一种羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测方法

本发明涉及抗生素及其代谢产物检测领域，具体涉及一种羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测方法。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，我国对肉制品的消费量也逐步提升，以羊肉为代表的肉制品产量也在逐年提升。羊肉因具有低脂肪、高蛋白的特点，在市场上深受消费者的喜爱。抗生素及其代谢产物是一种兽用抗生素，可作为促生长剂和抗菌剂直接添加到动物饲料中，最终通过直接食用、生态富集作用及食物链传递进入人体体内，从而损害人体健康。

用于动物源性食品中抗生素、或抗生素代谢产物的检测方法有气相色谱－串联质谱法、液相色谱法、液相色谱－串联质谱法、气相色谱－串联质谱法等。目前应用液相色谱－串联质谱技术可以实现动物源性食品中抗生素的准确定量，但无法实现抗生素、或抗生素代谢产物的高通量定性定量分析。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测方法，高通量定性定量分析、扫描速度快、检测灵敏度高、简便的特点，为抗生素、抗生素代谢产物的检测提供了新的方法。

本发明具体技术方案如下：

一种羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测方法，包括如下步骤：

步骤1，将羊肉研磨成匀浆后采用quechers前处理方法进行处理，得到提取液，将提取液用乙酸铵溶液稀释后进行过滤，提取液与乙酸铵的比例为0.5ml：0.1mm，得到过滤液；

步骤2，将过滤液在超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱中进行测定，得到羊肉中6类抗生素、抗生素代谢产物的色谱峰、全扫描质荷比和二级特征碎裂片段，6类抗生素、抗生素代谢产物分别为磺胺醋酰、n4-磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、n4-ac磺胺甲噻二唑、四环素、土霉素、盐酸土霉素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、奥芬达唑、噻苯咪唑、5-羟基噻苯眯唑、青霉素g和氨苄青霉素；

将6类抗生素、抗生素代谢产物的标准溶液用乙酸铵溶液稀释后，得到对应的稀释液，所有的稀释液分别在超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱中进行测定，获得对应物质的色谱峰、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段和碎裂途径，所有物质的色谱峰、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段形成标准物质数据库；

步骤3，将步骤2得到的色谱峰一一进行提取，得到对应的未出现在标准物质数据库中呈正态分布的色谱峰，将每个所述的色谱峰与标准物质数据库中的色谱峰进行对比，得到每个所述色谱峰对应的物质的类别，再对每个所述色谱峰对应的保留时间、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段进行分析，得到对应物质的元素组成，最后通过每个所述色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段与标准物质数据库中色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段，以及碎裂途径进行比对，得到每个所述色谱峰对应物质的分子式，完成对步骤2中色谱峰与对应抗生素、抗生素代谢产物的一一对应；

步骤4，用每个待检测物质对应的色谱峰的峰面积与相应物质的色谱峰的峰面积比值乘以相应物质的标准溶液浓度，得到提取液中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度，最后用如下公式得到羊肉中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度，完成对羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测；

ci＝(c0v)/m，其中ci为羊肉中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度，单位为μg/kg，c0为提取液中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度，单位为μg/l，v为提取液的体积，单位为l，m为羊肉的质量，单位为kg。

优选的，步骤1先将羊肉研磨成的匀浆后用乙腈的乙酸溶液进行涡旋，得到混合体系a，在混合体系a中加入无水硫酸镁、乙酸钠涡旋后振荡提取，得到提取液，将提取液离心后得到混合体系b，再在混合体系b中加入乙二胺-n-丙基硅胶、十八烷基三氯硅烷和mgso4，得到混合体系c，将混合体系c涡旋后进行离心，提取上清液得到提取液。

进一步，羊肉、无水硫酸镁和乙酸钠的质量比为(5～10):(5～6):(2～3)，乙二胺-n-丙基硅胶、十八烷基三氯硅烷、mgso4和羊肉的质量比为(0.3～0.4):(0.2～0.4):(0.6～0.8):(5～10)。

进一步，乙腈的乙酸溶液中乙腈与乙酸的体积比为1％，乙腈的乙酸溶液与羊肉的比例为(5～20)ml:(5～10)g。

进一步，步骤2中超高效液相色谱选取accucoreaq，具体条件如下所示，超高效液相色谱的柱温为50～55℃，喷雾电压为4～5kv，离子源温度为60～65℃，毛细管温度为325～375℃；

四极杆静电场轨道离子阱质谱采用两级扫描方式，二级扫描方式为可变的数据非依赖采集，扫描时间为0～15min；分辨率采用17500fwhm，分为两个质量扫描片段：m/z＝112-487设定为第一个扫描，隔离窗口范围设为25da，相应循环计数设定为16个，m/z＝550-850设为第二个扫描，隔离窗口范围设为100da，相应循环计数设定为4个。

进一步，超高效液相色谱条件中，流动相a为甲酸、甲酸铵和水组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mm，流动相b为甲酸、甲醇和甲酸铵组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mm；

梯度洗脱程序为0～1min内，流动相a的体积比例为80％；1～10min内，流动相a的体积比例由80％线性减小至0；10～14min内，流动相a的体积比例为0；14～16min内，流动相a的体积比例由0线性增加至80％；16～20min内，流动相a的体积比例为80％，流速为0.3～0.5ml/min。

进一步，超高效液相色谱条件中，鞘气流速为55～60arb，辅助气流速为40～45arb，气帘气流速为5～8arb，加热温度为325～375℃。

进一步，四极杆静电场轨道离子阱质谱中，一级扫描方式为全扫描模式，电离模式为电喷雾正电离模式和电喷雾负电离模式。

进一步，四极杆静电场轨道离子阱质谱中，碰撞能量分别为17.0ev，35.0ev和52.0ev。

优选的，步骤2先选取比理论值小且差值在0.001～0.002的全扫描质荷比，之后选取1～4个有响应值且有特征性的碎裂片段，根据元素的组成得到二级特征碎裂片段。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

本发明一种羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测方法，先利用quechers前处理方法对羊肉匀浆中的固体样品进行处理，之后得到的提取液与乙酸铵溶液稀释后可采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱，对6类抗生素、抗生素代谢产物的色谱峰、全扫描质荷比和二级特征碎裂片段进行采集，同时建立羊肉中6类抗生素、抗生素代谢产物的标准数据库，再将色谱峰一一进行提取，得到对应的未出现在标准物质数据库中呈正态分布的色谱峰，然后依次得到对应的物质的类别、元素组成和分子式，最后通过换算得到羊肉中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度。本发明构建了羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的非定向检测方法，结论显示该方法具有精密度及准确度高的特点，可较好地实现于羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的测定，具有重要的应用价值，可检测选出羊肉中的抗生素、抗生素代谢产物的浓度，具有灵敏、快速的特点，从而实现大量数据的高通量分析，适用于目前对于羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的监测。

附图说明

图1为本发明所述的磺胺类抗生素的特征碎裂途径。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的，并对其内容进行限定。

本发明一种羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测方法，包括6类抗生素、抗生素代谢产物，具体为磺胺醋酰和它的代谢产物n4-磺胺醋酰，磺胺甲噻二唑和它的代谢产物n4-ac磺胺甲噻二唑；四环素，土霉素和它的代谢产物盐酸土霉素；红霉素、克拉霉素和罗红霉素；依诺沙星、氧氟沙星和诺氟沙星；奥芬达唑，噻苯咪唑和它的代谢产物5-羟基噻苯眯唑；青霉素g和氨苄青霉素；具体包括以下步骤：

步骤1，处理羊肉样品；

称取羊肉样品5～10g(精确至0.01g),切碎，研磨成匀浆。

将匀浆置于50ml离心管中，加入15～20ml1％乙腈乙酸溶液(乙腈与乙酸的体积比为1％)，涡旋1～3min后加入5～6g无水硫酸镁、2～3g乙酸钠，涡旋混合1～3min后振荡提取2～5min，在2000～4000rpm下离心5～10min(0～5℃)。

取2～5ml上清液于15ml聚丙烯离心管中，加入300～400mg固体分散净化剂psa(即乙二胺-n-丙基硅胶，吸附中等极性和极性的杂质)、200～400mg固体分散净化剂c18(即十八烷基三氯硅烷，吸附反相固体吸附剂，吸附脂类等非极性杂质)和600～800mgmgso4，涡旋1～3min后以2000～4000rpm离心10～20min，移取上清液得到提取液；

quechers前处理方法机理是肉制品匀浆中的固体样品经过乙腈萃取，接着通过分散基质萃取去除乙腈中存在的大部分干扰物，萃取液就能直接进行质谱分析，是一种有效分离痕量农残的方法。

本发明在具体实施时，在以上数据中采用了最优的数据进行，由于本身范围较小，固没有提供其他数据，具体如下。

称取羊肉样品5g(精确至0.01g),切碎，研磨成匀浆。

将匀浆置于50ml离心管中，加入20ml1％乙腈乙酸溶液(乙腈与乙酸的体积比为1％)，涡旋1min后加入6g无水硫酸镁、2g乙酸钠，涡旋混合1min后振荡提取2min，在3000rpm下离心5min(3℃)。

取2ml上清液于15ml聚丙烯离心管中，加入300mg固体分散净化剂psa、200mg固体分散净化剂c18和800mgmgso4，涡旋1min后以3000rpm离心15min，移取上清液得到提取液。

步骤2，采用高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱仪对抗生素、抗生素代谢产物进行测定；

取500μl提取液与500μl0.2m乙酸铵溶液，这样以1：1(v/v)对提取液进行稀释，以加强离子化，称取154g的乙酸铵溶于1l的纯化水中就得到0.2mol/l乙酸铵溶液，经0.22μm有机微孔膜过滤，得到的待测样品导入进样小盘中进样，利用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱采集上述18种抗生素、抗生素代谢产物的色谱峰、全扫描质荷比和二级特征碎裂片段。

色谱测定条件如下：

色谱柱为accucoreaq，是一种uhplc保护柱，(规格为10mm×2.1mm，2.6μm，美国thermofisherscientific公司)。柱温为50～55℃。流动相a为甲酸、甲酸铵和水组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mm，流动相b为甲酸、甲醇和甲酸铵组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mm。梯度洗脱程序为0～1min内，流动相a的体积比例为80％；1～10min内,流动相a的体积比例由80％线性减小至0；10～14min内,流动相a的体积比例为0，14～16min内，流动相a的体积比例由0线性增加至80％；16～20min内，流动相a的体积比例为80％，流速为0.3～0.5ml/min。碰撞气为高纯氮气(纯度为99.99％)，离子源为电喷雾离子源，化合物采用正模式测定，鞘气流速为55～60arb，辅助气流速为40～45arb，气帘气流速为5～8arb，喷雾电压为4～5kv，离子源温度为60～65℃，毛细管温度为325～375℃，加热温度为325～375℃，进样量为10μl。

本发明在具体实施时，在以上数据中采用了最优的数据进行，由于本身范围较小，固没有提供其他数据，具体如下。

柱温为50℃。鞘气流速为55arb，辅助气流速为40arb，气帘气流速为5arb，喷雾电压为4kv，离子源温度为65℃，毛细管温度为375℃，加热温度为375℃。

质谱测定条件如下：

一级扫描方式：全扫描模式下，分辨率为17500fwhm，自动增益控制的目标值设定为8.0×10⁶。全扫描的电喷雾正电离模式有[m+nh4]⁺、[m+h]⁺、[m+na]⁺，以及电喷雾负电离模式有[m-h]^-、[m-hcoo]^-、[m-ch3coo]^-。

二级扫描模式为可变的数据非依赖采集，英文名称为variabledataindependentacquisition，简写为vdia，扫描时间为0min～15min，分辨率采用17500fwhm，最大注入时间为110ms，自动增益控制的目标值设为6.0×10⁶，信息列表(即m/z)可划分为：112.00000，137.00000，162.00000，187.00000，212.00000，237.00000，262.00000，287.00000，312.00000，337.00000，362.00000，387.00000,412.00000,437.00000,462.00000,487.00000,550.00000,650.00000,750.00000,850.00000其中m/z＝112.00000～487.00000设为第一个vdia扫描，隔离窗口范围设为25.0da，循环计数设定为16个，m/z＝550.00000～850.00000设定为第二个vdia扫描，隔离窗口范围设为100.0da，循环计数设定为4个。碰撞能量分别为17.0ev，35.0ev，52.0ev。

步骤3，6类抗生素、抗生素代谢产物的标准物质数据库的建立：

步骤3a，先配置以下物质的标准溶液：

磺胺类抗生素，具体为磺胺醋酰和它的代谢产物n4-磺胺醋酰，磺胺甲噻二唑和它的代谢产物n4-ac磺胺甲噻二唑；

四环素类抗生素，具体为四环素，土霉素和它的代谢产物盐酸土霉素；

大环内酯类抗生素，具体为红霉素、克拉霉素和罗红霉素；

喹诺酮类抗生素，具体为依诺沙星、氧氟沙星和诺氟沙星；

苯丙咪唑类抗生素，具体为奥芬达唑，噻苯咪唑和它的代谢产物5-羟基噻苯眯唑；

β-内酰胺类抗生素，具体为青霉素g和氨苄青霉素。

以上为羊肉中需要检测的抗生素，其他的抗生素目前在羊肉中的含量在安全值以下或者不涉及。

将标准溶液逐级稀释配制成浓度为600μg/l的标准溶液，具体是根据在不同溶剂(正己烷、丙酮和乙腈)中溶解度及测定需要进行配制，用于标准数据库的采集，使化合物的分子离子峰响应强度大于1.0×10⁸，若响应较低，则需要提高标准物质溶液的浓度至900μg/l。

步骤3b，分别取500μl标准溶液与500μl0.2m乙酸铵溶液，这样以1：1(v/v)对提取液进行稀释，运用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱建立标准物质数据库，色谱-质谱的测定条件仅二级扫描方式不同于稀释后的提取液，二级扫描方式为数据依赖扫描模式，标准物质数据库包括全扫描质荷比、二级特征碎裂片段质荷比、色谱保留时间，进一步可得到分子式、cas号。每种标准溶液平均进样12次，以确保数据的准确性与重现性。

具体先应用exactfinder2.5软件进行对色谱峰进行提取，之后对一级质谱图与二级质谱图进行识别，再使用xcalibur3.0软件的qualbrowser选取与理论值比偏小的全扫描质荷比，差值在0.001～0.002，最后使用massfrontier7.0软件，选取1至4个有响应值且有特征性的碎裂片段，根据元素的组成将碎裂片段质荷比的实测值转换为级特征碎裂片段的理论值。

本发明具体通过对碎裂途径及机理研究得到二级特征碎裂片段，将二级特征碎裂片段应用于抗生素及其代谢产物检测中，从而建立非定向检测方法

(1)碎裂途径与机理研究以及得到二级特征碎裂片段

本发明对6大类18种抗生素及其代谢产物的碎裂途径进行解析，得到了所有二级特征碎裂片段的反应途径，包括磺胺类抗生素(磺胺醋酰、n4-磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、n4-ac磺胺甲噻二唑)，四环素类抗生素(四环素、土霉素、盐酸土霉素)，大环内酯类抗生素(红霉素、克拉霉素、罗红霉素)，喹诺酮类抗生素(依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)，苯丙咪唑类抗生素(奥芬达唑、噻苯咪唑、5-羟基噻苯眯唑)，β-内酰胺类抗生素(青霉素g、氨苄青霉素)。表1列出了6大类抗生素的特征碎裂结构及准确的质荷比。

表16类抗生素的二级特征碎裂片段的结构及准确的质荷比

磺胺类抗生素的活性基团为对氨基苯磺酰胺结构，对氨基苯磺酰胺结构与氨苯甲酸结构相似，因而可与氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，抑制二氢叶酸的合成，进而影响细菌的嘧啶和嘌呤核苷酸的形成，阻碍细菌生长繁殖。对氨基苯磺酰胺结构质谱碎片为c6h6no2s⁺(m/z156.01138)。磺胺类抗生素特征碎裂途径如图1所示。

四环素类抗生素的功能基团为并四苯基本骨架结构，并四苯基本骨架结构与细菌的核蛋白体的30s亚单位结合，阻碍酰胺基转运rna到达a位，抑制核蛋白体与核糖结合。并四苯基本骨架结构质谱碎片为c19h13o6⁺(m/z337.07066)。

大环内酯类抗生素为糖衍生物与大环内酯基团以糖苷键相连成的抗生素，大环内酯结构通过与细菌核糖体50s亚基23srrna结合，抑制信使rna位移与转肽作用，从而阻碍相应的蛋白质合成。大环内酯基团结构质谱碎片为c5h7o⁺(m/z83.04914)。

喹诺酮类抗生素的功能基团为氮(杂)双并环结构，氮(杂)双并环结构通过抑制脱氧核糖核苷酸回旋酶活性，使双股脱氧核糖核酸无法扭曲称为超螺旋结构，阻止细菌细胞分裂。氮(杂)双并环结构质谱碎片为c4h10n⁺(m/z72.08078)。

苯丙咪唑类抗生素的功能基团为苯丙咪唑结构，苯丙咪唑结构通过选择性阻碍真菌细胞色素依赖性的去甲基酶活性，使甲基固醇蓄积，抑制细胞膜麦角固醇合成，从而导致细胞膜通透性改变，真菌细胞内物质流失而死亡。苯丙咪唑结构质谱碎片为c4h8n⁺(m/z70.06513)。

β-内酰胺类抗生素活性结构为β-内酰胺环，β-内酰胺环结构与青霉素结合蛋白结合，阻碍细菌细胞壁粘肽合成酶活性，造成细胞壁缺损，细菌最终膨胀裂解，β-内酰胺类结构质谱碎片为c5h10no2⁺(m/z116.07060)。

步骤4，非定向检测方法具体步骤为：

本发明将二级特征碎裂片段与标准抗生素及其代谢产物的标准物质数据库相结合用于羊肉中抗生素及其代谢产物的检测中，具体采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱下的全扫描模式，运用抗生素及其代谢产物二级特征碎裂片段及全扫描质荷比对色谱图进行峰提取，若捕获到未出现在抗生素及其代谢产物标准信息谱库且呈正态分布的色谱峰，即可判断该物质归属的类别，继而对该色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段进行分析，从而推断出该物质的元素组成，将该物质推断的色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段与标准物质数据库中色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段，以及碎裂途径进行比对，判断该化合物的分子式与结构式，完成对色谱峰与对应抗生素、抗生素代谢产物的一一对应，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定与定量。分析物浓度由羊肉中抗生素、抗生素代谢产物与标准分析物的峰面积比乘标准分析物浓度计算可得。用如下公式得到羊肉中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度，完成对羊肉中抗生素、抗生素代谢产物的检测；

ci＝(c0v)/m，其中ci为羊肉中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度，单位为μg/kg，c0为提取液中每个抗生素、抗生素代谢产物的浓度，单位为μg/l，v为提取液的体积，单位为l，m为羊肉的质量，单位为kg。例如，在检测羊肉样品时，运用抗生素及其代谢产物特征碎裂片段c6h6no2s⁺(m/z156.01138)，提取出呈正态分布且在标准信息库中没有的色谱峰，初步判断该物质为磺胺类抗生素，通过色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征碎裂片段推断该物质分子式为cxhynozs，将丰度较高的片段的碎裂途径与磺胺类抗生素标准信息库的其他化合物碎裂途径对比，发现该未知化合物与磺胺醋酰及n4-ac磺胺甲噻二唑的碎裂片段碎裂机理相似，通过对谱图比标准物质比对分析，判断该化合物为磺胺甲基异恶唑，磺胺甲基异恶唑浓度由羊肉中磺胺甲基异恶唑与标准分析物的峰面积比乘标准分析物浓度计算可得，其定量结果为53.1μg/kg。从而实现抗生素及其代谢物的高通量定性定量分析。

步骤5，方法学参数考察

配制抗生素及其代谢产物基质匹配标准物质溶液，浓度分别为1μg/kg、6μg/kg、11μg/kg、16μg/kg、25μg/kg、40μg/kg、65μg/kg、80μg/kg、150μg/kg、300μg/kg。标准化合物校准曲线：横坐标x表示标准化合物浓度，浓度单位为μg/kg，纵坐标y表示抗生素及其代谢产物峰面积。结论表明，本发明中抗生素及其代谢产物在各自相应的浓度范围内，相关系数均大于0.99。

通过检测容量(ccβ)和确定限(ccα)考察检测限及定量下限。检测容量和确定限如表2所示，分别为0.05μg/kg～0.33μg/kg与0.02μg/kg～0.32μg/kg。通过回收率评价价发明的准确性，通过在羊肉样品中添加ccβ，2倍ccβ和4倍ccβ不同浓度水平的抗生素及其代谢产物的混合标准物质溶液，运用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱检测，计算抗生素及其代谢产物的平均回收率与相对标准偏差，如表3所示，最高的平均回收率与相对标准偏差结果分别为89％～110％和4.3％～7％，本方法的准确性和精密度良好。

表2方法的线性范围、相关系数、检测容量和确定限

表3方法的ccβ，2倍ccβ和4倍ccβ三个浓度水平的相对标准偏差与平均回收率

实际样品检测

采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱法检测231个批次羊肉中抗生素及其代谢产物。结果表明，本方法可用于羊肉中抗生素及其代谢产物的快速检测。结果表明抗生素及其代谢产物在各自相应的浓度范围内，相关系数r²均大于0.99。该方法确定限和检测容量分别为0.003μg/kg～569μg/kg与0.09μg/kg～435μg/kg，平均回收率与相对标准偏差结果分别为0.6％～7.6％和89％～121％。该分析方法具有分析速度快、简便、精密度及准确度高的特点，可较好地实现于羊肉中抗生素及其代谢产物的测定。

另外，本发明的上述实施方式为实施例，具有与本发明的权利要求书的技术思想使之相同的方法并发挥相同作用效果的技术方案，均包含在本发明内。