隐孢子虫。感染隐孢子虫卵囊（oocyst）可引起隐孢子虫病，常见症状是水泻，可伴随脱水、体重减少、腹痛、发烧、恶心和呕吐。免疫能力健全者一般症状持续时间较短（1-2周）；免疫能力低下者，症状严重，有时甚至危及生命。
世界卫生组织（who）的《饮用水水质准则》第四版对“两虫”的危害及传播途径等做了详细介绍，但未列出推荐的限值。who也将隐孢子虫病列为艾滋病的怀疑指标之一，亦未列出明确的“两虫”检测限值。我国2006版饮用水水质标准中明确规定了“两虫”的检测限值<1个/10l，方法加标回收率不得小于10%。
目前已经建立了对贾第鞭毛虫和隐孢子虫的多种检测方法。这些方法特异性强，灵敏度高，稳定性好，且操作简便。主要有：1）免疫荧光法：该方法具有高度敏感性、特异性和重复性，有利于抗原和抗体的分离鉴定，还可用于探索抗原的分布和抗体的形成部位，以研究免疫反应的本质及寄生虫免疫的病理机制。2）免疫印迹技术：该方法是将聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术结合的一种方法。可用于隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测，隐孢子虫和贾第鞭毛虫病诊断和特异性抗原抗体分析。该技术能分离出高分辨率、高敏感性和高特异性的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊抗原，有利于提高两虫检出率及两虫疾病的免疫学诊断效果。3）pcr方法：特异性强，灵敏度高。不依赖人为主观因素，可同时批量处理样品，选用不同引物，可准确鉴定贾第鞭毛虫和隐孢子虫种属，可区分孢囊和卵囊死活，是目前该领域的研究热点。4）酶联免疫吸附法（elisa）：有较高的特异性、敏感性、稳定性和可重复性。可用于检测饮用水、污水、血清等。何宏轩等采用cp15/60重组蛋白作为包被抗原建立了间接elisa方法，其特异性较好。在美国，elisa试剂盒已广泛应用于临床检查中。但上述方法检测成本高。且其染色方法为利用有机染料对卵囊和孢囊进行荧光染色标记来镜检，染料见光易分解，不利于长期保存样品。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高效检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法，检测成本大幅降低，回收率高，前处理快速简便，可同时检测多个“两虫”样品。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高效检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法，该高效检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法包括包括下列步骤：
a、采样，随即取城市用水并进行过滤；
b、淘洗，对过滤后的水进行淘洗；
c、浓缩，将水样富集淘洗液进行浓缩；
d、分离，将浓缩得到的沉淀进行分离；
e、染色；
f、镜检；
i、结果的计算和报告；
j、质量控制，进行计算结果的误差分析。
优选的，所述采样包括下述步骤：
a、采样时将一次性使用的滤芯装入过滤器中，将过滤器与取样连接装置连接；
b、调节蠕动泵流速约为2l/min，开始过滤水样。
优选的，所述淘洗包括下述步骤：
a、水样过滤结束后，将滤器安装于快速淘洗器上，装好淘洗感应器；
b、把500ml锥形底离心管放在收集支架上，开始自动淘洗；
c、淘洗结束后，将离心管从快速淘洗器上取下，关闭空气压缩机和快速淘洗器。
优选的，所述浓缩包括下述步骤：
a、将装有水样富集淘洗液的500ml离心管2000g离心15min。需缓慢减速，以免搅动沉淀物；
b、离心结束后，留下10ml沉淀物，小心弃去上清液。
优选的，所述分离包括下述步骤：
a、将离心沉淀充分涡旋振荡混匀后，平均分装于2个15ml锥形离心管中；
b、分别用1mlpbst溶液洗500ml离心管4次，洗涤后的pbst溶液平均分装于上述2个15ml离心管中；
c、分别向各15ml管中添加1ml10%的甲醛溶液和5ml乙酸乙酯，充分摇匀；
d、离心10min，离心管混合液分成两层，小心弃去上清液，下层沉淀留下备用。
优选的，所述染色包括下述步骤：
a、将一张孔径为1μm或3μm，直径为25mm的ptfe膜放在不锈钢过滤支架上，装好抽滤筒，打开真空泵；
b、滴加3mlpbs缓冲液至滤膜上，抽吸pbs缓冲液，注意留一点液面在滤膜上，不要抽干；
c、把15ml离心管中的富集物小心倾倒或滴于滤膜上，抽滤；
d、用10mlpbst溶液分2次清洗离心管，清洗液倒入滤筒中抽滤；
e、用10mlpbst溶液清洗滤筒壁，抽吸清洗液，关闭抽滤阀；
f、取500µl1%bsa滴于滤膜正上方，保持2min，2min后抽吸1%bsa；
g、将微孔滤膜移至载玻片上，滴加50μl荧光染色剂于滤膜上，避光静置30min；
h、加入50μldapi工作液于滤膜上，避光静置10min；
i、将滤膜移至抽滤支架上，抽吸荧光染色液和dapi工作液；
j、用3mlpbst缓冲液淋洗滤膜，抽吸pbst缓冲液；
k、滴1滴dabco-甘油于载玻片上，将滤膜平移至载玻片上，在滤膜上滴一滴dabco-甘油液，盖上盖玻片。
优选的，所述镜检包括下述步骤：
a、镜检前打开显微镜和汞灯，预热15min。
b、在4fitc模式下采用20倍物镜观察，发现目标物后转换至dapi模式，改用40倍物镜观察，当fitc与dapi染色特征均符合染色特征时，在100倍物镜dic模式下观察内部结构进一步证实，对全膜计数。
优选的，所述结果的计算和报告包括：
每升样品中的孢（卵）囊数
y=(x×v)/(v1×v2)（1）
式中：
y：每升水中孢囊或卵囊的数目；x：显微镜计数所得的孢囊或卵囊的数目；
v：离心浓缩后再悬浮的体积，单位ml；v1：计数样本的体积，单位ml；
v2：过滤水样的体积，单位l。
相对标准偏差的计算
rsd=y/x
y2=∑(xi-x)2/(n-1)（2）
x=∑xi/n
式中：rsd：相对标准偏差；xi：每次加标回收的个数；n：检测到的次数。
检测限
d=v/(v1×v2)（3）
式中：d：每升孢囊或卵囊的检测限；v：浓缩后再悬浮的体积，单位ml
v1：计数样本的体积，单位ml；v2：浓缩时过滤水样的体积，单位l。
优选的，所述质量控制包括：
阴性对照：a、加入10l纯水到洁净的样品瓶中；
b、通过样品富集，洗脱，离心，甲醛—乙酸乙酯离心纯化，免疫荧光染色，镜检计数等检测步骤，镜检时不得在ptfe膜上检出隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊。
阳性对照：a、在装有10l纯水的样品瓶中加入100~500个贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊，充分混匀；
b、用淘洗滤芯富集样品，富集完毕后，再用6l纯水分3次冲洗同一样品瓶，将洗脱的纯水富集于同一滤芯中；
c、隐孢子虫卵囊的初始回收率应在24%-100%之间，相对标准偏差应小于55%；贾第鞭毛虫孢囊的初始回收率范围应在24%-100%，相对标准偏差应小于49%。不在此范围的，需检查所有设备和试剂，并检查各实验步骤是否有误。
实际样品加标回收率
其操作步骤如下：
a、取实际水样3份，每份各10l；
b、将1份10l水样经过滤浓缩，分离纯化，染色和镜检计数，记录水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的个数。
c、在其他2份水样中各加100-500个隐孢子虫和100-500个贾第鞭毛虫，将加标水样过滤浓缩、分离纯化、染色和镜检计数，记录加标水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的个数。
d、计算其平均回收率和相对标准偏差，其中，隐孢子虫的回收率应满足13-111%，相对标准偏差小于61%，贾第鞭毛虫的回收率在15-118%之间，相对标准偏差小于30%。
本底加标回收率计算：
r=(nsp-ns)/t
式中：r：回收率；
nsp：加标水样中检测到的“两虫”数目；
ns：未加标水样中检测到的“两虫”数目。
式中：x(mean)：“两虫”平均检测个数；
ms：实际水样加标检测出“两虫”数目；
msd：重复实际水样加标检测出的“两虫”数目。
式中：rpd：两次加标回收率的相对偏差；
nms：第一次水样加标检测到的“两虫”个数；
nmsd：第二次水样加标检测到的“两虫”个数。
本发明的有益效果是：本方法用乙酸乙酯+甲醛通过离心来对“两虫”进行纯化，取代了美国epa1623方法中最昂贵的分离纯化试剂：免疫分离磁珠，使检测成本大幅降低；该方法回收率高，前处理快速简便，能同时检测多个“两虫”样品，可用于饮用水和水源水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测，为日常监测饮用水和水源水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫健康风险评价提供基础。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并详细说明如下。
下面将对本发明实施例的高效检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法作详细说明。
该高效检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法包括下列步骤：
a、采样，随机取城市用水并进行过滤；
b、淘洗，对过滤后的水进行淘洗；
c、浓缩，将水样富集淘洗液进行浓缩；
d、分离，将浓缩得到的沉淀进行分离；
e、染色；
f、镜检；
i、结果的计算和报告；
j、质量控制，进行计算结果的误差分析。
采用下述试验试剂和试验设备：
吐温80（tween80，cas:9005-65-6），分析纯。
吐温20（tween20，cas:9005-64-5），分析纯。
50g/l次氯酸钠溶液，分析纯。
淘洗缓冲液：将1.44gna2hpo4、0.24gkh2po4、0.2gkcl、8gnacl加入900ml纯水。搅拌至完全溶解后，加入0.1ml吐温20，继续搅拌10min，然后用纯水稀释定容至1000ml，各组分均为分析纯。
0.1mol/l盐酸溶液，分析纯。
0.1mol/l氢氧化钠溶液，分析纯。
dabco（1,4-二偶氮双环[2,2,2]辛烷，cas：280-57-9）—甘油：称取12.6g甘油，加热至60~70℃，再加入0.2gdabco搅拌溶解。室温条件下储存12个月，分析纯。
1%bsa（牛血清蛋白，cas：9048-46-8）：称取1gbsa溶于100ml纯水中，过0.45μm滤膜，分析纯。
pbs溶液（磷酸盐缓冲液）：每1000mlpbs溶液含有：8.0gnacl，2.9gna2hpo4.12h2o，0.2gkcl，0.2gkh2po4。用盐酸或氢氧化钠调节ph值到7.2~7.4之间。4℃保存1个星期，各组分均为分析纯。
pbst溶液：在100ml的pbs溶液中加入0.01ml吐温80，即为pbst溶液。室温保存1个月。
抗贾第鞭毛虫、隐孢子虫单克隆荧光抗体—异硫氰荧光素染色试剂盒，于4℃储存。
贾第鞭毛虫、隐孢子虫标样。
甲醇（色谱纯）。
dapi储备液：2mgdapi（4，6-二氨基-2-苯基吲哚，cas：28718-90-3）溶于1ml甲醇中，4℃避光保存15天，dapi：分析纯。
dapi工作液：取50μldapi储备液加入50mlpbs缓冲液中。现用现配，4℃避光保存。
乙酸乙酯，分析纯。
10%甲醛溶液，分析纯。
仪器设备
采样器材：快速淘洗滤器及配套快速连接装置；快速淘洗滤芯；蠕动泵（流量达到0.3~2.0l/min）；塑料采样桶（10l或20l）。
淘洗/浓缩/纯化器材：快速淘洗器；离心机（离心力可达2500g，配备500ml、15ml离心管）；空气压缩机（0.4mpa以上压力，15l压缩空气）。万分之一电子天平；玻璃吸管或巴斯德吸管；锥形离心管：500ml、15ml；ph计；涡旋振荡器；磁力搅拌器；玻璃真空抽滤装置；真空泵；载玻片及盖玻片；血球计数器；37℃恒温培养箱；荧光显微镜：配450nm~480nm蓝色滤光片，330nm~385nm紫外滤光片，20、40、100倍物镜。；孔径为1μm和3μm，直径为25mm的ptfe（聚四氟乙烯）膜。
实施例
采样：
a、采样时将一次性使用的滤芯装入过滤器中，将过滤器与取样连接装置连接；
b、调节蠕动泵流速约为2l/min，开始过滤水样。
淘洗：
a、水样过滤结束后，将滤器安装于快速淘洗器上，装好淘洗感应器；
b、把500ml锥形底离心管放在收集支架上，开始自动淘洗；
c、淘洗结束后，将离心管从快速淘洗器上取下，关闭空气压缩机和快速淘洗器。
浓缩：
a、将装有水样富集淘洗液的500ml离心管2000g离心15min。需缓慢减速，以免搅动沉淀物；
b、离心结束后，留下10ml沉淀物，小心弃去上清液。
分离：
a、将离心沉淀充分涡旋振荡混匀后，平均分装于2个15ml锥形离心管中；
b、分别用1mlpbst溶液洗500ml离心管4次，洗涤后的pbst溶液平均分装于上述2个15ml离心管中；
c、分别向各15ml管中添加1ml10%的甲醛溶液和5ml乙酸乙酯，充分摇匀；
d、离心10min，离心管混合液分成两层，小心弃去上清液，下层沉淀留下备用。
染色：
a、将一张孔径为1μm或3μm，直径为25mm的ptfe膜放在不锈钢过滤支架上，装好抽滤筒，打开真空泵；
b、滴加3mlpbs缓冲液至滤膜上，抽吸pbs缓冲液，注意留一点液面在滤膜上，不要抽干；
c、把15ml离心管中的富集物小心倾倒或滴于滤膜上，抽滤；
d、用10mlpbst溶液分2次清洗离心管，清洗液倒入滤筒中抽滤；
e、用10mlpbst溶液清洗滤筒壁，抽吸清洗液，关闭抽滤阀；
f、取500µl1%bsa滴于滤膜正上方，保持2min，2min后抽吸1%bsa；
g、将微孔滤膜移至载玻片上，滴加50μl荧光染色剂于滤膜上，避光静置30min；
h、加入50μldapi工作液于滤膜上，避光静置10min；
i、将滤膜移至抽滤支架上，抽吸荧光染色液和dapi工作液；
j、用3mlpbst缓冲液淋洗滤膜，抽吸pbst缓冲液；
k、滴1滴dabco-甘油于载玻片上，将滤膜平移至载玻片上，在滤膜上滴一滴dabco-甘油液，盖上盖玻片。
镜检：
a、镜检前打开显微镜和汞灯，预热15min。
b、在4fitc模式下采用20倍物镜观察，发现目标物后转换至dapi模式，改用40倍物镜观察，当fitc与dapi染色特征均符合染色特征时，在100倍物镜dic模式下观察内部结构进一步证实，对全膜计数。
结果的计算和报告：
每升样品中的孢（卵）囊数
y=(x×v)/(v1×v2)（1）
式中：
y：每升水中孢囊或卵囊的数目；x：显微镜计数所得的孢囊或卵囊的数目；
v：离心浓缩后再悬浮的体积，单位ml；v1：计数样本的体积，单位ml；
v2：过滤水样的体积，单位l。
相对标准偏差的计算
rsd=y/x
y2=∑(xi-x)2/(n-1)（2）
x=∑xi/n
式中：rsd：相对标准偏差；xi：每次加标回收的个数；n：检测到的次数。
检测限
d=v/(v1×v2)（3）
式中：d：每升孢囊或卵囊的检测限；v：浓缩后再悬浮的体积，单位ml
v1：计数样本的体积，单位ml；v2：浓缩时过滤水样的体积，单位l。
质量控制：
阴性对照：a、加入10l纯水到洁净的样品瓶中；
b、通过样品富集，洗脱，离心，甲醛—乙酸乙酯离心纯化，免疫荧光染色，镜检计数等检测步骤，镜检时不得在ptfe膜上检出隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊。
阳性对照：a、在装有10l纯水的样品瓶中加入100~500个贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊，充分混匀；
b、用淘洗滤芯富集样品，富集完毕后，再用6l纯水分3次冲洗同一样品瓶，将洗脱的纯水富集于同一滤芯中；
c、隐孢子虫卵囊的初始回收率应在24%-100%之间，相对标准偏差应小于55%；贾第鞭毛虫孢囊的初始回收率范围应在24%-100%，相对标准偏差应小于49%。不在此范围的，需检查所有设备和试剂，并检查各实验步骤是否有误。
实际样品加标回收率
其操作步骤如下：
a、取实际水样3份，每份各10l；
b、将1份10l水样经过滤浓缩，分离纯化，染色和镜检计数，记录水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的个数。
c、在其他2份水样中各加100-500个隐孢子虫和100-500个贾第鞭毛虫，将加标水样过滤浓缩、分离纯化、染色和镜检计数，记录加标水样中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的个数。
d、计算其平均回收率和相对标准偏差，其中，隐孢子虫的回收率应满足13-111%，相对标准偏差小于61%，贾第鞭毛虫的回收率在15-118%之间，相对标准偏差小于30%。
本底加标回收率计算：
r=(nsp-ns)/t
式中：r：回收率；
nsp：加标水样中检测到的“两虫”数目；
ns：未加标水样中检测到的“两虫”数目。
式中：x(mean)：“两虫”平均检测个数；
ms：实际水样加标检测出“两虫”数目；
msd：重复实际水样加标检测出的“两虫”数目。
式中：rpd：两次加标回收率的相对偏差；
nms：第一次水样加标检测到的“两虫”个数；
nmsd：第二次水样加标检测到的“两虫”个数。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。